molekylär fylogeni av kelch-repeat-superfamiljen avslöjar en expansion av BTB/kelch-proteiner hos djur

identifiering och karakterisering av kelch-repeat-proteiner kodade i det mänskliga genomet

för att identifiera kelch-repeat-proteiner kodade i det mänskliga genomet, BLAST-och PSI-BLAST-sökningar av det mänskliga genomet genom förutspådd proteindatabas utfördes med Kelch-motif consensus (cdd543, pfam01344, Smart 00612) som en Frågesekvens. Denna sökning identifierade 57 kelch-repeat proteiner och hypotetiska proteiner. Vi noterade att flera av de kända humana kelch-repeat-proteinerna inte identifierades med denna metod, förmodligen för att det finns relativt få konsensusrester i varje kelchmotiv, varav ingen är helt invariant över alla exempel på motivet, och också på grund av variation i längderna på slingorna mellan askorbinsträngarna . Därför gjordes ytterligare sökningar med kelch-upprepningarna av alla 28 kända superfamiljemedlemmar, som beskrivs i metoderna. Dessa sökningar identifierade 18 ytterligare kelch-repeat proteiner kodade i det mänskliga genomet. Korsreferenser alla 75 poster mot GenBank identifierade 9 av posterna som partiella sekvenser och/eller dubbla poster för samma protein eller hypotetiska ORF, och två av posterna som icke-kelchinnehållande proteiner. Vi korsrefererade också sökresultaten till domänposterna för kelch i PFAM-och SMART-domändatabaserna. Många poster listades i både SMART och Pfam, men ett antal proteiner som vi hade identifierat var inte listade i dessa databaser (anges i Tabell 1), även om när vi sökte dessa polypeptider mot SMART eller Pfam identifierades kelchmotiv tydligt. Vidare, antalet kelch upprepa proteiner tilldelas H. sapiens i arter träd eller Taxbreak länkar av Pfam och SMART var överskattade på grund av införandet av ofullständiga ORF och flera poster för samma polypeptid. Vi utförde också ytterligare sökningar av GenBank med enkla kelchmotiv från de 28 kända kelch-repeat-proteinerna som var tydligt längre än CDD kelch-motif-konsensus, för att söka mer omfattande efter proteiner som innehåller mer divergerande upprepningar. Från dessa multipla utvärderingar och med uteslutning av partiella sekvenser (som beskrivs i metoderna) identifierade vi minst 71 kelch-repeat-proteiner kodade i det mänskliga genomet (Tabell 1).

för att bestämma antalet upprepade kelchmotiv i varje protein eller hypotetiskt protein gjordes BLASTP-sökningar med varje sekvens mot konserverad Domändatabas (CDD) och Pfam, tillsammans med manuell identifiering av kelchmotiv. Antalet identifierade kelchmotiv varierade från två till sju. Four blades är det minumumtal som har dokumenterats från kristallstrukturer av Macau-propellerdomäner . Således verkade det osannolikt att poster som kodade två eller tre kelchmotiv motsvarade fullständiga ORF: er och dessa uteslöts från ytterligare analys (poster NP-689579, XP_209285, XP_058629). På grundval av detta förutspåddes 12,7 % (9/71) av sekvenser innehålla fembladiga propellrar av typen Macau, 84,5 % (60/71) var sexbladiga och 2,8 % (2/71) innehöll sjubladiga propellrar av typen sjubladiga (Tabell 1). Så vitt vi vet har endast ett sjubladigt kelch-upprepningsprotein identifierats tidigare, svampgalaktosoxidas .

i galaktosoxidas, det enda kelch-repetitionsprotein för vilket det finns kristallstrukturinformation, cirkuleras propellern genom bildning av ett sammansatt sjunde blad, med de tre strängarna från den mest C-terminala sekvensrepetitionen och de fyra strängarna från den mest C-terminala sekvensrepetitionen och den fyra strängen från den amino-terminala sekvensen till den första hela sekvensrepetitionen, en mekanism som kallas ”N-terminala stängningen av tuberkulossträngen” , (Fig. 1C). Vi undersökte de humana kelch-repetitionsproteinerna genom sekundär struktur förutsägelse av Bisexuell-ark och genom manuell analys av sekvensrepetitionerna, och fann att för 77,5 % (55/71) av proteinerna förutspåddes att strukturen av en C-terminal Bisexuell-sträng skulle stängas. För fem sekvenser kunde ingen tydlig förutsägelse göras (Tabell 1).

