patienter med intoleransreaktioner mot Total knäbyte: kombinerad bedömning av allergidiagnostik, Periprostetisk histologi och Peri-implantat Cytokinuttrycksmönster

Abstrakt

vi utförde ett kombinerat tillvägagångssätt för att identifiera misstänkt allergi mot knäartroplastik (TKR): patch test (PT), lymfocyttransformationstest (LTT), histopatologi (övergripande gradering av knäproteser), histopatologi; T-och B-lymfocyter, makrofager och neutrofiler) och semikvantitativ realtids-PCR-baserad periprostetisk inflammatorisk mediatoranalys (IFNy, TNFa, IL1-XXL, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 och TGF-XXL). Vi analyserade 25 tkr-patienter med ännu oförklarliga komplikationer som smärta, effusion och minskat rörelseområde. De bestod av 20 patienter med bevisad metallsensibilisering (11 Med PT-reaktioner; 9 med endast LTT-reaktivitet). Kontrollprover var från 5 komplicerade tkr-patienter utan metallsensibilisering, 12 OA-patienter före artroplastik och 8 PT-patienter utan artroplastik. Lymfocytiska infiltrat sågs och fibrotiskt (typ IV-membran) vävnadssvar var vanligast hos de metallkänsliga patienterna, till exempel hos 81% av de PT-positiva patienterna. Den senare hade också markerat periprostetiskt IFNy-uttryck. 8/9 patienter med revisionskirurgi med Ti-belagda/oxiniumbaserade implantat rapporterade symptomlindring. Våra resultat visar att kombinera allergidiagnostik med histopatologi och periprostetisk cytokinbedömning kan göra det möjligt för oss att utforma bättre diagnostiska strategier.

1. Inledning

höft-och knäbyte är mycket framgångsrika kirurgiska ingrepp för att återställa livskvaliteten hos artrospatienter och motsvarande implantationshastigheter ökar stadigt . I en väsentlig del av sådana patienter leder emellertid implantatfel till implantatrevision. En ny granskning visar en total revisionshastighet för knäbyte (tkr) på 9, 5% i Tyskland och 8, 4% i USA för år 2011 . Inom spektrumet av tillstånd som leder till tkr-misslyckande kan biverkningar hittas, men allergins roll är fortfarande en kontroversiell fråga. Kutan metallallergi är frekvent i den allmänna befolkningen, till exempel cirka 13% till nickel (Ni), 2% till kobolt (Co) och 1% till krom (Cr) . Antingen slitage eller korrosion leder till peri-implantat och systemisk metall (särskilt Ni, Cr eller Co) exponering av artroplastiska patienter, och på motsvarande sätt rapporteras förekomsten av metallkänslighet hos patienter med misslyckat implantat öka . När det gäller total höftbyte tillskrevs aseptisk lossning mestadels slitage associerad makrofagdominerad främmande kroppssvar som underliggande mekanism . Under det senaste decenniet har uppmärksamheten vänt sig till rollen som överkänslighet vid peri-implantatinflammation. I synnerhet i metall-på-metall-artroplastik beskrevs en undergrupp av patienter som visade snarare Peri-implantat lymfocytisk inflammation som potentiell framkallare av implantatsvikt . Beskrivna histologiska förändringar inkluderar diffus, perivaskulär eller lymffollikel (lymfoid) som infiltration av lymfocyter och få makrofager, höga endotelvenuler och delvis vävnadsnekros . Metallallergi som en bidragande faktor föreslogs av den observerade kopplingen mellan peri-implantat lymfocytisk inflammation, patch test reaktivitet mot metaller och förbättrad lymfocyttransformationstest (LTT) svar på metaller i en serie av sådana patienter . Det finns emellertid fortfarande kontroversiell diskussion om i vilken utsträckning metallallergi bidrar till” paraplytermen ” biverkningar vid höftartroplastik . Faktum är att metallallergiska patienter kan tolerera respektive metaller som innehåller implantat . När det gäller TKR finns det också rapporter om kutan metallallergi som finns i samband med komplikationer , men det är ännu inte undersökt om sådan metallallergi är ansvarig för den biologiska reaktionen. När vi ser patienter med misstänkta implantatintoleransreaktioner i en speciell poliklinisk ambulatorisk, undrade vi om i en serie patienter med komplicerad TKR en potentiell metallkänslighet kunde kopplas till en viss Peri-implantathistologisk bild och cytokinuttrycksmönster. För att ta itu med potentiell klinisk relevans av resultaten kontaktade vi vidare patienterna för att se om de har haft någon nytta av revisionskirurgi med särskild uppmärksamhet på den potentiella användningen av ”hypoallergena” material vid revisionskirurgi.

