zebrafisk underhåll och lager: zebrafisk (Danio rerio) höjdes och iscensattes enligt etablerade protokoll30.Transgena linjer som används var Tg(kdr-l:ras-mcherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, TG(uas:Egfp-UCHD)ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 och Tg (kdrl:EGFP)s84337. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid RIKEN Kobe Branch (IACUC).
plasmider och oligonukleotider: zebrafisk marcksl1a, marcksl1b och fscn1a klonades med PCR från cDNA av 1 DPF-embryon med användning av NEB Ukrainian PCR kloning kit. Alla expressionskonstruktioner som användes i denna studie genererades via gateway-kloningen och/eller in-Fusion-kloningen med användning av plasmider från Tol2Kit38. Plasmider med muterade Marcksl1a och Marcksl1b genererades med användning av Q5-Platsstyrd mutagenes kit (Neb). shRNA-innehållande vektorer konstruerades genom ligering av shRNA-sekvensen mellan EcoRI-och PmeI-platserna nedströms U6-promotorn för modifierad pEGFP-U6 vector39 (en gåva från Zuoshang Xu, Addgene plasmid #19799). Målsekvens för human MARCKSL1 är 5 ’- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. Den förvrängda shRNA-sekvensen 5 ’- GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ’ designades som en felaktig sekvens (understruken) av MARCKSL1 shRNA. Vektorer som innehåller mus Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) och Marcksl1-s120d/T148D / T183D (Marcksl1-DDD) subkloned i pEGFP-N1 (Clontech)10 var gåvor från Eleanor T. Coffey (Åbo universitet). En detaljerad information om plasmider och primers som används i denna studie finns i kompletterande tabeller 1 respektive 2.
RNA-isolering och cDNA-syntes: Totalt RNA isolerades med användning av Tri-reagens (epigenetik) och Direct-zolTM RNA MicroPrep kit (Zymo Research) och cDNA syntetiserades med användning av SuperScript III-första Strängsyntessystemet (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll.
Mosaikuttryck av konstruktioner och transgena zebrafisklinjer: Tol2-baserade uttryckskonstruktioner (5-10 pg) injicerades samtidigt i zebrafiskembryon med en cellstadium med 50 pg Tol2-transposas mRNA transkriberad från NotI-linjäriserad pCS-TP-vektor (en gåva från Koichi Kawakami, National Institute of Genetics, Japan) med hjälp av mmessage mMACHINE SP6 kit (Invitrogen). För mosaikuttryck av transgener analyserades embryon vid 1 eller 2 dpf efter injektioner. För att generera TG(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 och Tg (fli1ep:EGFP-PLC1 usci)rk26-linjer, injicerades embryon till vuxna och screenades för grundare.
generering av zebrafisk marcksl1a och marcksl1b mutanter: marcksl1a mutanter genererades av CRISPR / Cas9-medierad mutagenes. Ett ENKELSTYRT RNA (sgRNA) som riktar sig mot den andra exonen (kompletterande Fig. 4A) genererades genom användning av kloningsoberoende protokoll40. Cas9 / sgRNA RNP-komplex monterades strax före injektion och efter 5 min inkubation vid rumstemperatur 200 pg Cas9-protein (Invitrogen) och 100 pg sgRNA injicerades samtidigt i encellssteg Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-mCherry)s916 embryo. marcksl1b-mutanter genererades av TALENMEDIERAD mutagenes. TALEN riktar sig mot marcksl1b: s första exon (kompletterande Fig. 4B) designades med hjälp av TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https: / / tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) och monterades via Golden Gate method41. TALEN repeat variable di-Rest (RVD) klonades in i en rciscript-GoldyTALEN-vektor (Addgene) och begränsade mRNA för varje talen transkriberades in vitro från SacI-linjäriserade uttrycksplasmider med användning av mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Encellssteg Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916 embryon mikroinjekterades med 200 pg RNA (100 pg av varje vänster och höger TALEN mRNA). F0-grundare identifierades genom att korsa TALEN eller CRISPR/Cas9-injicerad fisk med vildtypsfisk och screening av avkomman för mutationer vid 2 dpf med användning av T7-endonukleas i (NEB)-analys (för TALEN-injicerad fisk) eller Sanger-sekvensering (för CRISPR / Cas9-injicerad fisk). Kortfattat isolerades genomiskt DNA från grupper om fem embryon med HotSHOT-metod42 och motsvarande genomiska regioner förstärktes. Mutationer bedömdes genom direkt sekvensering av renade PCR-produkter. F1 avkomma av positiv F0 höjdes till vuxen ålder och heterozygota bärare för mutationer identifierades genom finklippning och rutinmässig genotypning PCR-analys med samma primers.