kromosomal lokalisering av humana kelch-repeat-proteiner

kodningssekvenserna för humana kelch-repeat-proteiner är dispergerade genom genomet och ligger på alla kromosomer utom kromosom 21 och Y-kromosomen (Tabell 1). Flera instanser av gener i fysisk närhet märktes, till exempel NP_006460 och NP_067646 vid 1q31.3 och NP_569713 och NP_060114 vid 3q27.3 (Tabell 1). Men i de flesta fall motsvarade dessa inte de mest närbesläktade proteinsekvenserna som skulle förväntas för nyligen duplicerade gener. Ett undantag var NP_055130 och NP-751943 som var belägna vid 14q21.3 och som var närmast relaterade till varandra (46% identitet). Sammantaget fanns det inga bevis för fysisk gruppering av kelch-proteinkodningssekvenser inom det mänskliga genomet. Däremot är gener som kodar för de många F-box/kelch-proteinerna i A. thaliana grupperade så att några av de mest relaterade sekvenserna kodas från fysiskt nära genomiska platser .

Domänarkitektur för humana Kelch-repeat-proteiner

tjugoåtta kelch-repeat-proteiner från olika organismer grupperades tidigare i 5 strukturella kategorier enligt placeringen av kelch-upprepningarna inom polypeptidsekvensen och närvaron av andra konserverade strukturella domäner . För att utvärdera komplexiteten hos domänarkitekturer inom en enda organism analyserades varje human kelch-repeat proteinsekvens genom att söka mot CDD, SMART och Pfam och sedan subgrupperas enligt domänarkitektur.

påfallande innehöll 72% (51/71) av de humana kelch-repeterade proteinerna en BTB/POZ-domän. I alla utom ett av proteinerna var BTB-domänen amino-terminal till kelch-domänen (Tabell 1). Detta hypotetiska protein, LZTR-1, innehöll två tandem BTB-domäner. Fyra (5,6%) kelch-repeat proteiner innehöll en enda ytterligare konserverad domän. Muskelin var det enda kelch-repeat-proteinet som identifierades i det mänskliga genomet för att innehålla en discoidin-domän (CDD 7753, Pfam 00231, SMART 00231, även känd som F5/F8 typ C-domän) (Prag, Collett och Adams, under förberedelse). Discoidin-domänen fungerar som en protein-protein-interaktionsdomän i ett antal extracellulära och intracellulära proteiner och i koagulationsfaktorer V och VIII förmedlar fosfolipidbindning . Ett annat kelch-protein, XP_048774, innehöll en f-box-domän (CDD9197, Pfam 00646). F-boxen är en domän av omkring fyrtio rester, först identifierad i cyklin A, som interagerar med Skp1 för att förankra proteiner till ubiquitin-ligasenheten för ubiquitinering och inriktning mot proteosommedierad nedbrytning . Kombinationen av f-box och kelch-repeat domäner har tidigare beskrivits i A. thaliana, där minst 67 f-box/kelch proteiner och hypotetiska proteiner kodas i genomet . Flera av dessa fungerar i ljusberoende reglering av den cirkadiska klockan, men funktionen hos många andra är Obskyr . Så vitt vi vet är detta det första erkännandet av ett f-box/kelch-protein i ett djurgenom. Ett förutsagt kelch-repeat-protein, NP_055608, innehöll en leucinkarboxylmetyltansferas (LCM) – domän (CDD9631, Pfam 04072) med 34% identitet till LCM-domänen för proteinfosfatas 2 leucinkarboxylmetyltransferas . Rekombinationsaktiverande Gen – 2 (RAG-2) innehåller en växt homeodomain (PHD) fingerdomän (Pfam00628) vid karboxiterminalen .