således var syftet med undersökningen att bättre bevisa allergisk etiologi i komplicerad TKR genom att kombinera olika diagnostiska steg och genom att bedöma den kliniska relevansen av resultaten i en uppföljning.

2. Material och metoder

2.1. Patienter och kontroller

totalt 45 patienter deltog i studien. Studien godkändes av etikutskottet. Följande patientgrupper analyserades.

25 knäartroplastiska patienter (16 m, 9 f, 37-75 år) med CoCrMo-baserad TKR och komplikationer som lossning, återkommande effusioner och smärta presenterades av deras behandlande ortopediska kirurger till vår ambulerande för allergidiagnostik, eftersom föregående diagnostik inte gav någon indikation på problemutlösare som felpositionering/feljustering, fraktur eller infektion. Enligt resultaten av allergidiagnostik tilldelades dessa patienter ytterligare tre grupper. Grupp I: 11 patienter (patchtest positivt och LTT positivt), grupp II: 9 patienter (patchtest negativt och LTT positivt) och Grupp III: 5 patienter (patchtest negativt och LTT negativt).

studien inkluderade 12 patienter (1 m, 52-89 år; ”OA-kontrollgrupp”) utan implantat, men degenerativ ledsjukdom/artros (OA) före knäartroplastik.

studien inkluderade 8 patienter (2 m, 53-75 år; ”PT-kontrollgrupp”) utan implantat, men har genomgått patchtest (PT) för misstänkta allergiska hudsjukdomar. 6/8 hade ni-PT-reaktivitet, 2/8 hade ingen Ni-PT-reaktivitet.

hos de 25 tkr-patienterna bedömdes potentiell metallkänslighet med PT och LTT; dessutom erhölls periprostetiska vävnadsprover för histologi, molekylär analys och mikrobiologi. Dessutom erhölls en WOMAC-poäng vid det ambulerande besöket för att få feedback om patienternas uppfattning om daglig livsaktivitet och smärta. I de 12 oa-patienterna (”oa-kontrollgruppen”) erhölls vid primära tkr-vävnadsprover för histologi, molekylär analys och mikrobiologi. I de 8″ PT-kontrollgruppen ” – patienterna erhölls biopsier från de 6 ni-PT-reaktiva och de 2 Ni-icke-reaktiva PT-områdena för histologi och molekylär analys. Egenskaperna hos de 45 patienterna sammanfattas i Tabell 1.

2.2. Patch Test (PT)

hos de 25 tkr-patienterna testades en europeisk standardserie med 30 kontaktallergener inklusive en Co, en Cr och en ni-beredning (Hermal, Reinbek, Tyskland) kompletterad med en metallallergenserie (Brial Allergen GmbH, Greven, Tyskland) samt en bencementkomponentserie vid cementerad artroplastik på patienternas rygg. Testberedningar applicerades i Finn chambers i 2 dagar och reaktioner utvärderades dagen för avlägsnande och 3 dagar efter applicering. Hos patienter med bencement-serietestning utfördes en ytterligare avläsning efter 1 vecka. Gradering av hudreaktionerna var som rekommenderas av den tyska Kontaktdermatitforskningsgruppen.

