Funksjonell Profilevaluering Av Lactobacillus fermentum TCUESC01: En Ny Potensiell Probiotisk Stamme Isolert Under Kakaofermentering

Abstrakt

bruken av intestinale probiotiske bakterier er svært vanlig i næringsmiddelindustrien Og har vært fokus for flertallet av forskningen på dette feltet. Men de siste årene har forskning på ekstraintestinale mikroorganismer økt kraftig på grunn av deres kjente potensial som probiotika. Dermed studerte Vi en stamme Av Lactobacillus fermentum (TCUESC01) ekstrahert fra fermenterende kakao. Først undersøkte vi virkningen av pH på veksten av denne stammen og studerte overlevelse under forhold som ligner på den menneskelige mage-tarmkanalen. L. fermentum TCUESC01 viste motstand mot forhold som etterligner magesekken og tarmene og vokste godt mellom pH 5 og pH 7. Deretter utsatte Vi L. fermentum TCUESC01 til lagring ved 4°C i en melkeoppløsning og fant at den overlevde godt i 28 dager. Til slutt målte vi følsomheten av denne stammen til mange antibiotika og dens tendens til å automatisk aggregere. L. fermentum TCUESC01 viste signifikant autoaggregasjon, samt følsomhet for de fleste testede antibiotika. Samlet sett støtter våre funn den potensielle bruken av denne ekstraintestinale bakterien som et kosttilskudd probiotisk.

1. Introduksjon

søket etter nye probiotika er motivert av kunnskapen om at hver stamme av mikroorganismer har forskjellige egenskaper og kan ha unike effekter på menneskers helse. Historisk ble det antatt at melkesyrebakteriene i probiotiske produkter måtte hentes fra mennesker på grunn av vertenes spesifisitet . Imidlertid utviser ekstraintestinale mikroorganismer isolert fra fermenterte laktoseholdige matvarer eller fermenterte grønnsaker også lovende probiotiske effekter . Foreløpige bevis fra vårt laboratorium indikerer At Lactobacillus-stammer avledet fra gjæring av kakao av høy kvalitet utviser probiotiske egenskaper: de reduserer histologisk skade, reduserer systemisk konsentrasjon av inflammatoriske cytokiner og øker serum IgA-nivåene i en in vivo eksperimentell modell av kolitt . Den mulige bruken av disse stammene i kommersielle produkter avhenger imidlertid av en rekke tester anbefalt av internasjonale organisasjoner. Ifølge Fns Mat-Og Landbruksorganisasjon (FAO) og Verdens Helseorganisasjon (WHO) bør potensielle probiotiske stammer evalueres for deres funksjonelle og teknologiske egenskaper, inkludert deres motstand under gastrointestinal transitt og deres stabilitet under lagring . Derfor vurderte vi de funksjonelle egenskapene OG sikkerheten Til Lactobacillus fermentum-stammen TCUESC01 som ble isolert under gjæring av kakao av høy kvalitet.

2. Materialer og Metoder

2.1. Mikroorganismer Og Vekstforhold

lactobacillus fermentum TCUESC01 stamme (tiltredelsesnummer KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) ble dyrket i lactobacilli MRS buljong (1% pepton, 0,8% kjøttekstrakt, 0,4% gjærekstrakt, 2% glykose, 0,5% natriumacetat, 0,2% dipotassiumhydrogenfosfat, 0,02% magnesiumsulfatheptahydrat, 0.005% mangansulfattetrahydrat og 0,02% sitronsyre triammoniumsalt) (HIMEDIA®, India) til 18 timer kl. 37°C og lagret Til -80°C i en 10% melkeoppløsning (Molico®, Brasil) som inneholder 30% glyserol.