sex kelch-repeterande proteiner (11 %) var mycket stora, multidomänproteiner (Tabell 1). Attractin / mahogny (som är skarvvarianter från en enda gen; 27-29) och MEGF8 är vardera över 1000 aminosyror långa och innehöll en KUBDOMÄN, kelch-upprepningar, en C-typ lektindomän och EGF-liknande domäner. Olika funktioner har tillskrivits attractin och mahogny som inkluderar en roll i t-cellinteraktioner (attractin, den utsöndrade skarvvarianten) och fetma reglering hos möss (mahogny, transmembranskarvvarianten) . Värdcellsfaktor-1 och -2 (HCF-1 och HCF-2) är också stora proteiner som innehåller amino-terminala kelch-upprepningar, två fibronektin typ III domäner och, i fallet med HCF-1, en serie unika HCF-upprepningar. Dessa proteiner fungerar som transkriptionskoaktivatorer av herpes simplexvirus omedelbart tidigt genuttryck .

vi identifierade tre hypotetiska kelch-repeat-proteiner som innehållande orelaterade unika sekvenser som inte motsvarade erkända strukturella domäner, placerade antingen amino – eller karboxiterminal till kelch-upprepningarna (Tabell 1).

Rab9 effektor p40 och sex andra kelch-repeat-proteiner var korta polypeptider, från 350-442 aminosyror i längd, som nästan helt bestod av kelch-upprepningar (Tabell 1). Fem av dessa proteiner eller hypotetiska proteiner, inklusive p40, innehöll sex sekvensrepetitioner och förutses sålunda att bilda sexbladiga propellrar av typen saxbladspropellrar. Två hypotetiska proteiner, NP_060673 och XP_114323, bestod av förmodade sjubladiga propellrar av kokain. Tillsammans utgör dessa strukturella skillnader grunden för den nya kategoriseringen av humana kelch-repeat-proteiner som presenteras här (Tabell 1).

strukturella förhållanden mellan humana BTB / kelch-proteiner

det oväntat stora antalet BTB / kelch-proteiner kodade i det mänskliga genomet fick oss att studera denna grupp mer detaljerat, i syfte att identifiera strukturella undergrupper som också kan representera funktionella delmängder. De 38 fullängdssekvenser som innehöll enstaka BTB-domäner och förutspådde sexbladiga megapixelpropellrar anpassades enligt sekvenslikhet i CLUSTALW och betraktades som grannskapsförbindande träd. Justering av fullängdssekvenserna avslöjade tre undergrupper av ungefär lika stor storlek, som vi kallade undergrupper 1 till 3 (Fig. 2A). När samma analys utfördes med kelchdomänerna ensamma, samma gruppering var uppenbar för undergrupp 1 och en väsentlig del av undergrupp 2, benämnd undergrupp 2a (Fig. 2B). I en inriktning av endast BTB-domänerna bibehölls undergrupperna 1 och 2 för majoriteten av sekvenserna (Fig. 2C). Orotade träd producerade med en separat metod för inriktning baserad på maximal parsimonianalys av sekvenser, PROTPARS, stödde inte undergrupp 3 men visade konsekvent förhållandet mellan sekvenserna i undergrupperna 1 och 2a (data visas inte). Vi fokuserade på dessa robust relaterade kelch-repeat-sekvenser i undergrupper 1 och 2a, för en närmare analys av kelch-repeat-domänerna.

förhållanden mellan humana BTB/kelchproteiner. Aminosyrasekvenserna av de 38 fullängds humana BTB / kelch-proteinerna som förutspåddes innehålla sexbladiga bronkipropeller justerades i CLUSTALW och presenteras i Phylip Drawgram för A) fullängdssekvenser; B) endast kelch-repeat-domäner; C) endast BTB-domäner, med skuggkoder för de tre identifierade undergrupperna som anges. Asterisk i panel a indikerar kända aktinbindande BTB / kelchproteiner. Panel B visar den robusta grupperingen av en uppsättning sekvenser från undergrupp 2, benämnd undergrupp 2A.

