Knocking-down och Knocking-out gener

Gene Knocking-down
denna teknik möjliggör minskning av uttrycket av en eller flera av anorganism. Detta kan ske genom genetisk modifiering eller genom behandling med areagent såsom en kort DNA-eller RNA-oligonukleotid som har en sekvenskomplementär till antingen gen eller ett mRNA-transkript.
om förändringen i genuttryck orsakas av en oligonukleotid som bindertill ett mRNA eller tillfälligt binder till en gen, leder detta till entillfällig förändring i genuttryck som inte modifierar det kromosomala DNA,och resultatet kallas en ”övergående knockdown”.
i en övergående knockdown orsakar bindningen av denna oligonukleotid till activegen eller dess transkript minskat uttryck. Bindning kan ske genomblockeringen av transkription, nedbrytningen av mRNA-transkriptet (t. ex. siRNA eller RNAs-H-beroende antisense), eller genom blockering avantingen mRNA-översättning, pre-mRNA-skarvningsställen eller nukleas-klyvningsiter som används för mognad av andra funktionella RNA, inklusive miRNA (e.g.by morpholino oligos).
den mest direkta användningen av övergående knockdowns är för att lära sig om en gen somhar sekvenserats, men har en okänd funktion. Detta experimentellatillvägagångssätt är känt som omvänd genetik. Övergående knockdowns används oftai utvecklingsbiologi eftersom oligos kan injiceras iencelliga zygoter och kommer att vara närvarande i dottercellerna i den injicerade cellen.

RNA-interferens (RNAi) är ett sätt att tysta gener genom mRNA-nedbrytning. Gen knockdownmed denna metod uppnås genom att införa små dubbelsträngade interferingRNAs (siRNA) i cytoplasman. En gång introducerad i cellen, exogenirnas bearbetas av RISC. SiRNA kompletterar targetmRNA som ska tystas, och RISC använder siRNA som en mall för att lokalisera thetarget mRNA. Efter att RISC lokaliserats till målet mRNA klyvs RNA avett ribonukleas.
RNAi används för genetisk funktionell analys. Användningen av RNAi kan vara användbar för att identifiera potentiella terapeutiska mål, läkemedelsutveckling eller andra tillämpningar.

Gene Knock-out
Geneknockout (KO) är en genetisk teknik där en av en organisms gener görs inoperativ. Knockout organismer används för att studera genfunktion, vanligtvisgenom att undersöka effekten av genförlust. Heterozygot och homozygot Kos: i den förra slås endast en allel ut, i den senare slås båda de två allelerna ut.

den riktade skapandet av en KO börjar i provröret med en plasmid,en bakteriell artificiell kromosom eller annan DNA-konstruktion, ochfortsätter till cellodling. Celler transfekteras med Dnakonstruktionen. Ofta är målet att skapa ett transgent djur som harändrad gen.
om så är fallet transformeras embryonala stamceller genetiskt och sätts in i tidiga embryon. Resulterande djur med den genetiska förändringen i deras bakterieceller kan då ofta överföra genknockouten till framtidsgenerationer.