2.3. Lymfocyttransformationstest (LTT)

mononukleära celler i perifert blod (PBMC) erhölls från det hepariniserade blodet hos tkr-patienterna genom densitetscentrifugering på Ficoll-Hypaque (Phadia, Freiburg, Tyskland). Celler odlades i rpmi1640-medium (Biokrom, Berlin, Tyskland) kompletterat med autologt serum, glutamin, antibiotikum-antimykotisk lösning och icke-essentiella aminosyror. Alla kulturer utfördes i fyrdubbla i 96-brunnsplattor (Nunc, Roskilde, Danmark). Stimuli var pan T-cell mitogen phytohemagglutinin (PHA) 2,4 oc/ml, tetanustoxoid (TT) 5 oc/mL, NiSO4, CrCl3 och CoCl2 (7 koncentrationer vardera från till ) och odlingsmedium enbart som kontroll. Efter 5 dagar pulserades celler med 3h-tymidin över natten och proliferation bedömdes genom inkorporerad radioaktivitet. Stimuleringsindexet (SI) beräknades med förhållandet mellan medelantal per minut (cpm) stimulerade till ostimulerade kulturer. SI > 3 ansågs vara positivt.

2.4. Analys av peri-Implantatvävnad

hos de 25 tkr-patienterna erhölls vävnadsprover från den nybildade ledkapseln vid revisionstidpunkten. Minst 2 sonder skickades för mikrobiologisk utvärdering till Endoklinik Hamburg. De andra två sonderna bearbetades för histologi och en sond för molekylär analys. I de 12 oa-patienterna erhölls vävnadsprover vid tidpunkten för primär artroplastisk implantation för histologi och molekylär analys som ovan. De 8″ PT-control group ” – patienterna genomgick punchbiopsi av sina Ni-PT-områden på baksidan efter testläsning på D3. En sond vardera erhölls för histologi och molekylär analys.

2.5. Histologisk undersökning

de formalinfixerade vävnaderna bearbetades och färgades med hematoxylin-eosin. Immunohistologi utfördes med antikroppar mot T-cell (CD3), B-cell (CD20), makrofag (CD68 resp KP1) och neutrofila (CD15) antigener. Sektionerna undersöktes mikroskopiskt och den proportionella fördelningen av vävnadskomponenterna inklusive makrofager, diffus eller perivaskulär ackumulering av T – eller B-lymfocyter och plasmaceller samt det totala reaktionsmönstret för vävnadsprovet bedömdes semikvantitativt. Betygspoängen var enligt Krenn et al. och i fallet med de tkr-Patient härledda proverna användes konsensusklassificeringen. Denna konsensusklassificering delar upp peri-implantatvävnadsreaktionsmönstren i en partikeldominerad främmande kropp som svar (typ i), en granulocytdominerad infektiös typ (typ II), blandningen av typ i och II (kombinerad typ, typ III) och en paucicellulär och ganska fibrotisk reaktion (typ IV, likgiltig typ).

2.6. Molekylär analys

följande sonder erhölls i RNA-konserverande vätska för efterföljande analys: från var och en av de 25 tkr-patienterna och 12 oa-kontrollpatienter peri-implantat och subkutan vävnad (referens) sond; från kontrollgruppen för patch-test 6 ni-PT-positiva sonder och 2 sonder från Ni-icke-reaktivt testställe (referens).

totalt RNA isolerades från vävnadsprovet genom fenol/kloroformextraktion och omvänt transkriberades till cDNA genom användning av AMV-omvänt transkriptas. Uttrycket av följande cytokiner analyserades med semikvantitativ RT-PCR i Lightcycleren: IFNy, TNF, IL1-exportorienterade, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 och TGF exportorienterade. Expressionsvärdet bestämdes i jämförelse med den hushållande genen EF1-med hjälp av Baccarat – metoden av schmittgen och livak .

2.7. Jämförelse av pre-och postoperativ WOMAC-poäng

ett modifierat poängsystem har använts i enlighet med publiceringen av Roos et al. . Från och med grupperna i-och II-patienter var preoperativ Womac knäpoäng tillgänglig, kontaktade vi vidare patienter efter revisionskirurgi för att också få (minst 6 månader efter operationen) deras postoperativa WOMAC-poänginformation. Särskilt fokus lades på patienter med revision genom användning av” hypoallergena ” material.

