Kinasanalys
framställd av Swathi Arur
proteinkinas (stamlösningar av 1-10 mg/ml rena kinaser) – för dessa analyser använder jag renat ERK2-Kinas (NEB). För varje enzym är det viktigt att bestämma optimal buffert, jonstyrka och pH för aktivitet. Om dessa villkor inte har fastställts kan protokollet nedan användas som utgångspunkt.
substrat (stamlösning på 10 mM) – substrat innehåller vanligtvis en serin /treonin i ett fosforyleringsställmotiv. Som kontroll använder jag Myelinbasproteinet (erhållet från sigma), som användes av NEB för att kalibrera ERK2-kinaset.
dessutom bör substraten ha en nettopositiv laddning för att underlätta bindning till fosfocellulosfilter som används i analysen. För kvantitativ bindning till fosfocellulospapperet rekommenderas att ha minst 2 basrester och en fri aminoterminal. Om ett fosforyleringsställmotiv inte är känt kan ett allmänt tyrosinkinasunderlag användas. Till exempel” Myelin Basic Protein ” (är ett icke-specifikt substrat för många MAPKs). För initiala reaktioner bör en substratkoncentration på 0,7-1,5 mM användas. För att bestämma de kinetiska parametrarna för fosforylering av den syntetiska peptiden krävs ett intervall av peptidkoncentrationer
10x Kinasbuffert – innehåller 5 mg/mL BSA (för att förhindra kinasadsorption till analysröret), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP/MgCl2 (köpt från Upstate Biotech – Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – en stamlösning på 1-5 mM är bekväm. Observera att de flesta MAPKs har Km-värden för ATP i intervallet 10-150 uM, så för kinetiska experiment är det viktigt att använda mättnadskoncentrationer av ATP för att komma fram till värden På Km och Vmax för peptiderna.
ATP – 10 mCi/mL.
Erk2 Kinasanalyser
a) AUTORADIOGRAFIANALYS:
- en standard kinasanalys utförs i en volym av 25 ul:
- 2, 5 ul av 10X kinasbuffert
- 5 ul av 1, 0 mM MgCl2 /ATP (0, 2 mM slutlig koncentration)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul av 10 mM substrat (1.2 mM slutlig koncentration)
- 1 U av erk2-Kinas
- H2O till 25 ul
1. Före experimenten, förbered en cocktail som innehåller tillräckligt med buffert, ATP och ATP för att slutföra analyserna. För analyser vid olika substratkoncentrationer bör substratet spädas och tillsättas separat till varje rör. Efter dispensering av cocktailen i 1,5 ml mikrocentrifugrör, placera rören i ett vattenbad vid 30 grader C i 30 minuter. Reaktioner bör initieras genom tillsats av Kinas och får fortsätta vid 30 grader C.
2. Efter önskad tid, avsluta reaktionerna genom att tillsätta 2 x SDS-provbuffert och ta slut på en gel.
3. Torka gelen på ett Whatman 3.0-papper och utsätt den torra gelen för ett autoradiogram och håll kassetten på-70Cfor 2 timmar. (för längre exponeringar se till att filmen är torr igen innan du lägger ett nytt autoradiogram på det).
b) kinetisk analys:
1. Utför kinasanalysen som ovan, använd denna gång olika koncentrationer av substraten från 50 nm till 1 mm. Stoppa reaktionen efter 30 minuter genom att tillsätta 45 ul iskall 10% triklorättiksyra (TCA) till varje reaktion. Vortex reaktionerna.
3. Snurra i 2 minuter i mikrocentrifug (10K rpm).
4. Spot 35 ul av supernatanterna på 2,1 cm diameter Whatman P81 cellulosafosfatfiltercirklar.
6. Tvätta P81-filtercirklarna tre gånger med 500 ml kall 0,5% fosforsyra (5-10 minuter per tvätt). Framstegen i tvättstegen kan följas genom att ta bort P81-filtercirkeln för en tom reaktion och kontrollera den med en Geiger-räknare.
7. Tvätta en gång med 200 ml aceton vid rumstemperatur i 5 minuter.
8. Låt filtercirklarna torka vid rumstemperatur.
9. Sätt filtercirklar i scintillationsflaskor och mät 32P inkorporering genom att räkna dynorna torra i en scintillationsräknare. Den specifika aktiviteten hos ATP i en kinasreaktion (t.ex. i cpm/pmol) kan bestämmas genom att upptäcka ett litet prov (2-5 ul) av reaktionen på en P81-filtercirkel och räkna direkt (ingen tvätt). Räkningar per minut erhållna i kinasreaktionen (minus blank) divideras sedan med den specifika aktiviteten för att bestämma de Mol fosfat som överförs i reaktionen.
kinetik för Substratfosforylering
de kinetiska parametrarna för fosforylering av ett substrat med en MAPK kan bestämmas med användning av en variation på protokollet ovan.
1. Utför en reaktion vid en hög koncentration av substrat för att fastställa att proteinet är ett substrat.
2. Variera enzymkoncentrationen i analysen. Hastigheten för substratfosforylering bör vara proportionell mot enzymkoncentrationen under betingelserna för analysen. Detta experiment används också för att bestämma mängden enzym som behövs för kinetiska studier.
för att bestämma hastigheter bör en tidsförlopp för substratfosforylering utföras. Förbered i så fall en större enzymreaktion (vi använder 150 ul). Vid de önskade tidpunkterna drar du ut 25 ul-alikvoter och överför dem till mikrocentrifugrör som innehåller 45 ul iskall 10% TCA och analyserar reaktionerna som beskrivits ovan. Fosforylering av substratet bör vara linjär med tiden, och för mätning av kinetiska konstanter bör de initiala reaktionshastigheterna (5%) användas.
3. Variera substratkoncentrationen i analysen. Använd en plot av hastighet kontra peptidkoncentration för att få en initial uppskattning av värdet av Km. Ett brett spektrum av substratkoncentrationer (t.ex. 20 uM till 2 mM) bör användas i denna initiala mätning.
4. För att bestämma Km (substrat) och Vmax , variera substratkoncentrationen och mäta fosfatöverföringshastigheten. Ett bra utbud av substratkoncentrationer är följande multiplar av Km: 0, 125 x Km, 0, 25 x Km, 0, 5 x Km, 1, 0 X Km, 2, 0 X Km, 4, 0 X Km, 8, 0 x Km. Reaktionerna bör utföras i tre exemplar för bästa resultat.
5. Kinetiska konstanter bestäms av viktade icke-linjära minsta kvadrater som passar till hyperbolisk hastighet kontra tomter med iterativa program som NFIT (Island Products, Galveston, TX).
beräkning av RAR:
RAR: relativ Acceptorförhållande = Vmax / Km definierad som ett övergripande mått på förmågan hos ett protein att fungera som ett substrat.
jag normaliserar RAR för ett givet substrat med Myelinbasiskt Protein, dvs beräkna värdet av RAR för varje substrat och dela sedan det med värdet av RAR för Myelinbasiskt Protein (därmed inställning MBP vid 1,0).