2.2. Analyse av Vekst og Levedyktighet Under Varierte pH

mrs buljongløsninger av pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 og pH 9 ble fremstilt ved tilsetning av 1 mol * L-1 saltsyre eller 1 mol·L−1 natriumhydroksid. Før forsøket Ble l. fermentum TCUESC01 dyrket i 18 timer og deretter fortynnet i en saltoppløsning (0.85% natriumklorid) til en optisk tetthet (OD) på 0,3 målt ved 600 nm (OD600 = 0,3). Forsøkene ble utført i 96-brønns mikroplater (costar®), hvor 180 µ AV MRS ved hver pH ble inokulert med 20 µ aktiv kultur eller saltvann som kontroll. Mikroplaten ble inkubert ved 37°C og OD ved 600 nm ble bestemt hver time i 10 timer ved hjelp av et spektrofotometer(Molekylære Enheter®, Versamax tunable microplate reader). Parallelt ble det tatt prøver hver time fra hver pH, belagt PÅ MRS agar, og inkubert under anaerobe forhold ved 37°C for å teste cellens levedyktighet.

2.3. In Vitro Toleranse For Gastrointestinale Tilstander

Bakterier ble dyrket ved 37°C over natten i 40 mL mrs buljong, vasket i en saltoppløsning og inokulert i 20 mL av en 10% melkeoppløsning. Melkfermentering fikk lov til å fortsette til en pH på 4,5 ble nådd, hvor bakteriene ble talt (CFU * mL-1·ved seriell fortynning og plating PÅ MRS agar. I tillegg ble det utført en seriell fortynning i en saltoppløsning (pH 2,5) med pepsin (3 g/L), etterfulgt av inkubasjon ved 37°C i 1,5 timer. Bakteriene ble vasket ved to sentrifugeringssykluser (5000 ×g/10 min) og resuspensjon i en saltoppløsning, før de ble resuspendert i 20 mL 1% svinegalle ved pH 8,0 (Merck®, Tyskland) og inkubert ved 37°C i 45 minutter. Bakterietallet (CFU·mL-1) ble bestemt ved å platere bakterieoppløsningen I MRS agar under anaerobe forhold ved 37°C i 48 timer etter hver inkubasjonsfase.

2.4. Overlevelse Under Kald Lagring I Surgjort Melk

l. fermentum stammen TCUESC01 ble dyrket I MRS buljong og deretter høstet ved sentrifugering(5000 ×g/10 min). Bakteriene ble deretter vasket ved resuspensjon i en saltoppløsning og igjen pelletert ved sentrifugering. Kulturene ble inokulert i en steril oppløsning av 10% nonfat melk som hadde blitt surgjort til pH 4,5 med melkesyre (Synth®, Brasil). Melkesyreoppløsningen ble nedkjølt ved 4°C, og kolonidannende enheter (CFU·mL-1) ble talt ved seriell fortynning og plating PÅ MRS agar ved 0, 7, 14, 21 og 28 dager. Levedyktigheten av stammen ble bestemt i forhold til nulltidspunktet, som ble ansett å ha 100% overlevelse.

2.5. Analyse Av Automatisk Aggregering

l. fermentum TCUESC01 ble dyrket i 20 mL mrs-buljong over natten ved 37°C. bakteriepellet ble oppsamlet og resuspendert i saltoppløsning til EN OD på 0,3 ved 600 nm (OD600 = 0,3). Kapasiteten Til l. fermentum TCUESC01 for autoaggregering ble testet ved å inkubere suspensjonen i ved 37°C Og OD ble overvåket hver time i 5 h. prosentaggregasjonen () ble beregnet som følger: hvor er den opprinnelige optiske tettheten ved nulltidspunktet og er den optiske tettheten ved måletidspunktet. Resultatene som ble vist var gjennomsnitt pluss / minus standardavvikene fra tre eksperimenter.