sex mutanta alleler i marcksl1a och fem mutanta alleler i marcksl1b identifierades under screeningen (kompletterande Fig. 13). Allel rk23 har en 2-nt-deletion som leder till en ramförskjutning efter aminosyra 51 och för tidigt stoppkodon vid aminosyra 56 efter 5 missense aminosyror (kompletterande Fig. 4a, c). Allel rk24 har en 5-nt-deletion som leder till en ramförskjutning efter aminosyra 13 och för tidigt stoppkodon vid aminosyra 17 efter 4 missense aminosyror (kompletterande Fig. 4b, d). Av dessa skäl anser vi att marcksl1ark23 och marcksl1brk24 är nollalleler och fokuserade våra undersökningar på analyserna av dessa mutanter.
levande avbildning: embryon monterades i 0,8% lågsmälta agaros (Bio-Rad) i E3-medium innehållande 0,16 mg/mL Trikain och 0,003% fenyltiourea. Konfokala Z-stackar förvärvades med hjälp av ett inverterat Olympus Ix83/Yokogawa CSU-W1-spinnskivkonfokalt mikroskop utrustat med en Zyla 4.2 CMOS-kamera (Andor). Ljusfältbilder förvärvades på Leica m205fa-mikroskop. Bilder bearbetades med Fiji (NIH).
laserablation: Laserablationer utfördes med användning av en 405 nm laser (Andor) och FRAPPA-modul (Andor) monterad på ett inverterat Olympus Ix83/Yokogawa CSU-W1 konfokalt mikroskop med ett Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2 vatten nedsänkningsmål. Tre sekventiella laserablationer med en uppehållstid på 1000 occurs vardera applicerades vid 51% lasereffekt.
Mikroangiografi: Mikroangiografi utfördes i vildtyp, marcksl1ark23, marcksl1brk24 och marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryon. Totalt injicerades 2 och 3 DPF-embryon med 1-2 nl dextran-tetrametylrodamin eller dextran-fluorescein (MW = 2000 kDa, Invitrogen) vid 10 mg/mL och avbildades omedelbart. Konfokala Z-stackar förvärvades med en Olympus UPLSAPO 10 GHz / NA 0.4 mål. För att täcka hela embryot avbildades och sys flera regioner med hjälp av Sömnadsplugin i Fiji43.
celltransplantation: grupper om 15-25 donatorceller från marcksl1ark23; marcksl1brk24 mutanta embryon i TG (kdr-l:ras-mCherry)s916 bakgrund samlades in från en slumpmässig position i blastoderm och transplanterades till den laterala marginalzonen i blastoderm44 av vildtypsmottagande embryon vid 4,5–6 hpf. Extraktion och transplantation utfördes med användning av en celltram 6R olja mikroinjektor (Eppendorf) med en borosilikatglas kapillär GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) utformad med en horisontell mikropipett avdragare P-87 (Sutter Instrument Co.) och en MF-900 microforge (Narishige) för att erhålla en ’sked’ form slät spets. Under transplantation embryon där förvaras i agaros belagda petriskålar med 0,5 X E2 buffert . Vid 2 dpf valdes embryon med mCherry-positiva ISV för mikroangiografi och avbildning. Totalt åtta oberoende transplantationer genomfördes.
kemiska behandlingar: Latrunculin B (Merck Millipore) löstes i DMSO till 1 mg/ml och lagrades vid -20 C. C. CK666 (Sigma) löstes i DMSO till 50 mM och lagrades vid 4 C. alla föreningar späddes till önskad koncentration i E3-buffert.