3. Resultat och diskussion

Metallimplantatallergi är fortfarande en diagnos av uteslutning, med en fördröjning i diagnosen på grund av saknade sjukdomsspecifika kriterier och behov av att kombinera olika diagnostiska steg. Således ifrågasätts olika komplikationselitorer först i tkr-misslyckande och metallimplantatallergi diagnostiseras av en kombination av PT, LTT och histopatologi . Studien som presenteras här syftar till att stödja förbättring av diagnostiska verktyg.

3.1. Allergidiagnostik

inom de 20 patienterna med metallkänslighet visade 11 (Grupp I) PT-reaktioner på metaller (delvis flera reaktioner): 10 till Ni, 6 till Co, 2 till Cr, och en av dessa 11 patienter visade också PT-reaktioner på bencementkomponenter (till gentamicin och bensoylperoxid). I 6/11 var ytterligare LTT-data tillgängliga och visade 5x Ni-reaktivitet och 1 icke-reaktiv LTT. I de återstående 9 patienterna (grupp II) med negativ PT till implantatkomponenter men positiv LTT fann vi 9x LTT-reaktivitet mot Ni, 1x till Co. Dessa data sammanfattas i tabellerna 2-4. I flera studier har ökad metallkänslighet hittats hos patienter med artroplastik . I större skala, när man jämför 100 symptomfria till 200 komplicerade artroplastiska patienter, kunde en sådan ökad förekomst av metallallergi—särskilt mot Ni—reproduceras . De flesta data om in vivo-metallfrisättningsförhållanden härrör från höftartroplastiska patienter. Lokal Co-och Cr-frisättning ses emellertid också i TKR och respektive systemisk exponering av patienterna rapporteras . Dessutom kan också betydande ni-frisättning observeras hos CoCrMo-artroplastiska patienter . Övervägande av NI-allergi i våra patientgrupper kan således inte bara återspegla relativ övervägande av Ni-allergi i den allmänna befolkningen. Å andra sidan kan även symptomfria patienter med välpresterande knäartroplastik ha kutan metallallergi mot implantatlegeringsmetaller . Således, som Granchi et al. uppgav 2012 att närvaron av metallkänslighet kanske inte betyder implantatfel mekanism på den enskilda patientnivån.