2.6. Sensitivitetstesting Av Antibiotika

L. fermentum TCUESC01 ble dyrket i 18 timer I MRS-buljong ved 37°C og fortynnet til 0,5 På McFarland-skalaen i en saltoppløsning. Antibiotikaskiver ble plassert På Mueller-Hinton agarplater som deretter ble inokulert med 100 µ av den aktive bakteriesuspensjonen. Platene ble deretter inkubert under anaerobe forhold i 24 timer ved 37°C. Sonene for hemming rundt skivene ble målt og bakteriene ble klassifisert som resistente (), moderat følsomhet (MS) eller følsomme () basert på standardene som er skissert I Tabell 1. Antibiotika-plater som brukes i følsomhet test ble amoxicillin (AMO, LABORCLIN®, Brasil, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, LABORCLIN, Brasil, 5 µg), amikacin (AMI, CECON®, Brasil, 30 µg), azithromycin (AZI, CECON, Brasil, 15 µg), amoxicillin og klavulansyre (AMC, SENSIFAR®, Brasil, 30 µg), norfloxacin (ELLER, LABORCLIN, Brasil, 10 µg), sulfonamide (SUL, NEWPROV®, Brasil, 300 µg), vankomycin (VAN, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), streptomycin (EST, LABORCLIN, Brasil, 10 µg), erytromycin (ERI, CECON, Brasil, 15 µg), tetracyclin (TET, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brasil, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brasil, 30 µg), gentamicin (GEN, CECON, Brasil, 10 µg), cefotaksim (CTX, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), cotrimoxazole (trimethoprim and sulfamethoxazole) (SUT, SENSIFAR, Brasil, 25 µg), kloramfenikol (BLODPROPP, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), clindamycin (CLI, CECON, Brasil, 2 µg), penicillin G (PEN10, CECON, Brasil, 10 µg), og cefoxitin (CFO, LABORCLIN, Brasil, 30 µg).

2.7. Statistiske Analyser

beregningene av midler og standardavvik, analysene av varians, Tukeys Flere Sammenligningstester og alle statistiske analyser ble gjort ved Hjelp Av GraphPad® Prism 5.0-programvaren. Alle grafer ble også produsert ved Hjelp Av GraphPad Prism 5.0-programmet.

3. Resultater

3.1. Effekt av pH På l. fermentum TCUESC01 Vekst Og Levedyktighet

L. fermentum TCUESC01 var i stand til å vokse i media ved pH 5, pH 6 og pH 7 (Figur 1). Det ble imidlertid ikke observert vekst utenfor dette pH-området (Figur 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(i)

(f)

(no)

(h)

(og)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figur 1

Vekst Av Lactobacillus fermentum tcuesc01 i perioden fra 0 til 10 timer med kulturer ved 37°C i forskjellig pH: (a) vekst i MRS uten endring av pH (pH 6,52); (b) vekst I MRS med pH 2; (c) vekst I MRS med pH 3; (d) vekst I MRS med pH 4; (e) vekst I MRS med pH 5; (f) vekst I MRS med pH 6; (g) vekst I MRS med pH 7; (h) vekst I MRS med pH 8; (i) vekst I MRS med pH 9. Hvert punkt i grafikken representerer gjennomsnittet og standardavviket fra tre eksperimenter.

3.2. Toleranse For L. fermentum TCUESC01 til Gastrointestinale Tilstander In Vitro

toleransen For L. fermentum TCUESC01 til gastrointestinal passasje ble evaluert under forhold utformet for å etterligne den humane gastrointestinale kanalen (Figur 2). En bakterieoppløsning ble dyrket til en konsentrasjon på 8,7 × 108 CFU * mL-1 i en 10% melkeoppløsning. Etter å ha sendt bakteriene til en løsning som inneholder pepsin ved pH 2.5 for 1.5 h for å simulere magesaft, observerte vi en statistisk signifikant reduksjon () av bakteriekonsentrasjonen til 1.23 × 108 CFU * mL-1. Etter å ha blitt vasket med saltvann, ble bakteriene deretter utsatt for en løsning av 1% svin galle ved pH 8,0 i 45 minutter for å simulere tarmmiljøet. Etter denne behandlingen så vi en reduksjon på omtrent 1 logg inn i bakterietallet (3,6 × 107 CFU * mL-1·. Reduksjonen i bakterietall under inkubasjon i simulert tarmsaft var ikke statistisk ubetydelig.

