1. Kras exon 2 (kodon 12/13) och exon 3 (kodon 61) mutationstestning: cobas 2 kras Mutationstest för in Vitro-diagnostisk användning (Roche).
cobas cras mutationstest är ett realtids-PCR-test för kvalitativ detektion av somatiska mutationer i exon 2 (kodon 12/13) och exon 3 (kodon 61) av KRAS-genen med användning av en DNA-ingång på 100 ng. Testet kan upptäcka 19 kras-mutationer. Närvaron av mutationer detekteras med en analytisk specificitet på minst 99% och en detektionsgräns på minst 5% mutantnivå i en bakgrund av genomiskt DNA av vildtyp.
Cobas 2 cras Mutationstest är baserat på två huvudprocesser: (1) Manuell provberedning för att erhålla genomiskt DNA från en eller två 5 kg tjocka sektioner av FFPE CRC-vävnad innehållande minst 10% tumörceller; (2) PCR-amplifiering av mål-DNA med komplementära primerpar och två oligonukleotidprober märkta med fluorescerande färgämne. De primerpar som används definierar en 85 basparsekvens för exon 2 innehållande KRAS-kodoner 12 och 13 och en 75 basparsekvens för exon 3 innehållande KRAS-kodon 61 i humant genomiskt DNA. En sond är utformad för att detektera kras-kodon 12/13-sekvensen i exon 2, och den andra sonden är utformad för att detektera kras-kodon 61-sekvensen i exon 3 av KRAS-genen. Mutationsdetektering uppnås genom smältkurvanalys av Cobas z 480-analysatorn (1).
2. KRAS Mutationstest v2 (LSR)
KRAS Mutationstest v2 (LSR) är ett allelspecifikt PCR-test i realtid för kvalitativ detektion och identifiering av exon 2 -, 3-och 4-mutationer i v-Ki-ras2 Kirsten rått sarkom viral onkogenhomolog (KRAS) gen från formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad (FFPET). Testet är utformat för att detektera 28 unika mutationer. Närvaron av mutationer detekteras med en analytisk specificitet på minst 99% och en detektionsgräns på minst 1% mutantnivå i en bakgrund av genomiskt DNA av vildtyp.
KRAS-Mutationstestet v2 (LSR) är baserat på två processer: (1) Manuell provberedning för att erhålla genomiskt DNA från FFPET; och (2) PCR-amplifiering och detektion av mål-DNA med komplementära primerpar och oligonukleotidprober märkta med fluorescerande färgämnen.
KRAS Mutationstest v2 (LSR) använder primers som definierar specifika basparsekvenser för var och en av de riktade mutationerna. Amplifiering sker endast i regionerna av KRAS-genen mellan primrarna; hela genen förstärks inte. De riktade KRAS-sekvenserna sträcker sig från 79 – 114 baspar. Mutationsdetektering uppnås genom PCR-analys med Cobas z 480-analysatorn. (1)
3. BRAF / NRAS Mutation Test (LSR)
BRAF/NRAS Mutation Test (LSR) är ett allelspecifikt, realtids-PCR-test för kvalitativ detektion och identifiering av exon 11 och 15 mutationer i proto-onkogen B-Raf (BRAF)-genen och exon 2, 3 och 4 mutationer i neuroblastoma RAS viral onkogen homolog (NRAS) gen från formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad (FFPET).
testet är utformat för att detektera 36 unika mutationer. Närvaron av mutationer detekteras med en analytisk specificitet på minst 99% och en detektionsgräns på minst 5% mutantnivå i en bakgrund av genomiskt DNA av vildtyp.
BRAF / NRAS-Mutationstestet (LSR) är baserat på två huvudprocesser: (1) Manuell provberedning för att erhålla genomiskt DNA från FFPET; och (2) PCR-amplifiering och detektion av mål-DNA med komplementära primerpar och oligonukleotidprober märkta med fluorescerande färgämnen.
