strukturell grund för igenkänning av K48-länkad Ub-kedja med proteasomal receptor Rpn13

K48-länkad Ub-kedja fluktuerar dynamiskt mellan flera konformationer

vi använde smFRET för att bedöma det rumsliga arrangemanget av de två Ub-subenheterna i ligandfri K48-diUb. Vi introducerade fluorophores, Alexa Fluor 488 och Cy5, vid n-änden av den distala Ub och C-änden av den proximala Ub (kompletterande Fig. S1a). Med hjälp av förväntningsmaximeringsalgoritm32 kan smFRET-profilen för K48-diUb bäst beskrivas som tre överlappande FRET-arter (kompletterande Fig. S2). Hög-, medel-och låg-FRET arter är centrerade vid FRET effektivitet av 0,74, 0,57 och 0,23, med respektive populationer av ~48, ~39 och ~13% (Fig. 1a). FRET avstånden mellan centrum av fluoroforer beräknas till ~43, ~50, ~64 kg, respektive. Således kan hög-, medel-och låg-FRET-arter tilldelas kompakta, halvöppna och öppna tillstånd som redan finns för K48-diUb.

A med fluoroforer konjugerade vid 76 C-platsen för den proximala Ub och 0 C i den distala Ub(jfr. Kompletterande Fig. S1A) kan smFRET-profilen monteras på tre överlappande FRET-arter. Om inget annat anges används detta par konjugeringsställen för alla smFRET-studier av K48-diUb. High-FRET-arten (färgad röd) motsvarar ett redan existerande kompakt tillstånd. b – d det kompakta tillståndet kan selektivt berikas med full längd Rpn13, och befolkningsökningen kan monteras på en bindande isoterm. T. ex. kan det kompakta tillståndet selektivt berikas av Rpn13NTD, och befolkningsökningen kan monteras för att vara en bindande isoterm. h med fluoroforerna konjugerade vid n25c / N25C-platser kan Rpn13NTD selektivt berika det redan existerande kompakta tillståndet för den distala diuben av K48-tetraUb (jfr. Kompletterande Fig. S5), vilket ger en bindande affinitet. Populationerna av smFRET-arterna är i genomsnitt över tre oberoende mätningar, med felen som indikerar 1 SD; KD-värdena rapporteras som bästa passform för tillbehörs-fel

konformationsfluktuationen av K48-diUb har tidigare undersökts med smFRET26. I den studien löste författarna två smFRET-arter för K48-diUb, nämligen hög-FRET och låg-FRET-arter med centrumeffektivitet vid 0.69 respektive 0.41, förutom en no-FRET-Art. Författarna visade att titreringen av en inaktiverad OTUB1 (OTUB1i), ett deubiquitinas specifikt för K48-isopeptidlänkage33, berikar huvudsakligen låg-FRET-arten. Deras observation ledde till förslaget att K48-diUb specifikt kan erkännas av OTUB1 genom en konformationell urvalsmekanism. Här upprepade vi smFRET titrering, och fann att OTUB1i berikar medium-FRET arter (kompletterande Fig. S3a-c). Dessutom kan populationsökningen av mediumbandsarten vid OTUB1i-titrering monteras på en bindande isoterm med ett KD-värde på 7,7 0.1 msk (kompletterande Fig. S3d), som ligger nära KD-värdet som tidigare rapporterats26. Således bör medium-FRET-arterna i den aktuella studien motsvara låg-FRET-arterna i den tidigare studien, och avvikelsen kan uppstå från olika fotonräkningseffektivitet och passande rutiner för smFRET-tidsspår.