Figur 2

Overlevelse Av Lactobacillus fermentum TCUESC01 under passasje gjennom den simulerte mage-tarmkanalen. «Fermentert melk «etter gjæring av melken;» simulert magesaft » etter passasje i saltvann pH 2,5 + pepsin;» simulert tarmsaft » etter passasje i oksegalle 1%. Hvert punkt på grafen representerer gjennomsnittet og standardavviket av tre eksperimenter. Statistisk signifikant reduksjon () i forhold til » gjæret melk.»

3.3. Overlevelse Av L. fermentum TCUESC01 Under Kommersielle Lagringsforhold

For å evaluere deres overlevelse under lagring ble l. fermentum-bakterier nedkjølt ved 4°C i 28 dager i en ellers steril 10% nonfat melk surgjort til pH 4,5 med melkesyre (Figur 3). Bakteriestammen var opprinnelig i en konsentrasjon på 3,6 × 109 CFU * mL-1, men etter 7 dagers lagring observerte vi en statistisk signifikant reduksjon på omtrent 1 logg i bakterietallet. Fra dag 7 til dag 21 var det uventet vekst fra 4.3 × 108 CFU * mL·1 til 9.0 × 108 CFU * mL-1. Ved dag 28 var bakteriekonsentrasjonen redusert til 2,83 × 108 CFU * mL-1.

Figur 3

Overlevelse Av Lactobacillus fermentum tcuesc01 i fermentert melk fra 0 til 28 dager, ved 4°C. Hvert punkt representerer gjennomsnittet og standardavviket for tre eksperimenter. «a»: statistisk signifikant forskjell i forhold til dag null (); «b»: statistisk signifikant forskjell i forhold til dag 14;»c»: statistisk signifikant forskjell i forhold til dag 21.

3.4. Autoaggregering Av L. fermentum TCUESC01

bakteriene ble i økende grad aggregert til den femte timen av in vitro-kultur, hvor maksimalt 70.19 ± 1.78% aggregering ble observert (Figur 4). Imidlertid var timeøkningene i prosentaggregasjonen bare statistisk signifikante til den tredje timen av forsøket ().

Figur 4

Prosentandel av autoaggregering Av Lactobacillus fermentum tcuesc01 evaluert fra 1. til 5. time av dyrking I MRS buljong ved 37°C. «a»: statistisk signifikant forskjell i forhold til 1. time av aggregering; «b»: statistisk signifikant forskjell i forhold til 2. time av aggregering,. Hvert punkt representerer gjennomsnittet og standardavviket for 3 eksperimenter.

3.5. Følsomhet Av l. fermentum TCUESC01 Til Antibiotika

denne stammen Av L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 var følsom for amoksicillin, amoksicillin og klavulansyre, penicillin G, β-laktam cefotaksim og cefalotin, aminoglykosider amikacin og gentamycin, lincosamidklindamycin, karbapenemimipenem, makrolider azitromycin og erytromycin, fenikolkloramfenikol og tetracyklin. Stammen var også moderat utsatt for streptomycin.