konstruktionen är konstruerad för att rekombinera med målgenen, vilket görs genom att inkorporera sekvenser från själva genen till konstruktionen.Rekombination sker sedan i regionen av den sekvensen i genen, vilket resulterar i införandet av en främmande sekvens för att störa genen.
en villkorlig knockout tillåter genradering på ett vävnads-eller tidsspecifikt sätt. Detta görs genom att införa loxP-platser runt genen. Dessa sekvenser kommer att införas i groddlinjen via samma mekanism som aknock-out. Denna bakterielinje kan sedan korsas till en annan bakterieinnehållande Cre-rekombinas som är ett viralt enzym som kan känna igen dessa sekvenser, rekombinerar dem och raderar genen flankerad av dessa platser.
eftersom DNA-rekombination är en sällsynt händelse, innehåller den utländska sekvensen som valts förinsättning vanligtvis en reporter. Detta möjliggör enkelt val av celler eller individer där knockout lyckades. Ibland sätter DNAconstruct in i en kromosom utan önskad homologrekombination med målgenen.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
det är en teknik genom vilken uttrycket av en gen reduceras. Denna reduktionkan bero på en DNA-modifiering eller från en oligonukleotidbindning antingen till mRNA eller till genen. I detta fall är uttrycksförändringen tillfällig, så viprata om övergående knockdown.
en av de tekniker som möjliggör övergående knockdown av en gen beståri användningen av Morfolino oligomerer. De har blivit ett standard knockdown-verktygi djur embryonala system, så Morfolinooligos används ofta för att undersöka rollen för ett specifikt mRNA-transkript iett embryo. Dess molekylära struktur har DNA-baser kopplade till en ryggrad avmetylenemorfolinringar kopplade genom fosforodiamidatgrupper. Morpholinos blockerar åtkomst av andra molekyler till små (~25 bas) specifika sekvenser av basparningsytorna av ribonukleinsyra (RNA). Eftersomav deras helt onaturliga ryggrad känns inte Morpholinos igen avcellulära proteiner. Nukleaser bryter inte ner Morfolinos, och de bryts inte heller ner i serum eller i celler. Det finns inga publicerade rapporter om Morpholinos som aktiverar tollliknande receptorer eller medfödda immunsvar såsom interferoninduktion eller NF-kB-medierad inflammationssvar.Morpholinos är inte kända för att modifiera DNA-metylering.
Morpholinos utlöser inte nedbrytningen av deras mål-RNA-molekyler,till skillnad från många antisensstrukturtyper (t.ex. fosfortioater, siRNA). Istället Morfolinosact genom” sterisk blockering”, bindning till en målsekvens inom ett RNA,hämmande molekyler som annars kan interagera med RNA.
Morpholinos kan också modifiera splicing av pre-mRNA eller inhibera dematurering och aktivitet av miRNA.
Blockeringstranslation
bundet till 5′ – untranslatedregion av messenger RNA (mRNA), Morpholinos kan interferera medprogression av det ribosomala initieringskomplexet från 5 ’ – locket till startkodon. Detta förhindrar översättning av kodningsområdet för det riktade transkriptet (kallat ”knocking down”geneexpression). Detta är användbart experimentellt när en undersökare vill veta funktionen hos ett visst protein; Morpholinos ger ett praktiskt sätt att slå ner proteinets uttryck och lära sig hur den knockdown förändrar cellerna eller organismen.
modifiera pre-mRNA-skarvning
Morfolinoskan störa pre-mRNA-bearbetningssteg antingen genom att förhindrasplice-directing små nukleära ribonukleoproteiner (snRNP) komplex från bindning till sina mål vid gränserna för introner på en sträng av pre-mRNA, eller genom att blockera den nukleofila adeninbasen och förhindra att den bildar skarv lariatstrukturen, eller genom att störa bindningen av skarvreglerande proteinersåsom skarvljuddämpare och skarvförstärkare. Att förhindra bindning av snRNP U1 (vid givarstället) eller U2/U5 (vid polypyrimidindelen och acceptorplatsen) kan orsakamodifierad skarvning, vanligtvis exklusive exoner frånmogen mRNA. Inriktning vissa skarv mål resulterar i intron inneslutningar, whileactivation av kryptiska skarv platser kan leda till partiella inneslutningar eller undantag.Mål för U11 / U12 snRNPs kan också blockeras. Splice modifiering kan varabekvämt analyserad av omvänd transkriptas polymeraskedjereaktion (RT-PCR)och ses som ett bandskifte efter gelelektrofores av RT-PCR-produkter.
KNOCKOUT
en variation av den traditionella gen knockout är den villkorliga gen knockout.
villkorlig genknockout är en teknik som används för att eliminera enspecifik gen i en viss vävnad, såsom levern. Denna teknik är användbaratt studera enskilda geners roll i levande organismer. Det skiljer sig fråntraditionell genknockout eftersom den riktar sig mot specifika gener vid specifika tidersnarare än att raderas från början av livet. Genom att använda den villkorliga geneknockout-tekniken elimineras många av biverkningarna från traditionell genknockout. I traditionell genknockout kan embryonal död från en genmutation inträffa, och detta förhindrar forskare från att studera genen ivuxna. Vissa vävnader kan inte studeras ordentligt isolerat, så genen måstevara inaktiv i en viss vävnad medan den förblir aktiv i andra. Med dettateknik kan forskare knockout gener på ett visst stadium iutveckling och studera hur knockout av en gen i en vävnad påverkar sammagen i andra vävnader.
den vanligaste tekniken är Cre-loxrecombination-systemet. Cre-rekombinasenzymet känner specifikt igen twolox (loci för rekombination) platser inom DNA och orsakar rekombination mellan dem. Denna rekombination kommer att orsaka en radering eller inversionav generna mellan de två lox-platserna, beroende på deras orientering. Anentire-genen kan avlägsnas eller inaktiveras. Hela detta system är inducerbart så achemiskt kan läggas till för att slå ut gener vid en viss tidpunkt. Två av de mestvanligt använda kemikalierna är tetracyklin, som aktiverar transkription avcre rekombinasgen och tamoxifen, som aktiverar transport av Crerekombinasproteinet till kärnan. Endast ett fåtal celltyper uttrycker Crerekombinas och inga däggdjursceller uttrycker det så det finns ingen risk för oavsiktlig aktivering av lox-platser vid användning av villkorad genknockout hos däggdjur.
en mus som innehåller Cre-genen och en mus som innehållerloxp-sekvenserna föds upp för att generera en villkorlig knockout för en vissgene av intresse. Mössen uttrycker inte naturligt Cre-rekombinas eller loxsites men de har konstruerats för att uttrycka dessa genprodukter för att skapa den önskvärda avkomman. Du måste få en mus där en viktig exon floxas (det betyder att den har aLox-P uppströms och nedströms) och en mus som har en Cre-sekvens vars uttryck regleras av en celltypspecifik promotor eller en inducerbar promotor. Sedan korsar du dessa möss och du får en mus där cellerna som inte uttrycker Cre kommer att ha genen med en normal funktion, medan cellerna som uttrycker Cre kommer att ha en genfunktion störd idelen mellan Lox-P.
(Francesca Luca)

