diskussion
den observerade produktionen av höga nivåer av proteasaktivitet under kontinuerlig odling av K. sedentarius underlättade reningen av två proteaser, P1 och P2, vilka var aktiva mot azokasein, insulinkedjan av insulin, keratin extraherad från human callus och obearbetad callus. De allmänna egenskaperna hos dessa enzymer inklusive substratområde, optimal temperatur och pH och känslighet för proteashämmare tyder på att de är biokemiskt lika och sannolikt kommer att tillhöra den alkaliska serinproteasfamiljen. Dessa proteaser produceras av en mängd olika mikroorganismer och fungerar som endopeptidaser (Rao et al. 1998).
huruvida enzymerna också kan klassificeras som keratinaser är emellertid fortfarande en fråga om debatt. Keratinaser bör per definition kunna hydrolysera rent nativt keratin. Extraktion av keratin kan emellertid endast uppnås genom tidigare behandling med denatureringsmedel för att separera det från icke‐keratinproteiner. Mekaniska behandlingar såsom kulfräsning resulterar i klyvning av disulfidbindningar, vilket gör proteinet mer mottagligt för proteolytisk digestion av proteaser såsom trypsin och proteinas K, som inte klassificeras som keratinaser (Noval och Nickerson 1959). På samma sätt har användningen av värmesteriliserade substrat i keratinasanalyser också kritiserats eftersom uppvärmning kan orsaka keratindenaturering.
även om finmalt kallus i den aktuella studien användes som ett enzymsubstrat, var odlings supernatantvätska aktiv mot bitar av intakt kallus. Därför, även om de två proteaserna inte är strikt keratinaser, försämrar de mänsklig kallus in vitro och det finns vissa bevis för att detta också inträffar in vivo (Nordstrom et al. 1987).
proteaser har också klassificerats som keratinaser som ett resultat av deras aktivitet på reducerat keratin, i vilket fall reduktionsmedel antingen har tillsatts enzymanalysblandningen eller använts under keratinutvinning. Även om den keratinolytiska aktiviteten hos en rad kutana bakterier har studerats med användning av ’nativt’ keratin som substrat, reduktionsmedlet, ditiotreitol (DTT), inkluderades i analysblandningen. Till exempel, när uppenbar keratinasaktivitet från Staphylococcus epidermidis studerades i frånvaro av DTT, detekterades ingen aktivitet (Mikx och de Jong 1987). På liknande sätt, ett serinproteas från Candida albicans‐nedbrutna keratiner som hade extraherats från stratum corneum av mänskliga sulor med 8 mol l−1 urea i Tris‐HCl och avsugning‐merkaptoetanol (Hattori et al. 1984). I den föreliggande studien, P1 och P2 hydrolyserat keratin som hade extraherats från mänsklig fot callus med urea och sackaros‐merkaptoetanol men, viktigare, kunde också bryta ned obehandlad callus.
stratum corneum och human callus är en komplex och stabil struktur av vilken keratin är en huvudkomponent. Det finns 30 mänskliga gener för keratin varav 18 uttrycks på huden (Fuchs 1995). En sammanfattning av keratindatabasen har visat att varje keratin har potentiella klyvningsställen för proteaserna och Asp‐Arg och Gly‐Arg är de vanligaste. Om keratinfilamenten initialt bryts på dessa platser är det möjligt att gradvis nedbrytning av dessa mindre enheter uppträder vid sekundära klyvningsställen, vilket ger ett storleksintervall av peptidfragment, vilket visas genom analys av proteasattacken på keratiner extraherade från mänsklig kallus. Resultaten presenteras i Fig. 3b indikerar två pH optima för callus-nedbrytande aktivitet av P2. En möjlig förklaring är att det finns två enzymer i provet. Detta verkar osannolikt eftersom enzymprovet som användes var mycket renat, vilket visas av sidan med silverfärgning (se Fig. 1, körfält 6). Möjligheten av två callusnedbrytande enzymer i det renade P2-provet med en mycket liknande rörlighet på sidan kan inte uteslutas. Samma prov testades emellertid med samma buffertar med azokaseinanalysen och endast ett pH-optimalt detekterades vid pH 10·2. En alternativ förklaring är att det komplexa callus-substratet / enzyminteraktionen vid olika pHs är en balans mellan enzymaktivitet och subtila konformationsförändringar av substratet, vilket leder till dubbel pH optima.
