rening och karakterisering av asparaginas från Phaseolus vulgaris frön

Abstrakt

L-asparaginas från bakterier har använts vid behandling av akut lymfoblastisk leukemi. Syftet med denna studie var att rena och karakterisera L-asparaginas från Phaseolus vulgaris frön istället för mikrobiella källor. L-asparaginas renades till uppenbar homogenitet. Enzymet har en molekylvikt på 79 kDa. Det renade asparaginaset hade mycket låg aktivitet mot ett antal asparagin-och glutaminanaloger. L-asparaginas var fritt från glutaminasaktivitet. Kinetiska parametrar, Km och Vmax av renat enzym, befanns vara 6,72 mM respektive 0,16 kcal. Enzymet hade optimalt pH vid 8,0. Enzymet visade hög stabilitet vid alkaliskt pH (pH 7,5–9,0) när det inkuberades i upp till 24 h. L-asparaginas hade samma temperatur optimal och termisk stabilitet vid 37 kcal C. K+ kunde kraftigt förbättra aktiviteten av asparaginas med 150% jämfört med andra testade metaller. Sammanfattningsvis visade L-asparaginas ingen glutaminasaktivitet och god stabilitet över ett brett spektrum av fysiologiska tillstånd, och därmed kunde den användas som en potentiell kandidat för behandling av akut lymfoblastisk leukemi.

1. Inledning

L-asparaginas (l-asparagin amidohydrolas E. C. 3.5.1.1) används vid behandling av akut lymfoblastisk leukemi och icke-Hodgkins lymfom . Användningen av L-asparaginas i cancer mot cancer är baserad på dess förmåga att klyva L-asparagin, en aminosyra som är väsentlig för lymfoblasts tillväxt, till ammoniak och L-asparaginsyra i serum och cerebrospinalvätska, eftersom lymfoblaster inte kan producera endogen L-asparagin vilket leder till döden av dessa celler . De flesta cancercellerna är beroende av en exogen källa till denna aminosyra för överlevnad. Normala celler kan emellertid syntetisera L-asparagin och påverkas sålunda mindre av dess snabba utarmning på grund av behandling med detta enzym. L-asparaginas kan också användas för att minska bildningen av akrylamid i stekt och ugnskokta livsmedel, särskilt i potatischips . Bildningen av akrylamid tillskrevs reaktionen av fri asparagin och reducerande sockerarter . Utarmningen av asparagin genom asparaginas förhindrade akrylamidbildning .

L-asparaginas distribueras i stor utsträckning bland växter, djur och mikroorganismer . I växt upptäcktes detta enzym först i de utvecklande frön av Lupinus albus . Asparaginas har också renats från testa av mogna frön av L. polyphyllus . Två former av enzymet har identifierats. En K + – oberoende form finns i L. arboreus och L. polyphyllus och en K+-beroende form finns i Pisum sativum och flera andra baljväxter, inklusive andra Lupinusarter . Arbete med antikroppar mot den k + – oberoende formen från L. polyphyllus avslöjade ingen korsreaktion med antingen ärtasparaginas eller ett antal sorter av Lupinus innehållande det k+-beroende enzymet, vilket tyder på att de två formerna av asparaginas är immunologiskt distinkta .

mycket lite information har rapporterats om användning av växt asparaginas vid behandling av akut lymfoblastisk leukemi . Därför var huvudmålet med denna studie att rena och karakterisera L-asparaginas från Phaseolus vulgaris frön fria från L-glutaminas istället för L-asparaginas från mikrobiella källor som används som cancer mot cancer och orsakade biverkningar på grund av dess immunologiska svar.

2. Material och metoder

2.1. Växtmaterial

mogna frön från Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 erhölls från Agricultural Research Center, Kairo, Egypten.

2.2. Rening av asparaginas

2.2.1. Råextrakt

råextraktet av asparaginas framställdes genom homogenisering av 50 g frön från Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 i 20 mM Tris-HCl-Buffert, pH 8,0 innehållande 10% glycerol, 50 mM KCl, 12,5 mM Bisexuell-merkaptoetanol och 1 mM PMSF. Homogenatet centrifugerades vid 10,000 xnumx kg och supernatanten betecknades som råextrakt. Det råa extraktet koncentrerades genom dialys mot fast sackaros.