RNA-interferensmekanism

RNA-interferensen (RNAi), anancient cellular antiviral response, är en naturlig mekanism för att tysta geneexpression. Det kan utnyttjas för att tillåta specifik inhibering av funktionen hos anytarget-genen. RNAi har visat sig vara ett ovärderligt forskningsverktyg, det hjälper till att identifiera nya gener som är involverade i sjukdomsprocesser.

RNAi är inte den enda mekanismen förtystnad genuttryck (tabell 1).

Tabell 1: jämförelse mellan olika metoder för gentystning.

RNA-interferens (RNAi) uppstår som svar på införandet av dubbelsträngat RNA (dsRNA)i en cell. DsRNA-introduktionen utlöser aktiveringen avdsrna-beroende proteinkinas-R (PKR). Aktiverade PKR-fosforylerar överföringsinitieringsfaktorn EIF2: denna effekt, i samband med aktivering av RNAs-L och induktion av interferonproduktion, stoppar proteinsyntesen och främjar apoptos. Sammantaget antas detta representera en antiviralförsvarsmekanism. Rnaiär en mycket bevarad mekanism i hela taxonomiska arter . Förutom att ha en antiviral aktivitet tros RNAi också undertrycka uttrycket avPotentiellt skadliga segment av genomet, såsom transposoner, som kanske destabiliserar genomet genom att fungera som infogningsmutagener.

även om dess mekanismerär inte helt klarlagda, RNAi representerar resultatet av en flerstegsprocess(Figur 1). När de kommer in i cellen är långa dsrnaförst bearbetas av RNAs III-enzymet Dicer. Denna funktionella dimer innehållerhelikas -, dsRNA-bindande och PAZ-domäner (deras roller är inte heltluciderade). Dicer producerar 21-23 nukleotid-dsRNA-fragment med tvånukleotid 3′ ändöverhäng, dvs siRNAs. RNAi medieras av det RNA-inducerade silenskomplexet (RISC) som, styrt av siRNA, känner igen mRNA innehållande asekvens homolog med siRNA och klyver mRNA på en plats som är lokaliseradungefär i mitten av den homologa regionen. Således är genuttryckspecifikt inaktiverad på en post-transkriptionsnivå.

