introduktion
bioteknik använder mikroorganismer såväl som högre celler och deras aktiva principer i syfte att uppnå önskvärda omvandlingar av olika substrat (Tripathi et al., 1997). L-fenylacetylkarbinol är utgångsmaterialet för kemisk syntes av L-efedrinhydroklorid och pseudoefedrin farmaceutiska föreningar som används som decongestant, antiasthmatics (Shin och Rogers, 1995) och nyligen rapporterade, används i fetma kontroll (Astrup et al., 1992). Aromatiskt substrat bensaldehyd kommer att ge L-PAC genom biotransformationsmetod. Vissa jäststammar har pyruvatdekaroxylas (PDC) och alkoldehydrogenas (ADH) enzymer som producerar L-PAC och bensylalkohol, en biprodukt, respektive från bensaldehyd (Nikolova och Ward, 1991). Biotransformationspotentialer hos de växande cellerna fria skördade celler immobiliserade celler och isolerade råa såväl som renade enzym har bee n studerats omfattande (Liew et al., 1995; Shin och Rogers, 1996a, b).
rollen av nya stammar i biokonversionen är en viktig aspekt. L-PAC-produktion studerades av fria och immobiliserade celler av saccharomyces cerevisiae under olika tillväxt-och biotransformationsbetingelser. Men vi har studerat l-PAC-produktion från bensaldehyd genom att använda olika nya stammar under olika tillväxt-och biotransformationsmetoder för att övervaka de ideala förhållandena som möjliggör maximal produktutbyte vid konstant substratkoncentration och celldensitet. L-PAC-produktion anges i Schema 1.
| schema 1: | |
material och metoder
produktion av L-fenylacetylkarbinol med normala celler av Sccharomuces Cerevisiae (BY)
produktion av L-Pac (en viktig mellanprodukt för många läkemedel) från bensaldehyd med jäst är den potentiella vägen i Jäsningsindustrin för produktion av efedrin och andra läkemedel. Den aktuella studien genomfördes av författaren i Sultan-Ul-Uloom college of Pharmacy, som ligger i Hyderabad, Indien år 2004.Lagerkulturen av bakersjäst var nyligen subkulturerad (Ellaiah och Krishna, 1987) på färska sterila YEMA-medelhöjder och inkuberades vid rumstemperatur (ca 28 kcal C) för 36 h. således användes 36 h-kulturen för skörd. Kulturen av bakersjäst skördades genom att skaka i 5 mL sterilt vatten. Skördad mikrobiell suspension överfördes till Inokulatmedium-I. sammansättningen av inokulatmediet är som följer:
kolven inkuberades vid 28 CCB på en roterande shaker (180 RPM) i 24 timmar.
det mikrobiella antalet gjordes med hjälp av Neubauer räkningskammare. Den mikrobiella suspensionen späddes så att varje mL suspension innehöll 200×106 celler. Tio milliliter inokulum från IM-i överfördes till 100 mL inokuleringsmedium-II who: s sammansättning anges nedan:
kolvarna inkuberades på en roterande skakare (180 RPM) under 16 h.
ett hundra milliliter produktionsmedia bereddes. I det mesta av studien användes melassmedium som ett produktionsmedium och för jämförelsestudie användes sockerrörsaftmedium med urea som ett produktionsmedium. Tio milliliter inokulum från IM-II överfördes till produktionsmedia vars sammansättning är densamma som IM-II och inkuberades för 9 h på roterande shaker. Vid 9 timmar tillsattes näringsämne (20 mL 50% melass) till melassproduktionsmedium och näringsämne (20 mL 50% sockerrörsjuice) till sockerrörsproduktionsmedium respektive inkuberades på roterande skakare. Från 10 h framåt 0.6% destillerad bensaldehyd tillsattes i 6 uppdelade doser med en halvtimme intervall till produktionsmedium.
sedan inkuberades kolvarna på den roterande skakan i 24 timmar. kolvarna innehållande 130 mL buljong (dvs 100 mL produktionsmedium+10 mL inokulum+20 mL näringsmedium) behandlades med 130 mL bensen (lösningsmedel) och skakades i l5 min i separerande trattar. Därefter separerades det organiska skiktet och filtrerades genom absorberande bomull. Slutligen destillerades lösningsmedlet bensen för att få l-PAC-produkt.
produktion av L-fenylacetylkarbinol med nya Jästisolat:
förfaranden för Biokonversion:
i jämförande studier användes de nya kulturerna för att uppskatta och jämföra deras biotransformationspotential med bakersjäst. Stamkulturerna av Candida pseudointermedia MTCC nr 6225, Candida pseudountermedia MTCC nr 6352 och Issatchenkia orientalis MTCC nr 6351 odlades aseptiskt på Strile YEMA-snedställningar med steriliserad överföringsslinga i det sterila området (laminärt luftflöde).
tidigare nämnda förfarande (Ellaiah och Krishna, 1987) upprepades också för de nya stammarna. I de flesta av studien melass medium användes som produktionsmedium och för jämförande studie sockerrör juice medium med urea (Kaur och Kocher, 2002) användes som produktionsmedium.
resultat och diskussion
L-Fenylacetylkarbinol är en gul färgvätska. Den rapporterade specifika gravitationen är 0,93 vid rumstemperatur. L-PAC producerad av isolat inklusive bagare jäst (S. cerevisia) visade samma specifika gravitationsvärde. pH-värdet för L-PAC (1: 1-förhållandet mellan l-PAC-prov och vatten) rapporteras som 3,84. I detta experiment l-PAC-produkten erhållen genom biotransformation av fyra olika jäst som bakersjäst, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) och issatchenkia orientials (6351) visade samma pH-värden. Rf-värdet av L-PAC rapporterades (Groger och Erge, 1965) i kloroform som mobil fas på silikageljodångor användes för detektering av fläckar.
vid utveckling av kromatogram jämfördes kloroform som ett främre lösningsmedel med lösningsmedelsblandning (30% etylacetat 70% hexan) som mobil fas. Den senare lösningsmedelsfronten visade bättre separation än kloroform. Så vi använde 30% etylacetat och 70% hexan som lösningsmedelsfront i alla våra experiment.