för att ytterligare bekräfta att K48-diUb fluktuerar mellan tre redan existerande konformationstillstånd introducerade vi fluoroforer vid ytterligare par fluorofor konjugeringsställen (kompletterande Fig. S1b-d). För de alternativa platserna, även om CENTRUMEFFEKTIVITETEN hos FRET-arterna skiljer sig åt, kan smFRET-profilerna fortfarande beskrivas som tre överlappande FRET-arter med liknande populationer (kompletterande Fig. S4). Till exempel för 25 C/25 C-konjugeringsställen är hög -, medel-och låg-FRET-arterna centrerade vid FRET-effektivitet av 0,68, 0,54 och 0,21, med respektive populationer av ~48%, ~43% och ~9% (kompletterande Fig. S4d). Således är det osannolikt att konjugering av fluoroforerna stör proteinstrukturen, och smFRET-mätningarna har avslöjat den inneboende konformationsdynamiken hos K48-diUb oavsett konjugeringsstället, det vill säga K48-diUb växlar mellan tre distinkta tillstånd i frånvaro av ett partnerprotein.

för att ytterligare bedöma om Ub-subenheter i längre K48-länkad Ub-kedja också fluktuerar mellan flera konformationstillstånd analyserade vi smFRET-profilen för K48-länkad tetra-ubiquitin (K48-tetraUb). Vi konjugerade fluoroforerna vid två n25c-platser i den distala diuben (med respekterad till den proximala diuben) av K48-tetraUb. SmFRET-profilen kan också passa som tre överlappande FRET-arter (kompletterande Fig. S5a). Även om de relativa populationerna av de tre arterna skiljer sig från den hos en isolerad K48-diUb med fluoroforer konjugerade på samma platser (kompletterande Fig. S4D), centrum FRET effektivitet av FRET arter är nästan identiska. Således bevaras diubenhetens konformationstillstånd sannolikt i längre K48-länkad Ub-kedja, medan skillnaden i de relativa populationerna kan vara ett resultat av modulerande effekt av den proximala diuben.

High-FRET-arten berikas selektivt av Rpn13

för att bedöma förhållandet mellan konformationsdynamiken hos K48-länkad Ub-kedja och rpn13-igenkänning titrerade vi 150 pM fluorofor-märkt K48-diUb med humant fullängds rpn13-protein. Intressant, vid tillsatsen av 100 nM Rpn13, berikas de redan existerande hög-FRET-arterna av K48-diUb från ~48% till ~57% (Fig. 1a, b), medan populationen av medel – och låg-FRET arter minskar. Populationen av hög-FRET arter fortsätter att öka med mer rpn13 tillsatt (Fig. 1C), och bindningsisotermen kan monteras på ett KD-värde på 119 24 nm (Fig. 1d).

det har tidigare visats att Rpn13NTD huvudsakligen ansvarar för UB-bindning6, 7. Således utförde vi smFRET-titrering för 150 pM fluorophore-märkt K48-diUb med användning av endast Rpn13NTD innefattande endast de första 150-resterna. Rpn13NTD berikar också selektivt hög-FRET arter av K48-diUb (Fig. 1e, f). Befolkningsökningen av hög-FRET arter kan monteras för att ge ett KD-värde på 33,1 6,9 nm (Fig. 1g), vilket är ungefär 4-faldig ökning av affinitet jämfört med full längd Rpn13. Om fluoroforerna är fästa vid alternativa konjugeringsställen (kompletterande Fig. S1B och S4b), titrering av Rpn13NTD orsakar också anrikning av ekvivalenta FRET-arter efter en liknande trend, vilket ger nästan identiskt KD-värde (kompletterande Fig. S6). Således kan utseendet ytterligare rester ha en liten hämmande effekt på interaktionen mellan Rpn13NTD och K48-diUb.

