Radering av KDM6A, ett Histon-Demetylas som interagerar med MLL2,hos tre patienter med Kabuki-syndrom | Jumbuck

huvudtext

Kabuki-syndrom (KS; MIM 147920) beskrevs först 1981 av Niikawa och Kuroki,1, 2 och mer än 400 fall har rapporterats i litteraturen. De viktigaste kliniska egenskaperna är distinkta ansiktsdrag, utvecklingsfördröjning, mild till måttlig intellektuell funktionsnedsättning, tillväxthämning efter födseln och ytterligare funktioner inklusive skelettanomalier, hypodonti och ihållande fosterfingertoppkuddar. Jämförande genomisk hybridisering (CGH) mikroarrayanalys misslyckades med att upptäcka en återkommande anomali hos 72 ks-individer.3-8 användning av exome-sekvenseringsstrategin ledde nyligen till identifiering av mll2 (MIM 602113) mutationer som en viktig orsak till KS.9 i fem nyligen publicerade serier hittades mutationer i MLL2 hos 56% -76% av KS-patienterna.9-13

eftersom en betydande andel patienter inte har en detekterbar mll2-mutation, postulerade vi förekomsten av ytterligare gener associerade med KS. I strävan efter en annan ks-orsakande genetisk mutation screenades tio gener som interagerade med MLL2 hos 15 mll2-mutationsnegativa ks-individer, och inga patogena mutationer identifierades.11 En annan gen som kodar för ett mll2-interagerande protein, KDM6A (tidigare känt som UTX; MIM 300128), screenades i 22 mll2-mutationsnegativa ks-individer, och igen upptäcktes inga orsakande mutationer.13

genom att använda array CGH-analys (Agilent platform 244k) identifierade vi de novo XP11.3 mikrodeletioner i två belgiska mll2-mutationsnegativa ks-tjejer (patienter 1 och 2). Eftersom båda borttagningarna var de novo är de förmodligen patogena. Båda borttagningarna inkluderade antingen en del av eller alla KDM6A. Dessutom fanns inga kdm6a-borttagningar i en kohort med 411 normala kontroller i en tidigare studie.14 raderingen i patient 1 inkluderade KDM6A exons 21-29, som kodar för den terminala delen av den katalytiska domänen för KDM6A, och CXorf36, en gen som nyligen var inblandad i X-länkad autism.15 i patient 2 avlägsnades kdm6a, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) och FUNDC1 (Figur 1) fullständigt. Funktionerna för DUSP21 och FUNDC1 är fortfarande okända.

Region Xp11.3 som visar patienternas borttagningar

Region Xp11.3 visar borttagningarna från UCSC Genome Browser (GRCh37/hg19) för patienter 1, 2 och 3. De svarta fulla spåren representerar varje patients radering, och varje patients nummer ligger över hans eller hennes respektive spår. Raderingen i patient 1 spänner över 283,5 kb från bas 44,941,324 till bas 45,224,829, patient 2: s radering spänner över 815.7 kb från bas 44,377,858 till bas 45,193,629, och patient 3: s radering sträcker sig över 45,4 kb från bas 44,866,302 till bas 44,912,718. Generna i området noteras under raderingsspåren. CNV i databasen med genomiska varianter visas på bottenlinjerna. Det finns inga tidigare rapporter om ändringar av kdm6a-kopianummer.

vi sekvenserade sedan KDM6A genom Sanger-sekvensering och letade efter intragena raderingar eller duplikationer med en riktad Anpassad Agilent array CGH i en kohort av 22 MLL2-mutationsnegativa ks-individer (8 kvinnor, 14 män). I enlighet med de etiska reglerna för Institut de Pathologie et de Génétique etisk kommitté, med föräldrarnas samtycke erhölls för DNA-analys av alla deltagare i denna studie och för publicering av fotografier. CGH-mikroarraydata (kompletterande data, tillgängliga online) som diskuteras i denna publikation har deponerats i National Center for Biotechnology Information (NCBI)genuttryck Omnibus (GEO) 16 och är tillgängliga under anslutning GSE32567 (se anslutningsnummer avsnitt).

