Kruppel-liknande faktor 2 (KLF2) reglerar proinflammatorisk aktivering av monocyter

resultat

KLF2-uttrycket reduceras med Monocytaktivering/differentiering i makrofager.

för att bättre förstå KLF2: s roll i regleringen av immunceller såsom monocyt/makrofag utvärderade vi först uttrycket av KLF2 i primära humana monocyter. Såsom visas i Fig. 1 A vänster, KLF2-uttryck är robust i primära humana monocyter och reduceras starkt med differentiering till makrofager efter 5 dagar. KLF2-uttryck i den humana monocytiska cellinjen THP-1 var mycket lägre än i primära humana monocyter. Emellertid reducerades uttrycket ytterligare vid behandling av dessa celler med LPS eller 12-o-tetradekanoylforbol-13-acetat, två medel väl etablerade för att inducera cellulär aktivering eller differentiering (Fig. 1 A Höger).

vi försökte därefter avgöra om KLF2-uttryck regleras i den inflammatoriska inställningen in vivo. Monocytisk aktivering är en viktig patofysiologisk händelse i utvecklingen av ateroskleros, ett kroniskt låggradigt inflammatoriskt tillstånd, så vi resonerade att KLF2-uttryck kan minskas hos dessa patienter (11). Vi undersökte en grupp av 14 åldersmatchade normala försökspersoner och 14 patienter med omfattande ateroskleros (50% av 50% med historia av kranskärlsrevaskularisering) som stratifieras av de lägsta och högsta nivåerna av Finkel–Biskis–Jinkins osteosarkom gen (FOS), vilket har visat sig fungera som en markör för inflammation (12). Såsom visas i Fig. 1 B, KLF2-uttrycket reducerades signifikant med 30% av 30% av patienterna. Däremot observerades ingen signifikant effekt för KLF3, KLF6, KLF11 och KLF13. I överensstämmelse med vår tidigare studie ökade Fos-uttrycket signifikant hos patienter med kranskärlssjukdom (12).

KLF2 hämmar Monocytaktivering och fagocytisk kapacitet.

som svar på inflammatoriska stimuli uttrycker monocyter ökade nivåer av proinflammatoriska faktorer och cytokiner/kemokiner och uppvisar förbättrad fagocytisk kapacitet. För att få insikt i KLF2: s roll i monocytfunktionen genomförde vi överuttrycksstudier. THP-1-celler infekterades med antingen kontroll tomt virus (EV) eller KLF2 (Ad-KLF2) för 24-48 h och stimulerades sedan med LPS för 2 och 6 h. såsom visas i Fig. 2 A, behandling av ev-infekterade celler med LPS (25 ng/ml) resulterade i en robust induktion av cyklooxygenas (COX)-2, vävnadsfaktor och monocyt kemoattraktantprotein (MCP)-1 mRNA. Däremot dämpades denna induktion markant i KLF2-infekterade celler (Fig. 2 A). Liknande effekter observerades också i musmonocytcellinjen J774a (data visas inte). Vidare inhiberade överuttryck av KLF2 starkt utsöndringen av olika cytokiner och kemokiner. Såsom visas i Fig. 2 B, KLF2-överuttryck dämpade den LPS-medierade induktionen av faktorer som CD40L (med 49,6%), makrofaginflammatoriskt protein 1 kg (48,4%), makrofaginflammatoriskt protein 1 kg (64,2%), IL-1 kg (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-kg (50,2%) och MCP-1 (68,8%). Denna effekt var specifik eftersom ingen signifikant effekt observerades på nivåerna av multipla andra relevanta tillväxtfaktorer (TGF 20, trombocyt-härledd tillväxtfaktor och granulocyt/makrofagkolonistimulerande faktor), cytokiner/kemokiner (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1 1 och IFN-2) eller matrisförändrande enzymer (matrismetalloproteinas typ 1, 2, 3 och 9) (data visas inte).

en klassisk egenskap hos den aktiverade monocyten / makrofagen är fagocytos. För att avgöra om KLF2-överuttryck påverkar monocyternas fagocytiska förmåga överuttryckte vi KLF2 eller kontroll (EV) i THP-1-celler, stimulerade med LPS och bedömde förmågan hos dessa celler att ta upp Texas rödmärkta zymosan a biopartiklar. Såsom visas i Fig. 2 C, kontrollvirusinfekterade celler intog zymosan biopartiklar. Däremot reducerades upptaget av KLF2-Uttryckande monocyter markant (Fig. 2 C). Sammantaget visar dessa data att KLF2 kan hämma monocytsekretion av cytokiner / kemokiner och fagocytos.