dessutom utförde vi smFRET-titrering för 150 pM K48-tetraUb med fluoroforer konjugerade vid distal diUb (kompletterande Fig. S5a). Titrering av Rpn13NTD berikar selektivt de redan existerande HÖGBANDSARTERNA av den fluorofor-märkta distala diuben (kompletterande Fig. S5B-d), och bindningsisotermen kan monteras på ett KD-värde på 214 70 nm (Fig. 1h). Den 7-faldiga minskningen av bindningsaffinitet jämfört med Rpn13NTD:K48-diUb-interaktion kan tillskrivas självassociationen mellan distal diUb och proximal diUb34, vilket gör bindningsytan mindre tillgänglig för rpn13-bindning. Viktigt är att för alla smFRET-titreringar av K48-diUb eller K48-tetraUb förändras centrumeffektiviteten hos högbandsarterna lite i frånvaro eller närvaro av Rpn13 eller Rpn13NTD. Detta innebär att Rpn13 binder till en redan existerande konformation av K48-diUb genom en konformationsvalsmekanism, oavsett om K48-diUb är av sig själv eller en del av längre Ub-kedja. Det betyder också att hög-FRET-arten, dvs det redan existerande kompakta tillståndet för K48-diUb, inte är helt stängd och är redo att interagera med andra proteiner. Det är viktigt att den selektiva anrikningen av högbandsarten också indikerar att Rpn13 bör interagera med båda Ub-underenheterna samtidigt.

rpn13 binder företrädesvis till K48-länkad diUb

för att bedöma rpn13-bindande specificitet för K48-koppling bedömde vi bindningsaffiniteterna mellan Rpn13 och andra typer av Ub-proteiner. Med titreringen av 200 nM Rpn13NTD till 150 pM fluorofor-märkt K48-diUb, befolkningen av hög-FRET arter ökar med 15% från ~48% till ~63% (Fig. 1f). Vid denna koncentration är K48-diubbindning ännu inte mättad med Rpn13NTD (Fig. 1G) och därför är populationen av hög-FRET-arten känslig för liten förändring av den tillgängliga rpn13ntd-koncentrationen. Omärkt K48-diUb kan tävla om bindningen till Rpn13NTD med fluorophore-märkt K48-diUb. Med tillsatsen av 150 pM omärkt K48-diUb minskar populationen av hög-FRET-arten med 7,5%, vilket motsvarar en 50% hämning av rpn13ntd-bunden fluorofor-märkt K48-diUb (Fig. 2a). Med tillsatsen av 300 pM omärkt K48-diUb minskar populationen av högbandsarter med 11% och uppgår till totalt 73% hämning (Fig. 2b). Som sådan konkurrerar både fluorophore-märkt och omärkt K48-diUb om samma bindningsgränssnitt på Rpn13 med liknande bindningsaffinitet. Detta innebär också att konjugering av fluoroforerna till K48-diUb orsakar liten störning i interaktionen mellan Rpn13NTD och K48-diUb.

A, b tillägg av 200 nM Rpn13NTD berikar först hög-FRET arter av fluorophore-märkt K48-diUb(jfr. Figur 1F), och ytterligare tillsats av 150 pM och 300 pM omärkt K48-diUb minska populationen av hög-FRET arter. C, D tillsats av 150 pM och 300 pM omärkt Ub monomer har försumbar effekt på populationen av hög-FRET arter. E, f tillsats av 150 pM K48-diUb och 150 pM M1-diUb orsakar mycket liten minskning av populationen av hög-FRET arter

vidare till blandningen av 200 nM Rpn13NTD och 150 pM fluorophore-märkt K48-diUb, tillsatte vi omärkt Ub-monomer, K63-länkad diubiquitin eller M1-länkad diubiquitin, för att bedöma om andra typer av Ub kan förskjuta K48-diUb. Populationen av hög-FRET arter förändras lite med tillsats av 150 pM eller 300 pM Ub monomer (Fig. 2c, d). Med tillsatsen av 150 pM K63-diUb och 150 pM M1-diUb är populationen av högbandsarten också oförändrad inom felområdet (Fig. 2e, f). Å andra sidan orsakar direkt titrering av 1 kg rpn13ntd i fluorofor-konjugerad K63-diUb och M1-diUb liten förändring av deras redan existerande smFRET-profiler (kompletterande Fig. S7). Tillsammans interagerar Rpn13NTD selektivt med K48-diUb.