inga punktmutationer detekterades, men vi identifierade en de novo Intragen deletion (exons 5-9) hos en italiensk, manlig ks-individ (patient 3). Vi sekvenserade också UTY (MIM 400009), Y-kromosomen paralog av KDM6A (se nedan) och letade efter intragena deletioner eller duplikationer som nämnts ovan, men vi upptäckte inte några mutationer.

patienter 1 och 3 hade en typisk ks-fenotyp, inklusive långa palpebrala sprickor, lateral eversion av det nedre ögonlocket och måttlig till svår intellektuell funktionsnedsättning (Tabell 1 och figur 2). Även om ansiktsegenskaperna hos patient 2 inte var lika klassiska, visade hon många funktioner i denna sjukdom, inklusive ögonbryns laterala sparseness, långa ögonfransar, strabismus, långa palpebrala sprickor, stora och framträdande öron, ihållande fosterfingerspetsdynor, aortakoarktation, areolär fullhet i spädbarn och hirsutism. Hon presenterade en mild utvecklingsfördröjning och hade en normal verbal intelligenskvot (IQ) – poäng, en dålig prestanda IQ-poäng och hyperaktivt beteende (Tabell 1 och figur 2). Vi noterade att patienter 1 och 2 hade långa halluces (Figur 3).

ansiktsutseende hos drabbade individer

(a) Patient 1.

(B) Patient 2.

(C) Patient 3.

notera de långa palpebrala sprickorna hos patienter 1 och 2 och de välvda ögonbrynen hos patienter 1 (mild) och 3.

utseende av fötter hos drabbade individer

(a) Patient 1.

(B) Patient 2.

notera de långa hallucinerna hos båda patienterna.

således är kdm6a-borttagningarna hos dessa tre patienter associerade med ett brett fenotypiskt spektrum som sträcker sig från typiska ks-individer (patienter 1 och 3) till en mildare klinisk presentation (patient 2). Denna kliniska variabilitet är också en egenskap hos patienter med mll2-mutationer.13 de möjliga effekterna av cxorf36-deletion hos patient 1 och av cxorf36, dusp21 och FUNDC1-deletion hos patient 2 på deras respektive fenotyper bör dock också övervägas.

KDM6A (29 exoner) är en av de X-kromosomala generna som till stor del undgår X-inaktivering.17 Det kodar för ett 1 401 restprotein som innehåller två funktionella domäner. Den katalytiska domänen är ett Histon-demetylas som specifikt katalyserar demetylering av mono-, di-och trimetylerad lysin 27 på Histon H3 (H3K27).18,19 denna demetylering förmedlar vävnadsspecifikt uttryck av olika gener och är mest involverad i utvecklingsprocesser och cellcykeln.19-22 intressant verkar KDM6A och MLL2 tillsammans i den epigenetiska kontrollen av transkriptionellt aktivt kromatin genom att motverka Polycomb-grupp (PcG) proteiner.22 Den andra funktionella domänen för KDM6A spelar en roll i kromatinremodellering genom att interagera med switch/sackaros nonfermentable (SWI/SNF) remodeling complex som innehåller transkriptionsaktivatorn Brg1.23

liksom MLL2 spelar KDM6A en roll i embryogenes och utveckling. Homozygot dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) Drosophila mutanter manifesterar grova ögon, dysmorfa vingar och modifiering av könskammarna.21 denna fenotyp liknar trithorax-fenotypen, vilket ytterligare stöder uppfattningen att KDM6A motverkar PcG-förtryck.21 dessutom UTX – 1 (C. elegans KDM6A ortholog) kan påverka utvecklings öde beslut i C. elegans vulval prekursorceller via transkription reglering av gener som kodar för retinoblastom (RB) proteinkomplex, som har bevarats från maskar till människor.20 Kdm6a1 är också viktigt för uttrycket av bakre HOX-gener i zebrafisk.19 dessutom spelar KDM6A tillsammans med MLL2 en viktig roll i regleringen av muskelspecifika gener under embryogenes.22,24 slutligen rekryterar medlemmar av en annan viktig utvecklingsgenfamilj (t-boxgener, som verkar i mesodermen vid bildandet av hjärtat och ryggkotorna) kdm6a för att aktivera sina målgener, och betonar återigen KDM6AS roll i utvecklingsprocesser.23 intressant är att de flesta av de patogena mutationerna för rapporterade T-box-gener i mänskliga sjukdomar finns i T-box-domänen som interagerar med KDM6A.23