CLUSTALW multipel sekvensinriktning av kelch-repeat-domänerna från var och en av undergrupperna 1 och 2a visade särdrag när det gäller upprepad organisation. I båda undergrupperna (Fig. 3 och Fig. 4), den intrablade slingan mellan vanilj-strängar 2 och 3 (2-3 slinga, Fig. 5A) och interblade 4-1-slingan var stora variationskällor inom upprepningarna med avseende på deras längd och primära struktur. I samband med den intakta domänen av Propeller, de 1-2 och 3-4 slingor sticker ut över en sida av arket och 2-3 slingor sticker ut från den motsatta sidan (Fig. 5A). 4-1-slingan ligger antingen på samma sida som 2-3-slingan, eller kan placeras närmare propellerns kärna av propellern (Fig. 5). I undergrupp 1 hittades de längsta 2-3 slingorna i upprepningar 1, 5 och 6, med kortare öglor i blad 2, 3 och 4. Den längsta 4-1 slingan var den mellan upprepningarna 5 och 6 (Fig. 3). I samband med en Macau-propeller antyder detta att sidan av propellern som bildas av upprepningar 5, 6 och 1 kan vara särskilt involverad i proteininteraktioner (se Fig. 1C). I undergrupp 2A var de längsta 2-3 slingorna de i upprepningar 1 och 2, upprepningar 4 och 5 hade mellanliggande 2-3 slingor och upprepningar 3 och 6 innehöll de kortaste 2-3 slingorna. De längsta 4-1 slingorna var de mellan upprepningarna 1 och 2 och upprepningarna 3 och 4 (Fig. 4). Detta tyder på att det finns en annan organisation av bindningsställen i undergrupp 2A-propellrar, med kanske två bindningsytor bildade av upprepningar 1 och 2 och upprepningar 4 och 5. På nivån av individuella sekvenser fanns det också specifika exempel på variation från standardrepetitionsorganisationen som kunde vara av funktionell betydelse för enskilda proteiner. Till exempel har NP_695002 i undergrupp 2A en ovanligt lång och högladdad 3-4-slinga i repetition 1 och XP_ 040383 har en lång 3-4-slinga i repetition 4 (Fig. 4).

multipel sekvensinriktning av undergrupp 1 humana BTB/kelchproteiner. Kelch-repeat-domänerna i 15-undergruppen 1 BTB / kelch-proteiner justerades i CLUSTALW för att generera en 50% identitetströskelnivå konsensussekvens. Inriktningarna presenteras för varje upprepning, med upprepningsenheten tilldelad enligt 1gof-strukturen. De fyra delarna i varje upprepning är färgkodade som i Fig. 1A. inriktningar presenteras i Boxshade: svart skuggning indikerar identiska aminosyror, grå skuggning indikerar liknande aminosyror och vit bakgrund indikerar orelaterade aminosyror.

multipel sekvensinriktning av undergrupp 2A humana BTB/kelchproteiner. Kelch-repeat-domänerna i 10-undergruppen 2A BTB / kelch-proteiner justerades i CLUSTALW för att generera en 50% identitetströskelnivå konsensussekvens. Inriktningarna presenteras för varje upprepning, med upprepningsenheten tilldelad enligt 1gof-strukturen. De fyra delarna i varje upprepning är färgkodade som i Fig. 1A. inriktningar presenteras i Boxshade: svart skuggning indikerar identiska aminosyror, grå skuggning indikerar liknande aminosyror och vit bakgrund indikerar orelaterade aminosyror.

förhållanden mellan konsensus kelch-motiv till propellerbladets struktur. A, sidovy av en enda propellerbladsstruktur från galaktosoxidas (1gof). oc-strängar är färgkodade som i Fig. 1A och nomenklaturen för intra – och interbladslingorna anges. B, anpassning av konsensus kelchmotiv härledda från BTB/kelch-undergrupper 1 och 2a till bladstruktur, vilket visar skillnader i 2-3-slingstorleken och laddningsfördelningen. Positionen för varje sau-sträng anges.

vi fann också att konsensussekvenserna för veckan var särskiljande mellan de två undergrupperna. 50% identitets konsensussekvensen från varje undergrupp justerades om mot kelch-repeat-enheten för att härleda genomsnittliga 50% identitets konsensussekvenser för undergrupp 1 och undergrupp 2a. dessa motiv kartlades mot den kända bladstrukturen för galaktosoxidas (Fig. 5). Konsensusmotiven inkluderade både aminosyror av betydelse för vecket (beläget inom sackarissträngarna) och vissa aminosyror i slingor, som skulle förutsägas bidra till bindande interaktioner. Observera att motivets genomsnittliga längd var kortare i undergrupp 1 än undergrupp 2a. Undergruppen 2A-konsensus förutses innehålla en längre 2-3-slinga. Konsensusmotiven var distinkta i positioneringen av högkonserverade laddade rester inom slingregionerna (Fig. 5). Bevarandet av dessa laddade rester var mest uttalad i undergrupp 1, där dessa positioner bevarades i motivet till 70% identitetströskelnivå (data visas inte). Dessa skillnader i slingegenskaper tyder också på olika modaliteter av protein-proteininteraktioner för sugpropellrarna i undergrupperna 1 och 2a. När det gäller tidigare karakteriserade Proteinbindande egenskaper observerade vi att BTB/kelch-proteinerna som binder till aktin delades mellan undergrupperna 1 och 3; således har denna funktion inte ett enkelt förhållande till den primära strukturen (Fig. 2A).