Lösningsstruktur för Rpn13NTD:K48-diUb-komplex

även om vi nu har visat rpn13ntd interagerar selektivt med K48-diUb, har endast den komplexa strukturen mellan Rpn13NTD och Ub-monomer bestämts6,8. För att förstå hur de två underenheterna i K48-diUb samtidigt kan interagera med Rpn13NTD, bestämde vi oss för att bestämma lösningsstrukturen för Rpn13NTD:K48-diUb-komplex med kärnmagnetisk resonans (NMR). Vid bildandet av proteinkomplex skulle gränssnittsrester uppleva olika lokala miljöer och därför visa NMR-signaler. Vi fann att titrering av omärkt K48-diUb till 15N-märkt Rpn13 orsakar stora kemiska skiftstörningar (CSP), som huvudsakligen involverar rester 73-83 och 93-106 (Fig. 3a). Dessa rester bildar en sammanhängande yta på Rpn13, som täcker ett område som är större än förväntat från den tidigare bestämda komplexa strukturen mellan Rpn13NTD och Ub monomer6,7. Å andra sidan, titrering av omärkt Rpn13NTD till K48-dUb, med antingen proximal eller distal Ub 15N-märkt och den andra underenheten omärkt, observeras CSP: erna huvudsakligen för rester i regionen för båda UB-subenheterna i enlighet med den nya standarden. Några av gränssnittsresterna försvann också vid bildandet av komplexet (Fig. 3b, c).

a-c CSP i genomsnitt över 1h och 15N dimensioner av ryggradsamidprotoner vid bildandet av komplexet med 0,2 mM isotopmärkta och omärkta proteiner. Infällningar: den 15N-märkta underenheten illustreras med ytrepresentation, och de rödfärgade resterna har CSP över den streckade linjen. D, e med en paramagnetisk sond konjugerad vid e24c-platsen för den distala Ub, intensitetsförhållandena mellan paramagnetiska och diamagnetiska spektra, och värdena före Expor2 bedömdes för ryggradsamidprotoner av 15N-märkt Rpn13NTD. Grå lådor indikerade rester med mycket stora intermolekylära PREs. f med den paramagnetiska sonden konjugerad vid n25c-platsen för den proximala Ub, mättes UB2-värden för amidprotoner av 15N-märkt distal Ub i K48-diUb. Felstaplarna indikerar 1 S. D., och rester som helt breddas ut i komplexet betecknas med stjärnor

Nuclear Overhauser effect (NOE) rapporterar avståndsförhållande (<6 msk) mellan kärnor. Dessutom kan 13C halvfiltrerat NMR-experiment ge NOE mellan 12c-bunden proton och 13C-bunden proton, dvs intermolekylärt avståndsförhållande. Vi erhöll intermolekylära NOEs mellan Rpn13NTD och den proximala Ub, mellan Rpn13NTD och den distala Ub, och mellan proximal Ub och distal Ub (kompletterande Fig. S8). Vidare konjugerade vi en maleimid-EDTA-Mn2+ paramagnetisk sond vid E24C-platsen för den distala Ub och samlade paramagnetisk avslappningsförbättring (PRE) för ryggrads amidprotoner av Rpn13NTD, efter det etablerade protokollet22,35. Som bedömts antingen genom toppintensitetsförhållandet mellan paramagnetiska kontra diamagnetiska spektra eller genom tvärgående avslappningsförbättring av 2-hastigheten, upplever Rpn13-rester 30-42 och 101-106 stora tryck med svår linjeutvidgning (Fig. 3d, e). Vi konjugerade också den paramagnetiska sonden vid n25c-platsen för den proximala Ub, och utvärderade den tvärgående avslappningsförbättringshastigheten Bisexuell 2 för den distala Ub (Fig. 3f). Stora PRE-värden observeras mellan de två Ub-underenheterna i ligandfri K48-diUb, och tillsatsen av Rpn13NTD ökar inter-Ub PREs men med en liknande Pre-profil. Pre NMR-experimenten bekräftar således att Rpn13NTD berikar det redan existerande kompakta tillståndet för K48-diUb.