I C. elegans, Dicer har visatsatt interagera med rde-proteiner. Rde-proteinerna binder till långt dsRNA och är övertygade om att presentera det långa dsRNA till Dicer för bearbetning. Mutanter som visaren hög grad av resistens mot RNAi har rapporterats ha mutationer atrde-1 och rde-4 loci.

Figur 1: mekanism för RNAinterference

utseendet av dubbeltranded (ds) RNA i en cell (t. ex. som en följd av virusinfektion)utlöser ett komplext svar, vilket inkluderar bland andra fenomen (t. ex.interferonproduktion och dess konsekvenser) en kaskad av molekylära händelser kändasom RNAi. Under RNAi binder det cellulära enzymet Dicer till dsRNA och klyversit i korta bitar av ~ 20 nukleotidpar i längd som kallas smallinterfering RNA (siRNA). Dessa RNA-par binder till det cellulära enzymet som kallas drna-inducerat ljuddämpningskomplex (RISC) som använder en sträng av siRNA för att binda till enkelsträngade RNA-molekyler (dvs. mRNA) av komplementär sekvens. Denukleasaktivitet av RISC försämrar sedan mRNA, vilket tystar uttryck avviralgenen. På samma sätt antas cellens genetiska maskineri att toutilisera RNAi för att kontrollera uttrycket av endogent mRNA, vilket lägger till ett nytt lager av post-transciptionell reglering. RNAi kan utnyttjas iexperimentella inställningar för att slå ner målgener av intresse med en högspecifik och relativt enkel teknik (se text för mer information).

förutom genesilencing kan RNAi vara involverad i andra fenomen av genreglering.. Det verkar som om RNAi också kan fungera genom metylering av cytosiner såväl som Cpgsekvenser som är mer klassiskt associerade med metylering. Om målsekvensendelar homologi med en promotor, transkriptionell tystnad kan uppstå viametylering. Dessutom verkar RNA interagera med kromatindomäner, vilketkan i slutändan direkt DNA-metylering. Studier av C. elegans har visat attrnai kan spridas bland celler genom mekanismer som kanske inte hänger på siRNA.Den systemiska RNA-interferensbrist (sid) locus, sid-1, kodar för ett konservativt protein med en signalpeptidsekvens och 11 förmodade transmembrandomäner,vilket tyder på att sid-1-proteinet kan fungera som en kanal för lång dsRNA, siRNA eller en för närvarande oupptäckt RNAi-relaterad signal. Sid-1 mutanter retaincell-autonoma RNAi men misslyckas med att visa spridning av RNAi. Det förblir oklart om denna systemiska RNAi förekommer hos däggdjur, även om en stark likhet rapporteras mellan sid-1 och förutsagda humana och musproteiner.

(Justine Floret)

källa : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang=” sv-gb ” xml:lang= ”sv-gb”>

ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

dessa tre molekylära tekniker gör det möjligt att redigera genomet på ett platsspecifikt sätt, varje teknik med en annan mekanism. Zinkfingernukleaser (ZFNs) och transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALENs) är chimära nukleaser som består av programmerbara, sekvensspecifika DNA-bindande moduler kopplade till en icke-specifik DNA-klyvningsdomän. ZFNs och TALENs möjliggör ett brett spektrum av genetiska modifieringar genom att inducera DNA-dubbelsträngsbrott som stimulerar felbenägen icke-homolog slutförening eller homologistyrd reparation vid specifika genomiska platser.

bild tagen från http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

mångsidigheten hos ZFNs och TALENs härrör från förmågan att anpassa den DNA-bindande domänen för att känna igen praktiskt taget vilken sekvens som helst. Dessa DNA-bindande moduler kan kombineras med många effektordomäner för att påverka genomisk struktur och funktion, inklusive nukleaser, transkriptionsaktivatorer och repressorer, rekombinaser, transposaser, DNA-histonmetyltransferaser och histonacetyltransferaser. Således beror förmågan att framgångsrikt utföra genetiska förändringar till stor del på DNA-bindande specificitet och affinitet hos utformade zinkfinger-och TALE-proteiner.