3.2. Histologisk undersökning

vi undrade nästa om den periprostetiska vävnadsanalysen skulle hjälpa till att diskriminera hyperergisk vävnadssvar. För detta ändamål valdes fyra villkor för jämförande analys av vävnadsprov. Till exempel erhölls periprostetiska vävnadsprover från (1) De 20 tkr-patienterna med komplikationer och metallkänslighet (grupp i och II); (2) de 5 tkr-patienterna med komplikationer men ingen metallkänslighet (Grupp III); (3) 12 patienter med degenerativ knäledsjukdom/artros (OA-kontrollgrupp) vid primär artroplastik; och (4) de kutana biopsier som utfördes på PT-ställen hos 8 PT-patienter (PT-kontrollgrupp) av vilka 6 hade positiv, ekosematös PT-reaktion på Ni och 2 hade ingen PT-reaktion på Ni. Bedömningen av periprostetisk / (neo) kapselvävnadssvar gjordes enligt den standardiserade konsensusklassificeringen som ursprungligen publicerades av Morawietz et al. 2006 och reviderad av Krenn et al. . Dessutom fokuserades på närvaron av T-lymfocyter, B-lymfocyter, neutrofiler och makrofager—och dessutom skickades sonder av grupp I, II och III-patienter också till mikrobiologisk utvärdering. Flera oväntade fynd gjordes: 9/11 patienter i grupp i och 6/9 patienter i Grupp II hade en kollagenfiberrik bindväv som liknade periprostetisk vävnadsreaktion (typ IV/obestämd typ). Och endast 5 av de 20 metallkänsliga patienterna hade den övergripande bilden av den” slitpartikelinducerade typen ” med makrofagdominerat svar. Detta står i kontrast till den allmänna observationen av mestadels slitage partikel/främmande kroppssvar som vävnadsmönster i misslyckad artroplastik och till den enda 15% Typ IV (fibrotisk) responsreaktivitet i 370 prover analyserade av Morawietz et al. . Det fanns inga tecken på infektioner i dessa 20 prover av våra grupp i-och II-patienter. Trots att det är en dominerande ”artrofibros” – liknande, paucicellulär reaktivitet noterades närvaro av lymfocyter i perivaskulär eller spridd fördelning (figurerna 1(A) och 1(b)). Däremot visade två av de 5 patienterna utan metallkänslighet infektion och lymfocytisk inflammation sågs endast hos en av dessa patienter. Hos OA-patienter noterades igen lymfohistiocytiska infiltrat tillsammans med frånvaro av neutrofiler. Dessa resultat sammanfattas i tabellerna 2, 3 och 4. Figurerna 1 (A) och 1 (b) är representativa histologiska fynd hos patienter i Grupp I och II. biopsier från Ni-inducerade allergiska patchtestreaktioner kännetecknades av perivaskulära och ibland diffusa lymfohistiocytiska infiltrat tillsammans med kontaktallergi-typiska epidermala förändringar som visas i ett representativt prov(Figur 2 (a)). Witzleb et al. spekulerade att perivaskulär eller diffus närvaro av (T-)lymfocyter i periprostetisk vävnad kunde tolkas som hyperergiskt svar . I alla fall, von Domarus och kollegor beskrev t-lymfocytinfiltrering som ett vanligt fynd i vävnadsprover av hämtade aseptiskt lossade artroplaster av metall-på-polyeten. Således drar de slutsatsen att varken nekrobios eller infiltration av T-lymfocyter bör anses vara specifika för metallöverkänslighetsreaktion.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

(a) exempel på perivaskulär lymfocytisk infiltration; CD3 fläck. (b) exempel på spridda periprostetiska lymfocyter; CD3-fläck.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

(a) histologi av patchtest (PT) reaktion på Ni som visar perivaskulära t-lymfocytiska infiltrat, spridda eosinofiler och epidermala ”spongiotiska” förändringar. (b) relativt inflammatoriskt mediatoruttryck i biopsi av positiv PT-reaktion på Ni. Analys baserad på semikvantitativ realtid RT-PCR.

3.3. Cytokinuttrycksprofil

med tanke på de delvis ofullständiga publikationerna undrade vi nästa om bedömning av inflammatorisk mediatoruttryck kunde förbättra karakteriseringen av vävnadssvarsmönstret. I Figur 2 (b) visas cytokin-RNA-uttrycksmönstret för en akut pågående specifik kutan fördröjd överkänslighetsreaktion mot Ni. Viktiga fynd är den markerade uppregleringen av IFNy som typisk markör för Th1-svaret som stimulerar det cellulära immunsvaret och av IL-2 som indikerar T-cellaktivering och proliferation . Vid bedömning av grupperna av metall tkr-patienter med / utan metallkänslighet och OA-kontrollgrupp var sådan uppreglering av IFNy också särskilt synlig hos grupp i-patienter, till exempel TKR med komplikationer och patchtestreaktivitet mot metaller. Av de andra bedömda medlarna var IL-2-uttrycket i tkr – patienterna mer framträdande i grupp i och i OA-patientgrupp-och TGF-hawaiiuttryck något mer i grupp i och II. Detta är fallet även för IL-6 (i Grupp I och II) och en patient i Grupp II (patient med periprostetisk infektion). Dessa andra medlare visas inte eftersom det bara fanns en viss individuell ökning av TNF hos OA-patienter men ingen större skillnad mellan de olika grupperna. Ökat Th1-engagemang återspeglas av ökat IFNy-uttryck. Här fann vi markerad IFNy-uppreglering inte bara typiskt i de ni-inducerade PT-reaktionerna, utan särskilt också i grupp I tkr-patienter, vilket tyder på dess roll i periprostetisk sjukdomsprogression. Intressant nog rapporterade J Askorbmsen och kollegor nyligen att de hittade spridda CD3+ T-celler i gränssnittsvävnaden av aseptiskt lossad höftartroplastik med övervägande makrofagrelaterat slitagepartikelrespons. Men varken genom kvantitativ PCR eller genom immunhistokemi kunde de visa signifikant TH1 (nämligen IFNy) eller TH2 (IL-4) mediatoruttryck . Eftersom bortsett från IL-6 i synnerhet kan TGF-Macau spela en central roll i början och persistensen av periprostetisk, artikulär fibros , analyserade vi här dess respektive uttryck i de olika vävnadsproverna. Vi observerade en ökning av TGF-hawaiiuttryck i metallkänsliga tkr-patienter med emellertid interindividuella variationer. Figurerna 3 (A) -3(c) sammanfattar dessa resultat.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 3