transfektion, siRNA-medierad proteinknockdown och skjuvspänningsexperiment: HUVECs (Lonza, C-2519a) odlades i EGM-medium (Lonza) och användes fram till passage 4. För plasmidtransfektioner såddes celler i Opti-MEM-medium (Gibco) vid 5,8 104-celler/cm2 på poly-L-lysin och gelatinbelagda täckglas och transfekterades med 2 kg plasmid med Lipofektamin 3000 (ThermoFisher Scientific). Två timmar efter transfektion ändrades Opti-MEM medium till EGM medium utan antibiotika. För siRNA transfection, HUVECs (7.9 msk 104 celler / cm2) transfekterades med 20 nM siRNA med användning av dharmafect1-reagens (Dharmacon). Transfektion upprepades efter 24 h. celler odlades för ytterligare 24 h före total RNA-extraktion eller fixering. On-TARGETplus mänskliga MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) användes för att slå ner MARCKSL1. ON-TARGETplus icke-target pool (Dharmacon) användes som kontroll siRNA transfektion. Celler fixerades med 4% PFA/ PBS, permeabiliserades med 0.1% Triton X-100 och färgades med 14 occurm DAPI för kärnmärkning, Alexa 568-phalloidin (1:1000, ThermoFisher Scientific) för visualisering av F-aktin och anti-VE-cadherinantikropp (1:100, cellsignalering) följt av anti-kanin Alexa 488 sekundär antikropp (1: 1000, ThermoFisher Scientific) för att markera EC-korsningar.
för skjuvspänningsexperiment odlades HPAEC (Lonza) vid 1000-1500 celler/mm2 på 1% gelatinbelagd skål i EGM-2 medium (Lonza) och användes före passage 9. Cellerna exponerades för statisk eller laminär skjuvspänning vid 15 dyn/cm2 för 0,5, 1 eller 6 h med användning av en parallell platta-typ apparatus45,46. Ena sidan av flödeskammaren bestod av en 1% gelatinbelagd glasplatta på vilken de odlade HPAECs vilade och den andra sidan bestod av en polykarbonatplatta. Deras plana ytor hölls 200 occurm isär med en Teflon packning. Kammaren var försedd med en ingång och en utgång för vätskan, och ingången var ansluten till en övre behållare med ett silikonrör. Utgången var öppen för en nedre reservoar. Flödet drevs av en rulle/rörpump. Vätskan (EGM-2-mediet) passerade från den övre behållaren genom flödeskammaren in i den nedre behållaren. Flödeshastigheten övervakades med en ultraljudsflödesmätare (HT107, Transoniska system) placerad vid ingången, och den styrdes genom att ändra skillnaden i höjd mellan den övre behållaren och utgången från flödeskammaren. Intensiteten av skjuvspänningen (sackaros, dynes/cm2) som verkar på EG-skiktet beräknades med hjälp av formeln: 6 (A2B), där (A) är viskositeten hos perfusatet (balans), Q är flödesvolymen (ml/s) och a och b är tvärsnittsdimensionerna för flödesbanan (cm). Efter skjuvspänningsexponering isolerades totalt RNA för qPCR.
kvantitativ realtids-PCR: qPCR utfördes med användning av 1 baccyl av cDNA, genererad från 150 ng (HPAECs) eller 500 ng (HUVECs) av totalt RNA, i en 10-baccolreaktionsblandning innehållande 1x Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) och 400 nM framåt och bakåt primers. Reaktionerna kördes på ABI Prism 7900ht instrument i fyrdubbla. Data analyserades med hjälp av RQ Manager-programvaran (Applied Biosystems) och MARCKSL1 mRNA relative expression beräknades med 2−usci-metoden 47 Med användning av GAPDH som referensgen.
helmontering in situ hybridisering: Hela fästet in situ hybridisering utfördes enligt standardprotokoll48. Embryon fixerades i 4% PFA vid 24, 48 och 72 hpf och permeabiliserades med 10 kg/mL proteinas K. hybridisering utfördes i buffert innehållande 5% natriumdextransulfat (MW = 500 kDa) vid 70 kg C över natten. Efter strängtvätt blockerades proverna med 2% blockeringsreagens (Roche) i maleinsyrabuffert och inkuberades över natten med anti-digoxigenin (DIG) antikropp, konjugerad med alkaliskt fosfatas (Roche, 1:5000) vid 4 msk C. embryon färgades med NBT/BCIP-lösning (Roche) i färgningsbuffert . Embryon rensades i 70% glycerol över natten och avbildades med Leica m205fa-mikroskop. MARCKSL1A-och marcksl1b DIG-märkta 1,2 kb långa riboprober genererades från plasmider som kodar för cDNA i full längd med MEGAscript SP6-eller T7-Kit (Invitrogen).