Cys2-His2 zinkfingerproteiner

cys2-His2 zinkfingerdomänen är bland de vanligaste typerna av DNA-bindande motiv som finns i eukaryoter och representerar den näst mest kodade proteindomänen i det mänskliga genomet. Ett individuellt zinkfinger består av cirka 30 aminosyror i en konserverad Macau-konfiguration. Flera aminosyror på ytan av den nya spiralen kommer vanligtvis i kontakt med tre baspar i DNA: s huvudspår, med varierande nivåer av selektivitet. Den modulära strukturen av zinkfingerproteiner har gjort dem till en attraktiv ram för utformningen av anpassade DNA-bindande proteiner. Nyckeln till tillämpningen av zinkfingerproteiner för specifikt DNA-erkännande var utvecklingen av onaturliga matriser som innehåller mer än tre zinkfingerdomäner. Detta framsteg underlättades av den strukturbaserade upptäckten av en mycket konserverad länksekvens som möjliggjorde konstruktion av syntetiska zinkfingerproteiner som kände igen DNA-sekvenser 9 till 18 bps i längd. Eftersom 18 bps av DNA-sekvens kan ge specificitet inom 68 miljarder BP av DNA, tillät denna metod specifika sekvenser att riktas in i det mänskliga genomet för första gången.

Transkriptionsaktivatorliknande effektorer

TALEs är naturligt förekommande proteiner från växtpatogena bakterier släktet Xanthomonas, och innehåller DNA-bindande domäner som består av en serie av 33-35 aminosyrarepetitionsdomäner som var och en känner igen ett enda bp. TALE specificitet bestäms av två hypervariabla aminosyror som är kända som repeat-variable diresidues (RVD) . Liksom zinkfingrar kopplas modulära TALUPPREPNINGAR samman för att känna igen sammanhängande DNA-sekvenser. Men i motsats till zinkfingerproteiner fanns det ingen omkonstruktion av kopplingen mellan upprepningar som var nödvändiga för att konstruera långa arrayer av berättelser med förmågan att teoretiskt adressera enskilda platser i genomet. Förutom deras roll för att underlätta HDR (homolog direkt rekombination) tillåter platsspecifika nukleaser också snabb generering av cellinjer och organismer med nollfenotyper; Nhej-medierad reparation av en nukleasinducerad DSB leder till införandet av små insatser eller borttagningar på det riktade stället, vilket resulterar i knockout av genfunktion via ramförskjutningsmutationer.

bild tagen från http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

distinkt från de platsspecifika nukleaserna som beskrivs ovan, CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associated (CAS) system har nyligen dykt upp som ett potentiellt lätt och effektivt alternativ till ZFNs och TALENs för att inducera riktade genetiska förändringar. I bakterier ger CRISPR-systemet förvärvad immunitet mot invaderande främmande DNA via RNA-styrd DNA-klyvning. I typ II CRISPR / Cas-systemet är korta segment av främmande DNA, benämnda ”distanser” integrerade i CRISPR genomic loci och transkriberas och bearbetas till kort CRISPR RNA (crRNAs). Dessa crrna glödgas till trans-aktiverande crrna (tracrrna) och direkt sekvensspecifik klyvning och tystnad av patogent DNA av Cas-proteiner. Nyligen arbete har visat att måligenkänning av Cas9-proteinet kräver en” frö ” -sekvens inom crRNA och en konserverad dinukleotidinnehållande protospacer intilliggande motiv (PAM) – sekvens uppströms crRNA-bindande region. CRISPR / Cas-systemet kan därmed riktas om för att klyva praktiskt taget vilken DNA-sekvens som helst genom att omforma crRNA. Signifikant har CRISPR / Cas-systemet visat sig vara direkt bärbart till humana celler genom samleverans av plasmider som uttrycker Cas9-endonukleas och de nödvändiga crRNA-komponenterna.

bild tagen från https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php