Kelch-repeat proteiner kodade i ryggradslösa genomer

vi ville jämföra den evolutionära utvecklingen av kelch-repeat proteiner mellan människor och moderna ryggradslösa djur, och så upprepade analysen av kelch-repeat proteiner och deras strukturella undergrupper kodade i genomerna av D. melanogaster, A. gambiae och C. elegans . Vi identifierade 18 kelch-repeat proteiner kodade i Drosophila och Anopheles genom (Tabell 2). Sjutton av dessa var orthologer bevarade mellan de två arterna (den genomsnittliga identiteten mellan orthologa gener av D. melanogaster och A. gambiae är 56 % ) och en var unik för varje art. Således identifierades en Actinfilin-homolog i A. gambiae men inte i D. melanogaster och D. melanogaster-genomet innehöll en homolog av NP_116164 som inte var närvarande i A. gambiae (Tabell 2). Endast tre Kelch-repeat-proteiner karakteriserades tidigare i D. melanogaster, nämligen Kelch, Muskelin och Drosophila värdcellfaktor . Två andra, diablo och scruin-liknande vid mittlinjen (SLIM-1), har erkänts som kelch-repeat-proteiner .

inom gruppen av 19 proteiner och hypotetiska proteiner innehöll 95% sex kelch-upprepningar. Endast ett protein med fem kelch-upprepningar identifierades i antingen D. melanogaster eller A. gambiae, vilket motsvarade en ortolog av det humana f-box/kelch-proteinet, XP_048774 (Tabell 2). 56 % av kelch-repeat-proteinerna av D. melanogaster och A. gambiae var BTB/kelch-proteiner. Både D. melanogaster och A. gambiae innehöll en discoidin / kelch protein orthologous till muskelin, en F-box / kelch protein, tre kelch och multidomain proteiner, en kelch och unikt protein, och två propeller-bara proteiner. Således hade alla de identifierade 19 kelch-repeat-proteinerna homologer i det mänskliga genomet och BTB/kelch-domänarkitekturen var den vanligaste (Tabell 2).

vi identifierade 16 kelch-repeat-proteiner kodade inom C. elegans-genomet (tabell 3). Av dessa proteiner har endast kel-1, spe-26 och CeHCF karaktäriserats funktionellt. Kel-1 är ett intracellulärt protein som är involverat i reglering av utfodringsbeteende under larvutveckling . Spe – 26 bidrar till den cellulära organisationen av spermatocyter och mutationer är associerade med sterilitet . CeHCF kan vara involverad i regleringen av cellproliferation . 43.7 % (7/16) av proteinerna hade BTB/kelch-domänarkitekturen, två var homologer av HCF och attractin med liknande multidomänarkitekturer, två innehöll unika sekvenser utanför kelch-upprepningarna och två var propeller-bara proteiner, som båda förutspåddes bilda sexbladiga sackarios-propellrar. Ett enda f-box/kelchprotein identifierades, men inget muskelinliknande protein hittades (tabell 3),. Istället identifierades två hypotetiska proteiner med distinkta domänarkitekturer : NP_506605 som också innehöll en cyklinkarboxiterminaldomän (CDD 7965, Pfam 02984, SMART 00385) och NP_506602, som innehöll en RINGDOMÄN (CDD 8941, Pfam 00097, SMART 00184). Cyklinkarboxiterminaldomänen bildar en spiralformad vikning i form av en spiralformad vikning som kan utgöra en plats för proteininteraktion . RINGDOMÄNEN är en zinkfingerveck som förmedlar protein-proteininteraktioner .