2.2.2. Deae-Sepharoskolonn

koncentrerat råextrakt applicerades på en deae-Sepharoskolonn (15 1,6 cm i.d.) som tidigare jämvikts med 20 mm Tris-HCl-Buffert, pH 8,0. Enzymet eluerades av olika koncentrationer av KCl framställda i samma buffert vid en flödeshastighet av 60 mL/h och 3 mL fraktioner uppsamlades. Tre toppar av protein eluerades med asparaginasaktivitet enligt elueringsordningen (asparaginaser I, II och III).

2.2.3. Sefakryl S-200

asparaginas i med högsta aktivitet applicerades på en Sefakryl s-200-kolonn (90 kcal 0.6 cm i.d. ) som tidigare jämvikts med samma buffert vid en flödeshastighet av 30 mL/h och 3 mL fraktioner uppsamlades.

2.3. Asparaginasanalys

aktiviteten av L-asparaginas mättes med modifierad metod för Wriston . L-asparaginas katalyserar L-asparagin till L-asparaginsyra och ammoniak och den senare reagerar med Nesslers reagens för att producera en orangefärgad produkt. Enzymanalysblandningen bestod av 900 MIKL nyberedd L-asparagin (20 mM) i 50 mM Tris-HCl-Buffert (pH 8,0), 50 mM KCl och 100 MIKL råextrakt av enzymet. Reaktionsblandningen inkuberades vid 37 kg C i 30 minuter och reaktionen stoppades genom tillsats av 100 kg 15% triklorättiksyra. Reaktionsblandningen centrifugerades vid 10,000 xnumx kg för 5 min vid 4 xnumx xnumx C för att avlägsna fällningarna. Ammoniaken som släpptes ut i supernatanten bestämdes med kolorimetrisk teknik genom att tillsätta 100 occl Nesslers reagens i provet innehållande 100 occl supernatant och 800 occl destillerat vatten. Innehållet i provet vortexerades och inkuberades vid rumstemperatur i 10 min och OD mättes vid 425 nm. Ammoniaken som framställdes i reaktionen bestämdes baserat på standardkurvan erhållen med ammoniumsulfat. En enhet av L-asparaginasaktivitet definieras som mängden av enzymet som frigör 1 msk ammoniak per minut vid 37 msk C.

2,4. Proteinbestämning

Protein kvantifierades med metoden för Bradford med bovint serumalbumin som standard.

2.5. Molekylvikt bestämning

den ursprungliga molekylvikten bestämdes av Sephacryl S-200. Kolonnen kalibrerades med cytokrom C (12.400), kolsyraanhydras (29.000), bovint serumalbumin (67.000), alkoholdehydrogenas (150.00 Dextran blue (2 000 000) användes för att bestämma void volume (Vo). Subenhetens molekylvikt uppskattades med SDS-polyakrylamidgelelektrofores . SDS-denaturerad fosforylas b (94 000), bovint serumalbumin (67 000), ovalbumin (43 000), kolsyraanhydras (30 000), sojaböna trypsininhibitor (20 000) och bisexuell-laktalbumin (14 200) användes för kalibreringskurvan.

2.6. Karakterisering av asparaginas

2.6.1. Substratspecificitet

Asparaginasaktivitet bestämdes med vissa analoger av L-asparagin. Den relativa aktiviteten uttrycktes som procentandelen av enzymaktiviteten bestämd mot olika strukturanaloger av L-asparagin till enzymaktivitet med L-asparagin.

2.6.2. Kinetiska parametrar

värdena för Michaelis-konstanter (Km) och maximal hastighet (Vmax) bestämdes med användning av L-asparagin som substrat i intervallet 2-20 mm. kinetiska parametrar bestämdes från Lineweaver-Burk-plot.

2.6.3. Effekt av pH

det optimala pH-värdet för asparaginasaktiviteten bestämdes genom att analysera aktiviteten vid olika pH-värden. PH-stabiliteten testades genom inkubation av enzymet vid pH av 5,0–9,0 för 24 h vid 4 C i frånvaro av substrat och restaktivitet bestämdes under standardanalysförhållandena.

2.6.4. Effekt av temperatur

den optimala temperaturen för asparaginasaktivitet bestämdes genom analys av enzymet vid olika temperaturer. Värmestabilitet mättes genom att inkubera enzymet ensamt vid olika temperaturer under 1 h. efter värmebehandling kyldes enzymlösningen och restaktiviteten analyserades efter tillsats av substraten.