encelliga RNA-sekvensering: ECs isolerades från TG (kdrl:EGFP)s843 transgena embryon. Cellsortering utfördes med FACSAriaII Cellsorterare (BD Bioscience). Enkelcellsupphängning laddades in i 10x Kromsystem och cDNA-bibliotek konstruerades med hjälp av krom nästa pärla singelcell 3′ pärla, bibliotek och Gel pärla Kit v2 (10x Genomics) enligt tillverkarens protokoll. Biblioteket sekvenserades på Illumina HiSeq 1500 Sequencer (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1 användes för att de-multiplex raw base call (BCL) filer som genereras av Illumina sequencers i FASTQ filer, utföra justering, streckkod räkning, och UMI räkning. Sekvenseringsläsningar kartlades till zebrafiskgenomet (GRCz11, Ensembl release 92). Ytterligare analyser utfördes med hjälp av Seurat package49 i R-programvara (https://www.r-project.org). Uttrycksmatriserna filtrerades först genom att hålla gener som uttrycks i minst 3 celler och celler som uttryckte minst 200 gener för nedströmsanalys. Celler filtrerades vidare genom att välja för celler som uttrycker lågt mitokondriellt innehåll (<7%). Data normaliserades sedan med normaliserad datafunktion som normaliserar genuttrycket för varje cell genom det totala uttrycket.
kvantifiering av blodkärlets diameter: Live Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916 transgen vildtyp eller marcksl1 mutanta embryon avbildades vid 50-52 hpf. Konfokala Z-stackar förvärvades med en Olympus UPLSAPO 40 20/NA1.25 silikonolja nedsänkning mål. För DA-och PCV-diameterberäkningar gjordes 4-5 mätningar mellan ISV: er längs äggula-förlängningen (ISV: er nr 10-14). För ISV-diameter gjordes i genomsnitt 6 mätningar längs varje ISV (ISVs nr 10-14) mellan DA och DLAV. Mätningar gjordes med Fiji (NIH).
kvantifiering av EG-antal och spridning: För att räkna EG-nummer fixades 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 eller marcksl1ark23;marcksl1brk24-embryon i TG(kdr-l:ras-mcherry)s916-bakgrund i 4% PFA och färgades med 3 ukrainim DAPI. Konfokala Z-stackar förvärvades med en Olympus UPLSAPO 40x / NA 1.25 silikonolja nedsänkning mål. Kärnor räknades i varje ISV (ISVs nr 9-22) mellan DA och DLAV. Att kvantifiera mitotiska ECs i ISV, wildtype eller marcksl1ark23; marcksl1brk24 embryon i Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916-bakgrunden fixades i 4% PFA vid 30, 36 och 48 hpf, permeabiliserades i 1% DMSO/1% Triton X-100 och färgades med anti-fosfo H3-antikropp (1:250, Merck Millipore) följt av anti-kanin Alexa 488 sekundär antikropp (1:1000, ThermoFisher Scientific) och 3 baccolm DAPI. Konfokala Z-stackar förvärvades med en Olympus UPLSAPO 40x / NA 1.25 silikonolja nedsänkning mål. Mitotiska celler (pH3-positiva celler) räknades i ISV på båda sidor av embryot (ISV nr 9-22). ISV visualiserades med användning av mcherry fluorescens. Endast en pH3-positiv cell per ISV detekterades oavsett ISV-position. Under räkningen betraktade vi EG i telofas som en enda cell. För att räkna antalet EG-divisioner, wildtype eller marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryon i TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-mCherry)s916 bakgrund avbildades från 24 till 48 hpf vid 6 min intervaller med användning av en Olympus UPLSAPO 30 Baccarat/NA 1.05 silikonolja nedsänkning mål. Antalet celldelningar i varje ISV (ISVs nr 11-15) kvantifierades.
kvantifiering av aktomyosin nivåer i den apikala cortex: Live Tg (fli1: Lifeact-mCherry)ncv7; Tg (fli1ep: EGFP-PLC 2PH) Rk26 och TG(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 zebrafiskembryon avbildades vid 30-34 hpf med hjälp av en Olympus UPLSAPO 60 2BG/NA 1.2 vatten nedsänkning mål. Intensiteten av Lifeact eller Myl9b längs den apikala cortexen och i cytoplasman mättes med användning av Fiji. Förhållandet mellan genomsnittlig kortikal och cytoplasmatisk intensitet beräknades.