för att förfina Rpn13NTD:K48 – diub komplex struktur mot experimentella begränsningar, vi utförde styv kroppsdockning med torsionsvinkelfrihet som ges till diublänkarnas rester och till sidokedjorna av gränssnittsrester. För de 20 lägsta energikonformatorerna är rot-medelkvadrat (RMS) avvikelsen för tunga atomer i ryggraden av alla styva rester 0,86 0,54 0,54 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx (kompletterande Fig. S9 och tabell S1). De två Ub-underenheterna av K48-diUb förblir associerade i det komplexa, begravande lösningsmedelsanpassade ytarean (SASA) på ~1130 Kub2. Å andra sidan kilar rpn13ntd in, begraver ~940 OC i SASA med den proximala Ub och ~1300 OC i SASA med den distala Ub (Fig. 4a). Den komplexa strukturen mellan Rpn13NTD och proximal Ub av K48-diUb i föreliggande studie liknar den kända komplexa strukturen mellan Rpn13NTD och Ub monomer6,7, med RMS-skillnaden för tunga atomer i ryggraden 2,17 0,31 0,31 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx (kompletterande Fig. S10a). Intressant, även om de hydrofoba resterna L8, I44 och V70 i den proximala Ub är involverade för att interagera med Rpn13, är samma tre rester i den distala Ub begravda i Ub-Ub-gränssnitt.

en struktur av Rpn13NTD: K48-diUb komplex. Bildandet av komplexet begraver omfattande gränssnitt mellan underenheterna. B elektrostatiska potentialytor av Rpn13NTD och distal Ub av K48-diUb, ritad vid 3 KBT-skalan i Xiaomi. Rester R104 i Rpn13NTD och D39 i distal Ub visas som bollar och pinnar. C r104e laddningsomvandlingsmutation i Rpn13NTD orsakar en 300-faldig minskning av bindningsaffiniteten för K48-diUb, som bedömts av smFRET (jfr. Kompletterande Fig. S11). KD-värdet rapporteras som bästa passningsfel för bästa passform. D Western blot-analyser visar att transfektionen av rpn13 R104E-mutant (med en N-terminal flagga) ökar den totala mängden K48-länkade polyubproteiner i cellen. e-cellviabiliteter vid värmechock (i förhållande till celler utan värmechock) visar att transfektion av rpn13 R104E mutant, men inte av vildtyp Rpn13, ger termotolerans. * P < 0, 05, ***P < 0.001, för att kontrollera celler i samma grupp, oparat t-test; # # P < 0,01, # # # P < 0,001, till de obehandlade cellerna med värmechock, enkelriktad ANOVA; && P < 0.01, &&&P < 0,001, till vildtyp Rpn13 transfekterade celler med värmechock, enkelriktad ANOVA

rpn13ntd: K48-diub-komplex struktur kan också bekräftas av data med en molekyl. Baserat på den komplexa strukturen modellerade vi fluoroforerna vid deras konjugeringsställen i K48-diUb. Det genomsnittliga avståndet är 43,2 5.8 msk mellan de geometriska centra av fluorofor aromatiska ringar, vilket motsvarar en teoretisk FRET effektivitet av 0,73 0,13 (kompletterande Fig. S10b). Detta värde är nästan detsamma som den centrumeffektivitet som observerats för hög-FRET-arten (Fig. 1a).

störning av Rpn13NTD: distal UB-interaktion orsakar ackumulering av ubiquitinerade proteiner i cellen