KDM6A undviker X-inaktivering, 17 men det har föreslagits att hos möss är kdm6a-uttryck från den inaktiva X-kromosomen signifikant lägre än den från den aktiva X-kromosomen.25 Kdm6a-uttryck är högre i den vuxna hjärnan, den vuxna levern och specifika utvecklande hjärnregioner hos kvinnor än hos män.25 UTY är paralogen av KDM6A på Y-kromosomen.17 UTY har 84% aminosyrasekvenslikhet med KDM6A och kan kompensera för det ökade uttrycket av KDM6A hos kvinnor, trots det faktum att demetylasaktivitet ännu inte har visats för denna KDM6A paralog.14,25

det är inte förvånande att hitta en annan gen associerad med KS på X-kromosomen eftersom det har rapporterats om KS-liknande patienter med små ring X (r) kromosomer.26-34 dessutom finns det en tydlig överlappning mellan de medfödda hjärtfel som förekommer hos manliga KS-patienter (aortakoarktation och andra vänstersidiga hinder) och de som finns hos patienter med monosomi X och r(X) kromosomer.28,35 små r(X) kromosomer leder vanligtvis till Turners syndrom genom fullständig inaktivering av r (X). Det är dock oklart varför vissa individer utvecklar en KS-liknande fenotyp. Ofullständig X-kromosominaktivering och det efterföljande uttrycket av vanligtvis undertryckta gener har föreslagits som en förklaring till KS-fenotypen hos vissa R(X) patienter.32-34 KDM6A raderades hos de tre patienterna som hade både en KS – liknande fenotyp och en r(X) där brytpunkterna hade kartlagts; detta resultat överensstämmer med hypotesen att kdm6a-radering spelar en viktig roll i KS-liknande fenotyp observerad hos vissa patienter med en r(X).30,32,34 vi kunde inte bevisa haploinsufficiency för KDM6A hos patienter 1 och 2 eftersom kdm6a-uttrycket var mycket lågt i perifera blodlymfocyter (data visas inte). Icke desto mindre har studier visat att två kopior av Kdm6a är nödvändiga för normalt uttryck i kvinnliga musembryon och vuxna möss,25 vilket tyder på att haploinsufficiency kan vara den patogena mekanismen. Denna förklaring skulle emellertid inte redogöra för det faktum att 45,X och andra r(X) patienter med en kdm6a-radering inte alla utvecklar Kabuki-fenotypen.

hos patienter 1 och 2 är de molekylära X-inaktiveringsförhållandena starkt sneda och är 89:11 respektive 97:3. X-inaktiveringsprofilen bestämdes via PCR-amplifiering av CAG-upprepningen i exon 1 av androgenreceptorgenen före och efter DNA-digestion med HpaII och CfoI. För att avgöra om den raderade kopian av KDM6A var belägen på den aktiva eller inaktiva X-kromosomen, utförde vi fluorescens in situ hybridisering (FISH) analys med en KDM6A-sond på X-kromosomerna som hade märkts differentiellt genom införlivandet av 5-bromo-2′ – deoxyuridin (5-BrdU). Resultaten visade att den raderade kopian av KDM6A var belägen på den inaktiva X-kromosomen i alla de 70 mitoser som analyserades hos båda patienterna (Figur 4). Det faktum att KDM6A undviker X-inaktivering17 antyder att fytohemagglutinin (PHA)-stimulerade lymfocyter som har en borttagen kopia av KDM6A på den inaktiva X-kromosomen har en överlevnadsfördel jämfört med cellinjer som har en borttagen kopia av KDM6A på den aktiva X-kromosomen. Detta förslag är i linje med hypotesen att även om KDM6A undviker X-inaktivering, är dess uttryck lägre från den inaktiva X-kromosomen än från den aktiva X-kromosomen.25