KLF2 hämmar inte Monocytrekrytering.

vi försökte därefter bedöma effekten av KLF2 på monocytfunktion in vivo. Som svar på en skada eller en inflammatorisk stimulans rekryteras monocyter från blodomloppet till vävnader. Vi genomförde först studier för att bedöma om monocytrekrytering ändrades av KLF2-uttryck. För att minimera bidraget från andra celltyper använde vi C. B-17-Scid-beige möss som är bristfälliga i T -, B-och naturliga mördarceller. Dessa djur (n = 5 per grupp) utsattes sedan för bestrålning av hela kroppen och rekonstituerades med J774a-celler adenoviralt infekterade med antingen kontrollvirus (EV) eller KLF2 med hjälp av svansveninjektion (beskrivs i material och metoder). Djur utsattes sedan för IP-injektion av tioglykolat (en potent kemisk irriterande som inducerar monocytrekrytering) och antalet GFP-positiva celler bedömdes 48 timmar senare genom flödescytometrisk analys. Såsom visas i Fig. 2 C och D, KLF2 inhiberade inte rekryteringen av GFP+ J774a monocyter till bukhålan. Faktum är att vi reproducerbart observerade att KLF2-transducerade djur uppvisade en signifikant ökning av GFP + – celler. Dessa data tyder på att KLF2 inte hämmar utan snarare förstärker monocytisk rekrytering till en inflammatorisk plats.

KLF2 hämmar Karragenininducerad Inflammation.

efter rekrytering och migration till vävnader utsöndrar monocyter cytokiner, kemokiner och tillväxtfaktorer för att upprätthålla det inflammatoriska svaret. Såsom visas i Fig. 2 B noterade vi att KLF2-överuttryck dämpade utarbetandet av flera cytokiner och kemokiner. För att avgöra om KLF2 påverkar monocytisk proinflammatorisk funktion använde vi en väletablerad modell för inflammation: karragenaninducerad fotpadinjektion. Injektion av denna kemikalie har tidigare visat sig reproducerbart inducera ett inflammatoriskt svar som kännetecknas av tassödem (13-15). C. B-17-Scid-beige möss (n = 4 per grupp) bestrålades som beskrivits ovan, rekonstituerades med kontroll-eller KLF2-Uttryckande J774a-celler och utmanades sedan med karragenininjektion i fotplattan (beskrivs i material och metoder). Tassvolymen bestämdes genom användning av en hydropletismometer modifierad för små volymer (Ugo Basile, Milano). Såsom visas i Fig. 2 F, EV-infekterade djur uppvisade en 17 1,08-mm3 och 23,3 3,05-mm3 ökning av tassvolymen efter 1 respektive 2 h karragenininjektion. Däremot uppvisade djur som rekonstituerats med KLF2-Uttryckande J774a-celler endast en 6,25 0,85-mm3 och 7,5 0,95-mm3 ökning av tassvolymen vid 1 respektive 2 timmar efter karragenininjektion (Fig. 2 F). I överensstämmelse med denna grova effekt avslöjade histologisk analys av tassarna minskad vätskeextravasering, vilket leder till ödembildning (Fig. 2 G, pilar).

effekt av KLF2 Knockdown på inflammatoriskt genuttryck.

för att bestämma vikten av KLF2 i monocytiskt inflammatoriskt genuttryck genomfördes också små interfererande RNA (siRNA)-medierade knockdown-studier. Såsom visas i Fig. 2 H, jämfört med obehandlade (kontroll) och icke-specifika siRNA-behandlade celler, resulterade knockdown av KLF2 (60% knockdown i 2774a-celler i en induktion av inflammatoriska gener såsom MCP-1 och en mer blygsam effekt på COX-2-och vävnadsfaktoruttrycksnivåer. Dessa resultat verifierades också med realtids-PCR-analys (Fig. 2 I).

KLF2 hämmar NF-kB och AP-1-Promotoraktiviteter.