Kelch-repeat proteiner kodade i jäst genom

flera kelch-repeat proteiner har studerats funktionellt i spirande och fission jäst men ingen av dessa motsvarar BTB/kelch proteiner . Vi undersökte huruvida förekomsten av BTB / kelch-domänarkitekturen som vi hade identifierat i flercelliga djur utvidgades till jäst genom att analysera komplementet av kelch-repeat-proteiner kodade i S. pombe och S. cerevisiae genom . Vi fann att varje genom kodade ett litet antal kelch-repeat-proteiner (fem i S. pombe, åtta i S. cerevisiae), varav ingen motsvarade ett BTB / kelchprotein (Tabell 4). Proteiner och hypotetiska proteiner bestående av en amino-terminal Kelch-propellern och en utvidgad spiralformad region och ett protein motsvarande ett förmodat leucinkarboxylmetyltransferas var vanliga för S. pombe och S. cerevisiae. De andra kodade kelch-repeterande proteinerna var icke-homologa (Tabell 4). Muskelinliknande 1-protein och Ral-2p identifierades i S. pombe men inte S. cerevisiae . Två proteiner med avlägset relaterade kelch-upprepningar, Gpb1/Krh1 och Gpb2/Krh2, har karakteriserats funktionellt som G-proteinkopplade receptorbindande proteiner i S. cerevisiae . Homologa proteiner identifierades inte i S. pombe i samband med Vår studie. Således identifierades inte BTB / kelch-domänarkitekturen i dessa jäst.

begränsning av BTB / kelch-proteiner till metazoandjur och poxvirus

eftersom BTB / kelch-domänarkitekturen verkade utbredd hos djur men inte identifierades i jäst var vi intresserade av att överväga om några andra organismer kan innehålla kelch-repeat-proteiner med denna domänarkitektur. Ett antal BTB / kelch-proteiner har rapporterats som hypotetiska öppna läsramar (ORF) i poxvirusfamiljen av djurvirus . Databasen Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) på NCBI listar 333 poster för BTB/kelch-proteiner, som alla härrör från ryggradsdjur, insekter, C. elegans eller poxvirus. Hittills har BTB-domänen endast identifierats i eucaryotes (PFAM 00651 Art tree). Förutom att granska SMART och Pfam arter träd för kategorisering av BTB / kelch domänarkitektur, vi genomförde våra egna BLASTP och TBLASTX sökningar i A. thaliana genome database med CDD kelch motif consensus (detta sökverktyg identifierade 44 BTB/kelch-proteiner från det mänskliga genomet och är således mycket effektivt för att avslöja dessa proteiner) och identifierade 72 proteinsekvenser, varav majoriteten var F-box/kelch-proteiner, varav några var serin-treonin fosfatas/kelch-proteiner, och ingen av dem var BTB / kelch-proteiner. Sökningar med BTB-domänerna för flera humana eller ryggradslösa kelch-repeat-proteiner identifierade inte heller BTB / kelch-proteiner i A. thaliana. BLAST genom sökningar i databaserna av fullständiga eller delvis sekvenserade eukaryota djur-och växtgenomer vid NCBI (Entrez/genome_tree, ), som inkluderade de fullständigt sekvenserade genomerna av Apicomplexium Plasmodium falciparum , Microsporidium Encephalitozoon cuniculi , växten Oryza sativa (ris; ) och svampen Neurospora crassa identifierade många förutspådda kelch-repeat-innehållande proteiner, men inga ORF som hade BTB/kelch-domänarkitekturen. Resultat för utvalda domänarkitekturer i fem eukaryota organismer presenteras i Fig. 6. Vi noterade dock i Apicomplexia-arter, två proteiner med K Tetra /kelch-domänarkitektur (NP_705330 och EAA22466). K tetra-domänen (Pfam 02214) är en avlägsen strukturell släkting till BTB/POZ-domänen . Sammantaget ger dessa resultat en signifikant indikation på att proteinkodningssekvenser för BTB/kelch-domänarkitekturen har utvidgats under utvecklingen av flercelliga djur jämfört med Apikomplexi, svampar, växter och andra eukaryoter.

förekomst av utvalda kelch-repeat protein domain architectures i eucaryotes. Stapeldiagrammen representerar antalet kelch-repeat-proteiner med de angivna domänarkitekturerna kodade i proteomerna av H. sapiens (Hs), D. melanogaster (Dm), C. elegans (Ce), S. pombe (Sp) och A. thaliana (At).