bild av FISKSTUDIE på X-kromosomer differentiellt märkta med 5-BrdU

en bild av en FISKSTUDIE visar X-kromosomer differentiellt märkta genom införlivandet av 5-BrdU. Den inaktiva X-kromosomen (i den vita cirkeln) verkar ljusare än den aktiva X-kromosomen. Xqter subtelomera sonder hybridiserar till båda X-kromosomerna (blå pilar). Kdm6a-signalen (vit pil) saknas från den inaktiva X-kromosomen och är närvarande på den aktiva X-kromosomen. För detta experiment stimulerades perifera blodlymfocyter från patienter 1 och 2 med fytohemagglutinin och odlades i 72 timmar. för att identifiera den senreplikerande inaktiva X-kromosomen behandlade vi cellerna med 5-BrdU (30 oc/ml) 5 timmar före skörden. Colcemid tillsattes sedan till en koncentration av 0,2 occurg / ml, och 1 timme senare framställdes metafaspreparat via standardprocedurer som involverade svullnad i 75 mM KCl och fixering i 3:1 metanol/ättiksyra. Vi utförde FISH-analys genom att samtidigt använda en subtelomer xqter-sond märkt med SpectrumOrange (Vysis) för att indikera X-kromosomerna (blå pil) och RP11-435k1 märkt med SpectrumOrange (AmpliTech) för att skilja mellan de borttagna och icke-borttagna X-kromosomerna (vit pil). För att underlätta detektering av inkorporerad 5-BrdU, denaturerade vi cellulärt DNA i 2n HCl i 30 minuter vid 37 C. C. 5-BrdU märktes sedan med en 5-BrdU-specifik monoklonal antikropp konjugerad till fluorescein (Roche) (1 occolg/ml). Slutligen motsatte vi DNA genom att applicera en antifade-lösning innehållande 0.1 kg / ml DAPI.

UTYS roll är i stort sett okänd och den har ingen in vitro-demetylasaktivitet. Upptäckten av en manlig ks-individ (patient 3) med en Intragen deletion av KDM6A och med klinisk svårighetsgrad som liknar den hos patient 1 antyder att UTY delvis kan kompensera för förlusten av KDM6A hos manliga individer, som tidigare föreslagits i litteraturen.25

när det gäller MLL2 har somatiska homozygota och hemizygota mutationer i KDM6A identifierats i olika cancertyper (multipelt myelom, esofageal skivepitelcancer, njurcellscancer, myeloid leukemi, bröstcancer, kolorektal cancer och glioblastom), vilket tyder på att KDM6A är en tumörundertryckande gen.14 icke desto mindre är cancer inte ett viktigt inslag i KS, med tanke på att denna komplikation har rapporterats hos endast sju ks-patienter36,37 (akut lymfoblastisk leukemi, Burkitt lymfom, fibromyxoid sarkom, synovial sarkom och hepatoblastom rapporterades en gång och neuroblastom rapporterades hos två ks-individer).35,36 om förlust av båda allelerna är tillräcklig för att orsaka cancer, kan man förvänta sig att cancer uppträder oftare i KS, såsom i retinoblastom (MIM 180200) eller Wilms tumör (MIM 194070). Detta antyder antingen att förlust av den andra allelen i MLL2, KDM6A eller UTY är nödvändig men inte tillräcklig för cancerutveckling eller att denna komplikation är undererkänd, vilket visar vikten av Naturhistoriska studier i sällsynta syndrom.37

följande histonmetylaser och histondemetylaser har varit inblandade i andra syndrom med flera anomalier: EHMT1( MIM 607001; Kleefstra syndrom ), SETBP1( MIM 611060; Schinzel-Giedion syndrom ), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensen-typ, X-länkat mental retardationssyndrom ), PHF8 (MIM 300560; Siderius-typ, X-länkat mental retardationssyndrom) och MLL2 i KS. Identifieringen av kdm6a-patogena mutationer hos KS-patienter utvidgar rollen för histonmodifieringsfaktorer vid intellektuell funktionsnedsättning och medfödd missbildning.

Sammanfattningsvis rapporterar vi kdm6a-mutationer som orsak till KS hos en hane och två kvinnor. Våra resultat bekräftar både ks genetisk heterogenitet och ett locus på X-kromosomen, som har föreslagits tidigare. Eftersom vissa ks-patienter var negativa för MLL2, KDM6A och UTY-sekvensering och inte visade raderingar eller dupliceringar under screening, är det troligt att andra KS-associerade gener återstår att upptäckas.