(a) Cytokinuttryck av IFNy i vävnaderna hos de 5 olika patientgrupperna; cytokinuttryck analyserades i jämförelse med den hushållande genen EF-1 och till patientens kontrollvävnad med hjälp av AUC-CCT-metoden ; (Wilcoxon-Mann-Whitney-test gjort av SPSS statistisk programvara). (b) Cytokinuttryck av IL-2 i vävnaderna i de 5 olika patientgrupperna; cytokinuttryck analyserades i jämförelse med den hushållande genen EF-1 och till patientens kontrollvävnad med hjälp av Kazakct-metoden; (Wilcoxon-Mann-Whitney-test gjort av SPSS statistisk programvara). (c) Cytokinuttryck av TGF-Sackarios i vävnaderna hos de 5 olika patientgrupperna; cytokinuttryck analyserades i jämförelse med den hushållande genen EF-1 och till patientens kontrollvävnad med hjälp av aug-CCT-metoden (Wilcoxon-Mann-Whitney-test gjort av SPSS statistical software).

3.4. Jämförelse av pre-och postoperativ WOMAC-poäng

19 av de 20 tkr-patienterna svarade på vår begäran och slutförde en postoperativ Womac-poäng. 9 patienter rapporterade att vid revision hade en ”hypoallergen” tkr implanterats (8x Ti-baserad ytbeläggning, 1x oxiniumbaserat implantat). 8/9 patienter gjorde vinst från detta tillvägagångssätt, som visas i Figur 4. Hittills finns det endast fallrapporter eller små patientserier angående den potentiella nyttan av användningen av ”hypoallergen” TKR . Dessa resultat betonar dock behovet av uppföljningsstudier i större skala.

Figur 4

Womac-poäng före och efter revisionskirurgi hos 9 patienter som fick ”allergivänligt” material (8x Titan, 1x oxinium). Poängsystemet har använts i enlighet med publiceringen av Roos et al. .

det finns dock begränsningar i studien: fakta att periprostetiska vävnadsprover endast kan återspegla det faktiska stadiet i en dynamisk process och att OA-patienter kanske inte är lika bra en ”kontroll” som gränssnittvävnadsprober från patienter med väl fungerande implantat och det begränsade provantalet i dessa undersökningar. Således behövs ytterligare studier för att validera den multimodulära diagnostiska metoden vid metallimplantatallergi.

4. Slutsatser

denna studie visar för första gången potentialen att använda kombinerade analytiska steg för att ge ett tillvägagångssätt för att utveckla diagnostiska egenskaper hos metallimplantatallergi. Allergidiagnostik (PT och LTT) och periprostetisk histologi pekar på immunologiskt svar på implantatlegeringsmetaller och mönstret för inflammatoriskt mediatoruttryck bidrar till funktionell differentiering.

oväntade fynd var det dominerande ”fibrotiska” typ IV-gränssnittssvaret hos de metallsensibiliserade tkr-patienterna och det markerade IFNy-uttrycket hos de PT-positiva tkr-patienterna.

intressekonflikt

författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av detta dokument.

bekräftelser

denna studie stöddes av bidrag från Endo-Stiftung, Hamburg och bidrag från B Braun-Aesculap, Tuttlingen och Ludwig-Maximilians-University of Munich.