i den komplexa strukturen mellan Rpn13NTD och K48-diUb liknar interaktionen mellan Rpn13NTD och den proximala Ub den mellan Rpn13NTD och Ub-monomer, som tidigare rapporterats (kompletterande Fig. S10a). Således utformade vi experiment för att bedöma funktionell betydelse för interaktionen mellan Rpn13NTD och den distala Ub av K48-diUb. Många laddade rester är belägna vid gränssnittet mellan Rpn13NTD och den distala Ub av K48-diUb, och därför kan elektrostatisk kraft spela en viktig roll för att stabilisera komplexet (Fig. 4b). Bland dem är rest D39 i distal Ub nära Rest r104 i Rpn13. Vi muterade således rpn13-Rest r104 till ett glutamat och titrerade mutanten Rpn13NTD till fluorofor-märkt K48-diUb. Det mutanta proteinet berikar hög-FRET arter av K48-diUb (kompletterande Fig. S11). Bindningsaffiniteten blir emellertid mycket svagare. Bindningsisotermen kan monteras på ett KD-värde på 10,0 3,3 300 gånger svagare än vildtypen Rpn13NTD (Fig. 4c). Som sådan är föreningen med den distala Ub viktig för det specifika igenkänningen mellan Rpn13 och K48-diUb.

den minskade bindningsaffiniteten hos r104e-mutanten gjorde det möjligt för oss att bedöma den funktionella betydelsen av interaktionen mellan Rpn13 och K48-länkad Ub-kedja. Övergående transfektion av vildtyp Rpn13 ökar något mängden K48-länkade polyubproteiner (Fig. 4d). Det är möjligt att vid rpn13-transfektion konkurrerar ett överskott av fri Rpn13 om bindning till de K48-länkade polyubproteinerna med proteasomassocierad Rpn13, vilket gör rekryteringen av ubiquitinerade substratproteiner till proteasomen mindre effektiv. Å andra sidan ökar transfektionen av rpn13 r104e mutant kraftigt mängden K48-länkade polyubproteiner, jämfört med cellerna transfekterade med vildtyp Rpn13 (Fig. 4d). Som en positiv kontroll inkuberade vi cellerna med 1 msk mg132, en potent proteasominhibitor36. På grund av blockeringen av nedbrytning av labila proteiner ökar tillsatsen av MG132 signifikant mängden K48-länkade polyubproteiner. Sammantaget kan r104e-mutation av Rpn13 leda till ackumulering av ubiquitinerade substratproteiner. Detta kan hänföras till svagare interaktion mellan proteasomassocierad rpn13-mutant och K48-diUb och K48-poyUb.

värmechock kan minska cellens livskraft. Vi fann att 30 min värmechock vid 43 kcal C kan minska livskraften hos HEK293-celler till 75%. I likhet med tidigare rapporter36,37, fann vi också att behandlingen av MG132 har en skyddande effekt på cellöverlevnad vid värmechock, med cellens livskraft minskade till ~90% (Fig. 4e). Detta beror på att MG132 hämmar proteasomal nedbrytning, vilket gör de annars kortvariga värmechockproteinerna mer tillgängliga (Fig. 4d). Vi analyserade också livskraften hos värmechockade celler transfekterade med vildtyp Rpn13 och fann ingen signifikant skillnad från kontrollcellerna utan rpn13-transfektion. Å andra sidan minskade cellviabilitet hos rpn13 r104e transfekterade celler till ~83% vid värmechock, vilket är signifikant högre än för kontrollceller och celler transfekterade med vildtyp Rpn13 (Fig. 4e). Detta innebär att mutanten Rpn13 har en skyddande effekt på cellöverlevnad vid värmechock, liknande effekten av MG132. Sammantaget är interaktionen mellan Rpn13 och K48-länkad Ub-kedja väsentlig för Rpn13-medierad igenkänning av ubiquitinerade substratproteiner av proteasomen, medan en gränssnittspunktmutation i Rpn13 kan orsaka ackumulering av vissa substratproteiner såsom värmechockproteiner och ger termotolerans till de transfekterade cellerna.