L-PAC är reaktivt i UV-ljus, jodångor och även förkolning av metoxinaftalen. Rf-värdet för standard L-PAC är cirka 0,33. L-PAC-produkt av olika isolat visade samma Rf-värde.
metylketonen närvarande i L-PAC genomgår idoformreaktionen (Smith och Hendlin, 1954). Det genomgår initialt halogenering och klyvning i närvaro av alkali som NaOH för att ge upphov till Idoform. Denna reaktion är mycket specifik för L-PAC och förekommer inte med biprodukter. L-PAC producerad av olika isolat gav upphov till Idoform.
genom polarimetriska och kolorimetriska uppskattningar uppskattades procentuell biokonversion i olika jästisolat. Andra fermenteringsprodukter (t.ex. bensylalkohol, bensoesyra såväl som okonverterad bensaldehyd analyserades med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och gaskromatografi (GC). Den kemiska strukturen av L-PAC identifierades och överensstämde med 1H NMR och UV-spektraldata.
flera arbetare (Ellaiah och Krishna, 1987) genomförde jäsning i melass som produktionsmedium, utöver det i industrin använder melassmedium för biokonverteringsreaktion i L-PAC-produktionen.
i den aktuella undersökningen försökte vi sockerrörsjuice som produktionsmedium i L-PAC-produktion. Sockerrörsjuice med 0,25% urea användes som produktionsmedium vilket gav mer produkt av L-PAC än melass. Utöver denna produkt extraktion från sockerrör juice medium var mycket bekvämt än från melass mediet. % Biokonversion erhållen med olika jästisolat visas i Tabell 1.
Biotransformationspotential för fria celler av bakersjäst (S. cerevisiae) studerades i både melass och sockerrörsjuice som produktionsmedium. I melass observerades medium 25% biokonversion där som i sockerrörsjuice observerades medium 28% biokonversion.
| Tabell 1: | omvandling av melass och sockerrörssaft som produktionsmedia vid produktion av L-PAC |
biotransformationspotential för fria celler av Candida pseudointermedia MTCC nr 6225 studerades i både melass och sockerrörsjuice som produktionsmedium. I melass observerades 23, 43% biokonversion där som i sockerrörssaftmedium 23, 75% biokonversion observerades.
Biotransformationspotential för fria celler av Candida pseudointermedia MTCC nr. 6352 studerades i både melass och sockerrörsjuice som produktionsmedium. I melass observerades 33, 47% biokonversion där som i sockerrörssaftmedium 48, 76% biokonversion observerades.
Biotransformationspotential för fria celler av Issatchenkia orientalis MTCC nr 6351 studerades i både melass och sockerrörsjuice som produktionsmedium. I melass observerades 37, 16% biokonversion där som i sockerrörssaftmedium 60, 61% biokonversion observerades.
slutsats
Sammanfattningsvis föreliggande förfarande för användning av nya stammar av jäst från naturliga källor för biotransformationsstudier undersöktes och användes för biokonvertering av bensaldehyd till L-PAC. Tre stammar isolerades från olika naturliga källor som blackdruvor, datum frukt och sockerrör juice och identifierades vid Institute of Microbial Technology, Chandigarh. Dessa tre stammar betecknades som Candida pseudointermedia MTCC nr 6225 (BGY), Issatchenkia Orientals MTCC nr 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC nr 6352 (SCY).Vilket kommer att vara ett viktigt komplement till de nuvarande befintliga förfarandena. De viktigaste resultaten av den nuvarande forskningen är användningen av 3 nya jäststammar för produktion av L-PAC och användningen av sockerrörsjuice som produktionsmedium för produktion av L-PAC. Vi är framgångsrika i båda försöken och det finns en betydande ökning av den procentuella avkastningen av L-L-PAC när sockerrörsjuice användes som produktionsmedium. Även om sockerrörsjuice är dyr jämfört med melass, visade sig extraktionsförfarandet vara mycket lättare med sockerrörsjuice jämfört med melass. Ytterligare forskningsmetoder som olika faktorer,immobiliseringsstudier, mutationsstudier etc., kan hjälpa till att fastställa de kostnadseffektiva metoderna för produktion av L-PAC genom att använda sockerrörsjuice som produktionsmedium. Detta är den första rapporten om användning av Candida pseudointermedia och Issatchenkia orientalis för biokonversionsstudier av bensaldehyd till L-PAC. Användning av sockerrörsjuice som produktionsmedium i biotransformationsstudier av bensaldehyd till L-PAC är också den första rapporten i sitt slag. Dessutom visade sockerrörsjuice ökad biokonversionspotential än melassmedium. De nya stammarna vi kan utforska för de olika kemiska reaktionerna. Ytterligare studier i denna riktning pågår.
bekräftelser
författarna är tacksamma för IMTECH, Chandigarh för att identifiera de nya stammarna och tilldela MTCC-numren.