BRAF / NRAS-Mutationstestet (LSR) använder primers som definierar specifika basparsekvenser för var och en av de riktade mutationerna. Amplifiering sker endast i regionerna i BRAF-eller NRAS-generna mellan primrarna; hela genen förstärks inte. BRAF-sekvenser sträcker sig från 101 – 120 baspar. NRAS-sekvenser sträcker sig från 94-121 baspar. Mutationsdetektering uppnås genom PCR-analys med Cobas z 480-analysatorn. (2)
klinisk implikation
KRAS och NRAS är nära besläktade RAS-onkogenfamiljer, och mutationer i endera genen vid kodon 12, 13 (exon 2), kodon 61 (exon 3) och kodon 146 (exon 4) resulterar i ökade nivåer av guanosintrifosfatbundna RAS-proteiner. Överaktiv RAS-signalering främjar onkogenes. I kolorektalt karcinom (CRC) finns kras-och NRAS-mutationer vid dessa kodoner i upp till 50% av fallen och förutsäger brist på svar på anti-EGFR-terapi. De flesta RAS-mutationer är punktmutationer som förekommer i KRAS exon 2 (kodoner 12 eller 13; cirka 40%). Andra RAS-mutationer är mindre frekventa med de vanligaste mutationerna som förekommer i KRAS exons 3 och 4 och NRAS exons 2 och 3 (3).
cirka 50% av melanomerna har aktiverande mutationer i BRAF. Över 90% av BRAF-mutationer resulterar i en nukleotid 1799 T>en förändring som leder till en valin-till-glutaminsyrasubstitution vid position 600 (V600E). BRAF V600E-mutationen orsakar okontrollerad signalering av MAPK-vägen som leder till överdriven celltillväxt och proliferation. Medel riktade mot aktiverad mutant BRAF (BRAF-hämmare) har visat sig vara framgångsrika hos patienter med metastatiskt melanom som hyser denna mutation (1-3).
förutom dess prediktiva värde i melanom har BRAF V600E-mutationen också prognostiskt värde i kolorektal cancer och i lungcancer (NSCLC) (4,5,7). BRAF V600E-mutationen finns i cirka 10% av metastatisk kolorektal karcinom och har associerats med närvaron av mikrosatellitinstabilitet (6). Sammantaget har patienter med BRAF-mutant CRC låga svarsfrekvenser på konventionella terapier och negativ prognos. Medan BRAF V600-muterade melanom är känsliga för BRAF-hämmare, kan BRAF V600-muterade CRC inte vara lika känsliga. Aktivering av EGFR vid kolorektal cancer kan förklara varför kolorektal cancer i allmänhet har ett lägre svar på BRAF-hämmare. Därför rekommenderas det att initiera kombinationsbehandling med EGFR – och BRAF-hämmare.
BRAF V600E-mutationen finns också i 3-5% av alla lungcancer (7). Medan BRAF-hämmare har visat sig vara framgångsrika hos V600E-mutationspositiva NSCLC-patienter har FDA godkänt användning av kombinationsbehandling med BRAF – och MEK-hämmare för NSCLC-patienter med en V600E-mutation baserat på resultaten från en internationell, multicenter, tre-kohort, icke-randomiserad, icke-jämförande, öppen, studie på patienter med lokalt bekräftad BRAF V600E-mutationspositiv metastatisk NSCLC.
Provkrav
acceptabla prover för analysen är formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsprover i kolorektal karcinom med en fixeringstid på 6-48 timmar.
volym
1 representativt paraffinblock är att föredra. Alternativt krävs för resektionsprover minst 5 ofärgade vävnadssektioner (5 kg tjock) (fullständig RAS-testning).
Förvarings-och transportinstruktioner
behåll och skicka prover vid omgivande temperatur.
begränsningar
otillräckligt tumörinnehåll tillåter kanske inte detektering av KRAS/NRAS/BRAF-mutationer: 10% av tumörcellerna krävs. Tumörinnehållet utvärderas före analys och makrodissektion utförs. Andra fixeringsmedel än formalin eller förlängd fixeringstid kan ge upphov till otillräckliga resultat.
särskilda krav
inga.
vändtid
5 till 7 arbetsdagar för respektive diabilder och paraffinblock.
- Li et al. En mycket verifierad analys för KRAS-Mutationsdetektering i vävnad och Plasma av Lung -, kolorektal-och bukspottkörtelcancer. Arch Pathol Lab Med. 2019 maj;143:183-9
- Patten et al. Ett känsligt och exakt test för samtidig detektering av 36 BRAF-och NRAS-mutationer. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Douillard JY et al. Panitumumab-FOLFOX4-behandling och RAS-mutationer vid kolorektal cancer. N Engl J Med. 2013 September 12; 369 (11): 1023-34.
uppdaterad den 03 December 2019