Rpn13NTD: K48-diUb-interaktion kan riktas för att modulera rpn13-funktionen

Rpn13 rekryteras dynamiskt till proteasomen via interaktionen mellan Rpn13NTD och C-terminal svans av Rpn27,13. Den komplexa strukturen här indikerar att bindningsgränssnittet på Rpn13NTD för Rpn2 är nära men överlappar inte med bindningsgränssnittet för den distala Ub av K48-diUb (Fig. 5a). Vi förblandade således de sista 16-resterna av Rpn2 (Rpn2CTD) med Rpn13NTD eller med full längd Rpn13 vid 1:1-förhållande och titrerat Rpn13NTD:Rpn2CTD-komplex till fluorofor-märkt K48-diUb. Förblandningen av Rpn2CTD ökade KD-värdet av Rpn13NTD:K48-diUb från 33,1 6,9 nm (Fig. 1G) till 66,8 13,9 nm (kompletterande fig. S12a – C och Fig. 5B), medan minskade KD-värdet av Rpn13: K48-diUb från 119 24 nm (Fig. 1D) till 43,9 12,8 nm (kompletterande fig. S12d-f och Fig. 5c). Således ger mätosäkerheten associeringen av Rpn2CTD endast liten störning för bindningsaffiniteten mellan Rpn13 och K48-diUb, vilket också kan ha att göra med närvaron av länkare och C-terminaldomänen för Rpn13.

a bindningsytan på den distala Ub av K48-diUb på Rpn13NTD ligger intill bindningsytan på Rpn2CTD. Med rpn13ntd-Rpn2CTD komplex struktur (PDB-kod 5V1Y) överlagrad av Rpn13NTD visas Rpn2CTD som röd tecknad film. Rpn13 Rest K34 ligger nära C-änden av distal Ub (visas som en streckad linje). B, C-bindande affiniteter erhölls från smFRET-titreringar av equimolar Rpn13NTD:Rpn2CTD eller Rpn13: Rpn2CTD till fluorofor-märkt K48-diUb. KD-värdena rapporteras som bästa passform för att passa in i passande fel. D-bindning av Rpn2-förankrad Ub-monomer upptar sannolikt samma bindningsyta på den distala Ub, vilket orsakar förskjutningen av den senare. e, f smfret-tävlingsexperimenten, med ytterligare tillsats av 150 pM rpn2ctd-Ub-fusionsprotein, till blandningen av 200 nM Rpn13NTD eller full längd Rpn13 och 150 pM fluorofor-märkt K48-diUb (c.F. figur 1c och f). Felet indikerar 1 S. D. från tre oberoende mätningar av populationerna av smFRET-arten

Rpn2 och distal Ub av K48-diUb upptar närliggande ytor på Rpn13NTD. Därför kan ett fusionsprotein med Ub-monomer bifogad vid C-änden av Rpn2CTD sticka ut och störa interaktionen mellan Rpn13NTD och den distala Ub av K48-diUb (Fig. 5d). Som vi har visat, tillägg av 200 nM rpn13ntd ökar populationen av hög-FRET arter av 150 pM fluorophore-märkt K48-diUb till ~63% (Fig. 1f), medan tillsats av Ub-monomer inte kan konkurrera om rpn13ntd-bindning (Fig. 2c, d). När vi tillsatte ytterligare 150 pM omärkt rpn2ctd-Ub-fusionsprotein minskar populationen av högbandsarter med ~4% till ~59% (Fig. 5e). Å andra sidan har vi visat att tillsats av 200 nM full längd Rpn13 ökar populationen av hög-FRET arter av 150 pM fluorophore-märkt K48-diUb till ~60% (Fig. 1c). Ytterligare tillsats av 150 pM omärkt rpn2ctd-Ub fusionsprotein minskar populationen av högbandsarter med ~4,5 till ~55,5% (Fig. 5f). Observera att tillägg av en Ub vid Rpn2CTD nästan inte har någon effekt på interaktionen mellan Rpn2CTD och Rpn13NTD (kompletterande Fig. S13). Således indikerar våra data att rpn2-och K48-diUb-bindande gränssnitt på Rpn13NTD ligger nära varandra. Ännu viktigare är att Rpn2-förankrad Ub fysiskt kan blockera åtkomsten av den distala diuben till Rpn13 och försvaga interaktionen mellan K48-diUb och Rpn13.