denna undersökning har visat att K. sedentarius producerar två extracellulära proteaser som har kallusnedbrytande aktivitet. Grundläggande information om deras relativa molekylstorlekar, deras pi, har bestämts. Konventionella enzymkinetiska studier kunde emellertid inte behandlas eftersom det naturliga substratet som användes i dessa in vitro-experiment var en komplex blandning av polymerer, olösliga i vatten. Den ökade enzymaktiviteten hos P2 i närvaro av 800 mmol 1-1-salt kan vara relevant för mikroorganismernas överlevnad på mänsklig hud, som har en förändrad saltkoncentration beroende på ekkrina körtelaktiviteten bestämd av personens träningshastighet och omgivningstemperaturer. De mekanismer som är involverade i natriumklorideffekten har inte åtgärdats. Det föreslås preliminärt att natriumklorid kan påverka antingen den tertiära strukturen hos enzymet och substratet, eller båda, för att förbättra tillgången till enzymets aktiva plats till substratets specifika klyvningsställen.
den enklaste förklaringen av de observerade resultaten är att i en kultur supernatant av K. sedentarius finns två callusnedbrytande enzymer, serinproteaser, som också solubiliserar humant keratin närvarande i callus. Det är möjligt att K. sedentarius producerar ett proteas, kodat av en gen, och att autokatalytisk eller annan proteasaktivitet producerar två enzymer med olika molekylvikter. Alternativt finns det två gener som kodar för två oberoende och närbesläktade enzymer. Den senare hypotesen stöds av en tidigare studie (Holland et al. 1992). Prover från kontinuerlig odling av K. sedentarius vid steady state vid olika utspädningshastigheter analyserade på sidan, och överlagras med kasein, visade två enzymer, en konstitutiv och den andra detekteras vid höga koncentrationer vid låga utspädningshastigheter. Det är viktigt att det inte upptäcktes vid utspädningshastigheter i närheten av mikhaimax. Bestämning av den N-terminala aminosyrasekvensen av P1 (21 rester) och P2 (15 rester) polypeptider visade att de var helt olika. Detta resultat, tillsammans med informationen från det kontinuerliga odlingsexperimentet, skulle föreslå att enzymerna kodas oberoende.
resultaten av denna undersökning har stärkt hypotesen att specifika proteaser av K. sedentarius kan redogöra för nedbrytningen av callus som är karakteristisk för pitted keratolys. Bevisen hittills tyder också på att två proteaser är inblandade och att de är aktiva vid pH på hudstället, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Tolkningen av resultat erhållna från in vitro-experiment till in vivo-miljön kan ifrågasättas, även om mänsklig callus användes som substrat. Helst bör mänskliga hudbiopsier tas inklusive områden med normal och pitted hud. Närvaron och platsen eller frånvaron av proteaserna kan sedan bestämmas med histologiska tekniker med användning av monoklonala antikroppar som sonder för proteaserna och K. sedentarius. Etiskt godkännande skulle emellertid inte ges för biopsier från den nödvändiga platsen, fotens bärande plats, från ett representativt antal personer. Medverkan av K. sedentarius i urkärnade keratytos genom en mekanism för produktion av proteaser nedbrytande keratin har inte formellt bevisats. Det finns emellertid inga bevis som motbevisar hypoteserna och dess trovärdighet har stärkts av de resultat som presenteras här. Starka in vitro-bevis har presenterats som implicerar K. sedentarius och dess extracellulära callusnedbrytande enzymer i tillståndet pitted keratolys. Vid normal hud pHs och ythydrering kommer produktionen och aktiviteten hos dessa enzymer att vara låg, med P1 som den mer aktiva. Under miljöförhållanden för ocklusion och på dålig hygein rör sig hudens pH till och något över neutralitet. Dessa villkor gynnar P2. Båda enzymerna är troligen rensande enzymer, vilket gör att K. sedentarius kan erhålla kol-och kvävekällor, små peptider, låsta i den bosatta och olösliga komplexa polymeren, keratin. För närvarande är regleringen av produktionen av dessa enzymer okänd, liksom deras relativa bidrag till callusnedbrytning in vivo. Förutom de kliniska implikationerna har keratinolytiska proteaser betydande värde för den kommersiella sektorn eftersom de är användbara i ett antal industriella processer inklusive nedbrytning av keratinavfall från fjäderfä‐och läderindustrin (Shih 1993; Onifade et al. 1998). Den höga keratinolytiska aktiviteten hos K. sedentarius proteaser vid relativt låga temperaturer och pH, jämfört med många andra proteaser, presenterar en potentiell tillämpning av dessa enzymer i den biotekniska industrin.