KLF2 kan kraftigt hämma LPS-medierad induktion av MCP-1, COX-2 och vävnadsfaktor (Fig. 2 A). Induktionen av dessa mål genom proinflammatoriska stimuli är känd för att regleras av transkriptionella vägar såsom NF-kB och AP-1. Vi resonerade att KLF2 i princip kan hämma dessa vägar på flera nivåer såsom uttryck, DNA-bindning eller induktion av transkriptionsaktivitet.

vi fokuserade först på NF-kB med tanke på dess centrala roll i inflammation. Överuttryck av KLF2 förändrade inte kärnkraftsackumulering av p65 eller kärnnivåer av IkB-Kinas (IKK) VIII och IKKy (Fig. 3 A). Vidare förändrade KLF2-överuttryck inte kinetiken för IkB-fosforylering eller nedbrytning eller cytoplasmatiska nivåer av IKKa, Ikk-Bronkialoch IKKy (Fig. 3 B). I överensstämmelse med dessa observationer påverkade KLF2 inte NF-kB-bindning till DNA. Såsom visas i Fig. 3 C, behandling av kontrollvirusinfekterade celler (EV) med LPS inducerade ett enda huvudband. Konkurrens-och superskiftstudier verifierade att detta band representerar NF-Xiaomi. Ett nästan identiskt mönster av NF-kB-bindning observerades i KLF2-överuttryckande celler. För att bedöma om KLF2 kan påverka NF-kB-medierad transkriptionsaktivering genomfördes genreporter-analyser. Såsom visas i Fig. 3 D, transfektion av p65 med en NF-kB luciferasreporter plasmidinducerad transkriptionsaktivitet med 11-faldigt. Denna induktion reducerades kraftigt i närvaro av KLF2, vilket indikerar att KLF2 hämmar NF-kB transkriptionsaktivitet. Liknande effekter av KLF2 observerades för AP – 1-vägen (Fig. 5 A-C, som publiceras som stödinformation på PNAS webbplats).

rekrytering av Coactivator CBP-associerad faktor (PCAF) av KLF2 som en förenande mekanism.

tillsammans, resultaten i Fig. 3 indikerar att KLF2 kan hämma NF-kB-medierad transaktivering oberoende av effekter på DNA-bindningen av dessa faktorer. En möjlig mekanism är rekrytering av kritiska koaktivatorer. Till exempel kräver optimal NF-kB-bindning interaktion med flera nyckelkoaktivatorer såsom steroidreceptorkoaktivator (SRC)-1, PCAF och p300/CBP. KLF2 kan interagera med en eller flera av dessa faktorer, rekrytera dem bort från NF-kB och, som följd, minska NF-kB-medierad transkriptionsaktivitet.

för att bestämma rollen för PCAF i KLF2-medierad hämning av NF-kB transkriptionsaktivitet utförde vi cotransfektionsstudier med exogen PCAF. Transfektion av PCAF (men inte p300; data som inte visas) räddade signifikant KLF2-medierad förtryck av NF-kB concatemer (Fig. 4 A). En partiell räddning observerades också på KLF2S förmåga att hämma AP-1 transkriptionsaktivitet (Fig. 5D). För att avgöra om KLF2 och PCAF interagerar med varandra utförde vi GST pull-down och coimmunoprecipitation analyser. Med hjälp av in vitro transkriberade och översatta produkter fann vi att KLF2 och PCAF kan interagera direkt i ett cellfritt system (Fig. 4 B). För att veta om PCAF binder till KLF2 in vivo överuttryckte vi KLF2 (hemagglutinin-taggad) och PCAF (Flaggmärkt) i COS-7-celler. Immunutfällning med en anti-Flaggantikropp följt av Western blotting med en anti-hemagglutininantikropp visade att KLF2 binder med PCAF i celler (Fig. 4 C).

för att avgöra om mekanismerna bakom de observerade effekterna är operativa in vivo genomförde vi kromatin immunoprecipitation (ChIP) studier. Som förväntat ledde LPS-stimulering av THP-1-celler till rekrytering av p65 och PCAF till COX-2-promotorn (Fig. 4 D). Dessutom observerades samtidig acetylering av HH3 och HH4. I samband med KLF2-överuttryck dämpas emellertid PCAF-rekrytering och histonacetylering starkt (Fig. 4 D). I överensstämmelse med våra gel-shift-analyser observerades ingen signifikant effekt av KLF2 vid rekrytering av p65.