in vivo cellform analys: Single-cell märkning av ECs i ISV uppnåddes genom mosaik uttryck av antingen fli1ep: lynEGFP plasmid i wildtype, marcksl1brk24 eller marcksl1ark23; marcksl1brk24 muterade embryon eller fli1ep:marcksl1b-EGFP plasmid i vildtypsembryon. Vid 2 dpf utfördes mikroangiografi och fartyg avbildades med ett Olympus UPLSAPO 60 kcal/NA 1,2 nedsänkningsmål med optiskt Z-planintervall på 0,25 kcal. Cellformanalys av ECs av ISV utfördes på ett halvautomatiskt sätt med hjälp av ett specialskrivet ImageJ-skript utvecklat i Python, utvidga metoden som beskrivs i ref. 50. Bilder beskärdes först grovt för att minska nedströms minneskrav och ytterligare metadata (fartygstyp och embryoidentifierare) befolkades. Ett separat skript kördes sedan för att projicera och packa upp celler från ett kärl på en 2D-yta. Kortfattat roterades de beskurna bilderna först baserat på fartygstyp för att grovt rikta in kärlaxeln med Z-riktningen i en bildstapel, och kanalen för den fluorescerande mosaikcelletiketten valdes för projektion. För att övervinna problem med automatiserad kärlsegmentering i blodpoolfluorescenskanalen orsakad av variabla fluorescerande bakgrundsstrukturer och perfusion av dextran-rhodamin outwith kärlet, kärlaxeln identifierades genom att manuellt definiera kärlets position ungefär var 10: e sekund genom bildstacken och sedan utföra en Catmull-Rom spline passform och interpolering. Data transformerades sedan för att räta ut kärlaxeln i tre dimensioner. Därefter identifierades positionen för maximal intensitet i projektionskanalen längs strålar med 1 kg intervall runt kärlaxeln. Denna information användes för att projicera fluorescensintensitet på ett plan där axlarna är position längs kärlaxeln och vinkelpositionen och för att kartlägga avståndet från kärlaxeln vid varje position på det projicerade Planet. Cellen identifierades från den projicerade bilden med Imagejs inbyggda Intermodes-metod. Båglängderna representerade av sidorna av varje pixel associerad med cellen beräknades sedan (\(l = \ frac{{2\pi rd^2}}{{360}}\), där r är avståndet mellan cellassocierad pixel och kärlaxeln och d är sidan av en pixel) och används för att generera mått på cellytan och bildförhållandet.
in vitro cell formanalys: fasta HUVECs avbildades med ett Olympus UPLSAPO 40 kcal/NA 1,25 silikonolja nedsänkningsmål. Sammantaget togs 10-20 bilder från varje täckglas för kvantifiering och analyserades på ett halvautomatiskt sätt med hjälp av ett specialskrivet ImageJ-skript. Flerkanaliga Z-stackar projicerades maximalt och kanalen som visar en GFP-markör identifierades från instrumentmetadata. Imagejs inbyggda Otsu-tröskelmetod användes för att separera celler av intresse från bakgrunden; resulterande binära bilder rengjordes genom att ta bort regioner som är mindre än 105 kcal 2 och regioner i kontakt med gränsen för synfältet. Ett efterföljande manuellt interventionssteg gjorde det möjligt för användaren att eventuellt ändra cellregioner av intresse baserat på denna binära bild för att separera felaktigt sammanslagna celler eller inkludera celler som missades av tröskelåtgärden. Skriptet beräknade sedan områden och perimetrar för varje cell ROI. Dessutom beräknades ett’ spikiness index ’ för varje cell baserat på förhållandet mellan cellomkretsen och omkretsen för motsvarande konvexa skrov, och ett värde för cellens bildförhållande beräknades som förhållandet mellan de stora och mindre axlarna för en ellips monterad på cellens ROI.