2.6.5. Metalljoneffekt

effekterna av olika metalljoner på enzymaktivitet bestämdes genom att preinkubera enzymet ensamt med 10 mM metalljoner i 15 minuter före tillsats av substratet. Aktiviteten som analyserades i frånvaro av metalljoner togs som 100%.

3. Resultat och diskussion

resultaten av reningssteg av asparaginas från P. vulgaris sammanfattas i Tabell 1. Elueringsprofilen för kromatografin på deae-Sepharoskolonnen (Figur 1) visade tre toppar av proteiner med asparaginasaktivitet. Topp ett med den högsta asparaginasaktiviteten applicerades på en Sephacryl s-200-kolonn (Figur 2). L-asparaginas i renades 21,7 gånger med en specifik aktivitet 846 enheter/mg protein. Asparaginas i visade sig vara ren efter Sephacryl s-200-kolumnen enligt SDS-PAGE (Figur 3). Molekylvikten av asparaginas i genom Sefakryl S-200 och SDS-PAGE-procedurer gav ett värde av 79 kDa som monomersubenhet. Detta fynd överensstämmer med molekylvikter för asparaginaser från Vigna unguiculata (70 kDa) och Lupinus polyphyllus (75 kDa) . En medelmolekylvikt på 58 kDa detekterades för asparaginas från ärtblad . För bakteriella asparaginaser varierade molekylvikten från 140 till 160 kDa med tetramersubenheter . En mycket låg molekylvikt på 11,2 kDa detekterades för Streptobacillus sp. KK2S4 asparaginas .

Figur 1

en typisk elueringsprofil för kromatografi av asparaginas från P. vulgaris på deae-Sepharose-kolonnen (15 1,6 cm i.d.) tidigare jämvikts med 20 mM Tris-HCl-Buffert, pH 8,0 vid en flödeshastighet av 60 mL / h och 3 mL fraktioner.

Figur 2

gelfiltrering av asparaginas I från DEAE-Sepharose fraktion på Sephacryl s-200 kolonn (90 1,6 cm i.d.). Kolonnen jämvikts med 20 mM Tris-HCl-Buffert, pH 8,0 vid en flödeshastighet av 30 mL/h och 3 mL fraktioner.

Figur 3

SDS-sida för homogenitet och molekylvikt bestämning av asparaginas i från Phaseolus vulgaris. (1) proteinmarkörer; (2) Sefakryl S-200 asparaginas I.

substratspecificiteten för asparaginas i har undersökts med användning av ett antal asparagin-och glutaminanaloger (Tabell 2). Aktiviteten med L-asparagin betraktades som 100% aktivitet. DL-asparagin uppvisade 30% av enzymaktiviteten, där DL-asparagin består av en 1 : 1 racemisk blandning. D-asparagin, L-asparaginsyra och l-glutaminsyraanaloger hade mycket låg aktivitet mot asparaginas I. ingen aktivitet detekterades i närvaro av L-glutamin. Därför är asparaginas i från P. vulgaris fri från glutaminas. Föroreningen av asparaginas med glutaminasaktivitet orsakade biverkningar under behandling mot cancer . L. arboreus asparaginas hydrolyserade endast L-asparagin och DL-aspartylhydroxamat . V. unguiculata-asparaginas var specifikt för L-asparagin, hydrolyserade inte D-asparagin och var inte specifikt för L-glutamin .

kinetiska parametrar, Km och Vmax av renat enzym, befanns vara 6,72 mM asparagin respektive 0,16 oc/m ammoniak / mL (Figur 4). Liknande Km-värden på 6,6 och 7,0 mM bestämdes för asparaginaser från L. arboreus respektive L. angustifolius . Asparaginas från Lupinusfrön har hög Km för asparagin (12,2 mM) . Låg Km (1.2 mM) bestämdes för asparaginas från V. unguiculata . För bakterier var Km-värdena för L-asparaginas från Escherichia coli och Erwinia carotovora 3,5 respektive 7,14 mm.