analys av membranblebbing: tomter som hänför sig till membranblebbing genererades på ett halvautomatiskt sätt med hjälp av ett specialskrivet ImageJ-skript. För varje avbildat membran beräknades förhållandet mellan konturlängden för en membrankant och det euklidiska avståndet mellan kantändpunkterna vid varje tidpunkt. Från den resulterande tidsserien beräknades effektspektrala densiteter med Welchs metod51. Effektspektraldensiteten beräknades sedan i genomsnitt över ett fönster av intresse, definierat empiriskt som den karakteristiska tiden över vilken blebs bildades (0,04–0,06 Hz); dessa medelvärden jämfördes mellan experimentell (Marksl1b överuttryck) och kontrollförhållanden.
analys av aktin-och myosin II-dynamik i blebs: Tomter som relaterar dynamiken hos aktin eller myosin i blebbing-celler genererades på ett halvautomatiskt sätt med hjälp av ett specialskrivet ImageJ-skript. Multichannel time-lapse z-stackar projicerades först maximalt längs Z-dimensionen. Programvaran identifierade sedan automatiskt kanten på en bleb mellan två användardefinierade ankarpunkter vid alla tidpunkter med Imagejs inbyggda Otsu-tröskelmetod som körs på Marksl1b-EGFP-kanalen som ett surrogat för membranmärkning. Efter ett användarkvalitetskontrollsteg för att säkerställa korrekt identifiering av blebkanten extraherades aktin/myosin-kanalintensitetsprofilen längs kanten vid varje tidpunkt och plottades mot tiden i en kymograf. Vid varje tidpunkt extraherades intensitetsstatistik tillsammans med bleb-området, definierat här som det z-projicerade området som omges av kanten och linjen som sammanfogade punkterna på vardera sidan av bleb längst bort från bleb-spetsen längs en axel vinkelrätt mot linjen som sammanfogade de användardefinierade ankarpunkterna, och genomsnittlig aktin/myosin-kanalintensitet och bleb-området plottades mot tiden.
kvantifiering av kortikal aktindensitet och buntbredd: Högupplösta bilder av aktin i HUVECs förvärvades med hjälp av en Plan-APOCHROMAT 63x oljeobjektivlins monterad på ett Zeiss LSM880 konfokalt mikroskop utrustat med en Airyscan-och GaAsP-detektor. Ungefär 3 kg kvadrerade regioner inom varje observation valdes slumpmässigt och beskärdes typiskt 8 optiska sektioner som täcker det kortikala nätet från dessa regioner. Projicerade bilder längs Z-axeln för beskurna staplar genererades av maximal intensitetsprojektion och utsattes för följande procedur. Eftersom aktinfilament i bilden var tvetydiga och det var omöjligt att utvärdera hela nätverket, kvantifierade vi antalet aktinfilament inom de begränsade regionerna som tätheten av aktinnätverksarbete. Detta utfördes genom att ställa in skanningslinjer längs X – och Y-axlar vid varje 4 pixlar, och pixelvärden längs var och en av skanningslinjen utsattes för Savitzky-Golay-filter52 för att beräkna första ordningens derivat. Aktinfilament identifierades sedan genom att hitta nollkorsningspunkter, vilka är intensitetstopparna för skanningslinjen. Räkningar för toppar dividerades med pixelantalet för skanningslinjen (bildens bredd eller höjd) och densiteten hos filamenten över bilden beräknades genom att ta medelvärdet av dessa värden.
för att kvantifiera aktinbuntens bredd genererades de centrerade linjerna i aktinbuntarna genom att hitta nollkorsningspunkter för första ordningens derivat beräknade av Savitzky-Golay-filtret och följt av att tillämpa Hilditch-gallringsalgoritmen. För att eliminera en möjlighet att förgrenings – eller korsningspunkter för aktinfilamenten påverkar mätningar eliminerades och segmenterades förgreningspunkter som hittades inom den skelettiserade linjen. Den ortogonala axeln till det totala segmentet bestämdes genom att erhålla egenvektorn, och fluorescerande intensiteter samplades längs den ortogonala axeln som körde segmentets tyngdpunkt med Lanczos-5-interpoleringsmetoden. Därefter bestämdes diametern på ett filament av bredden på regionen som visade större eller lika med halva toppintensiteten inom linjen samplad längs ortogonalaxeln till det totala segmentet.
statistik: statistisk analys utfördes med användning av Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Provstorlekarna var inte förutbestämda, experimenten randomiserades inte och utredarna blindades inte för tilldelning under experiment och resultatbedömning.
rapportsammanfattning
ytterligare information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary kopplad till denna artikel.