Figur 4

Lineweaver-Burk plot avseende asparaginas I från P. vulgaris hastigheter till olika l-asparaginkoncentrationer.

asparaginas i uppvisade pH optimalt vid 8,0 (Figur 5). Mellan pH 6,0 och 9,0 behölls mer än 50% av dess aktivitet. Även om maximal aktivitet vid fysiologiskt pH är en av förutsättningarna för L-asparaginas för antitumöraktivitet, skulle det renade enzymet vara användbart eftersom 80% av enzymaktiviteten bibehölls vid pH 7, 5. Enzymet visade stabilitet vid alkaliskt pH (pH 7,5–9,0) eftersom det behöll 90% av sin ursprungliga aktivitet när den inkuberades upp till 24 timmar (Figur 6). PH-optimumet för L-asparaginaser från flera växter varierade emellertid från 8,0 till 8,5 . De flesta av L-asparaginaser från bakterier visade alkaliskt pH optima (8,0–10) .

Figur 5

pH optimalt av asparaginas i från P. vulgaris. Enzymaktiviteten mättes vid olika pH: er med användning av standardanalysmetoden som tidigare beskrivits.

Figur 6

pH-stabilitet av asparaginas i från P. vulgaris vid olika pH efter inkubation för 24 h vid 4 kcal C.

asparaginas i befanns ha en optimal temperatur vid 37 kg c (Figur 7). Liknande temperatur optimal för asparaginas från V. unguiculata (40 kcal C) rapporterades . Denna temperatur liknade också den som rapporterades för Pseudomonas aeruginosa och Pectobacterium carotovorum . Den optimala aktiviteten hos Streptobacillus sp. asparaginas registrerades vid 35 kcal C . Tvärtom observerades L-asparaginas från Chrombacteriaceae och Proteus vulgaris vid 20 CCB respektive 57 CCB . Ett icke-linjärt förhållande mellan asparaginas I och temperaturstabilitet detekterades (figur 8). Enzymaktiviteten var stabil upp till 37 kcal C efter inkubation i 1 h. asparaginas från V. unguiculata var stabil upp till 40 kg c efter inkubation i 15 minuter . Asparaginaser från P. carotovorum och C. annuum behöll sin initiala aktivitet efter inkubation vid 40 C och 45 C i 60 min .

Figur 7

temperatur optimal för asparaginas i från P. vulgaris. Enzymaktiviteten mättes vid olika temperaturer med användning av standardanalysmetoden som tidigare beskrivits.

figur 8

termisk stabilitet av asparaginas i från P. vulgaris. Reaktionsblandningen preinkuberades vid olika temperaturer i 60 minuter före tillsats av substrat, följt av kylning i ett isbad. Enzymaktiviteten mättes med användning av standardanalysmetoden som tidigare beskrivits. Aktivitet vid nolltid togs som 100% aktivitet.

effekten av olika metalljoner på asparaginas i undersöktes (tabell 3). Metalljonerna användes vid koncentrationen av 10 mm. K+ kunde kraftigt förbättra aktiviteten av asparaginas I med 150%. I växt hade k+-oberoende och K + – beroende asparaginaser identifierats . K + fungerade också som förstärkare på P. carotovorum asparaginas . Ca2 + ökade aktiviteten något med 110%, men Cu2+ inhiberade aktiviteten av asparaginas I. Dessutom orsakade Pb2+ och Hg2+ delvis hämmande effekt på asparaginas I. V. unguiculata asparaginas aktiverades emellertid av Ni2+ och Co2+ och inhiberades av Mn2+, Zn2+, Ba2+ och Hg2+ . EDTA som metallkelatormedel orsakade delvis hämmande effekt på asparaginas I. EDTA hade emellertid ingen effekt på P. carotovorum asparaginas .

4. Slutsatser

L-asparaginas i från P. vulgaris renades i glutaminasfri form, vilket kan minska risken för biverkningar under behandling med cancer mot cancer. Enzymet visade god stabilitet över ett brett spektrum av fysiologiska förhållanden som pH och temperatur. I nästa steg i vårt projekt kommer L-asparaginas I från P. vulgaris att användas som en potentiell kandidat för behandling av akut lymfoblastisk leukemi.

intressekonflikt

författarna har ingen intressekonflikt som är relevant för detta dokument att avslöja.

bekräftelser

detta projekt finansierades av den nationella planen för vetenskap, teknik och Innovation (MAARIFAH), Kung Abdulaziz stad för vetenskap och teknik, Saudiarabien, pris nr. (11-BIO-1516-03). Författarna erkänner också med tack vetenskap och teknik enhet, Kung Abdulaziz University, för teknisk support.