4. Diskusjon

Retningslinjer etablert AV FAO og WHO bekrefter behovet for å analysere de funksjonelle egenskapene og sikkerheten til bakterier før de foreslår bruk i en matmatrise . Vi evaluerte først kapasiteten til Denne Arten Av Laktobacillus for å vokse og overleve ved forskjellig pH, og selv om den bare viste vekst i området fra pH 5 til pH 7, forblev den levedyktig under 10-h-inkubasjoner ved alle pH-nivåer evaluert, med unntak av pH 2. Studier har vist stor variasjon i gastrisk pH når magen er tom, med gjennomsnittlige verdier lavere enn pH 4 . Tarmmiljøet er mer stabilt og varierer mellom pH 6 og pH 8, avhengig av tarmregionen som vurderes . Derfor, selv om denne melkesyrebakterien ikke har vist evnen til å formere seg eller overleve under pH 2,5, forblir den levedyktig i tarmets pH-område og kan derfor fungere i det miljøet. I samsvar med våre data viste Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ OG ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) og Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) isolert fra en vanlig konsumert gjæret drikk (Boza) fra Balkanhalvøya gode vekstrater under 10 timers inkubasjon mellom pH 5 og pH 7 . L plantarum 423 isolert fra sorghum drikke, L. plantarum 241 isolert fra gris ileum, L. curvatus DF38 isolert fra salami, Og Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 isolert fra humane vaginale sekresjoner viste også vekst mellom pH 5 og pH 6,5 i lignende eksperimenter . Samlet viser våre resultater At l. fermentum TCUESC01 har vekst og pH-motstand som ligner andre potensielle ekstraintestinale probiotiske bakterier. Videre kan følsomheten av stammen til pH-nivåer lavere enn 2,5 overvinnes ved bruk av metoder som beskytter bakteriene, som mikroinnkapsling . Våre resultater støtter den potensielle anvendelsen av denne stammen som et probiotisk additiv i matvarer med tydelig sure egenskaper, for eksempel oster, juice og gjærmet melk.

det gastrointestinale miljøet kan være fiendtlig for mange bakterier; en rekke stressorer som surhet, fordøyelsesenzymer og gallsalter kan negativt påvirke deres overlevelse under transitt til tarmen . Laktobacillus i denne studien viste en diskret kvantitativ reduksjon, men forblev levedyktig under mage – og tarmforhold og motstod en konsentrasjon av galle tre ganger som finnes i tykktarmen (0.3%). I likhet med våre data, Kaushik et al. observert At Lactobacillus plantarum Lp9 redusert med ca 0.5 log fra sin opprinnelige konsentrasjon når de utsettes for forhold som etterligner magen (pH 2) og 1 log når de utsettes for forhold som etterligner tarmen. I en annen studie, L. rhamnosus VT1 / 1 isolert fra ost viste en reduksjon på omtrent 2 log in-konsentrasjon under lave pH-forhold (pH 3) og en reduksjon på 1 log in-konsentrasjon når inkubert ved pH 7 i nærvær av 2% gallesalter . Våre resultater tyder På At l. fermentum kunne bevege seg gjennom mage-tarmsystemet og overleve i konsentrasjoner over 107 CFU·g−1 (ELLER CFU·mL−1), som tidligere studier tyder på ville være tilstrekkelig til å samhandle og/eller forstyrre vertsmiljøet .

matmatrisen er også en påvirkningsfaktor i levedyktigheten av mikroorganismer under lagringen . Ved testing av langsiktig overlevelse Av l. fermentum TCUESC01 i surgjort melk, observerte vi en innledende reduksjon av bakterietallet etterfulgt av en liten økning fra dag 7 til dag 21. Denne veksten kan forklares ved fortsatt bakteriell metabolisme i melkesyreoppløsningen, men med redusert hastighet på grunn av lav temperatur. Donkor et al. også observert kvantitativ variasjon i probiotiske bakterier under lagring ved 4°C, spesielt Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 som viste vekst av 1 logg fra dag 7 til dag 14 av kjølelager. I en annen studie reduserte l. plantarum lagret i fermentert melk signifikant sin cellulære konsentrasjon med 1 log i løpet av omtrent 28 dagers lagring ved 4°C . Selv om l. fermentum hadde vist en reduksjon på 1 log fra den opprinnelige konsentrasjonen ved den siste lagringsdagen, var konsentrasjonen over gjennomsnittet på utløpsdatoen for melkesoppløsningen . På samme måte, basert På anbefalingene Fra National Agency For Sanitary Monitoring (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 kan innføres i næringsmidler som ligner på fermentert melk og overleve i tilstrekkelige konsentrasjoner til utløpsdatoen for produktet .

Mikroorganismer med evne til autoaggregering forblir i tarmene i lengre tid og har dermed bedre samspill med epitelceller og vertsimmunsystemet . L. fermentum TCUESC01-stammen viste en forhøyet kapasitet for automatisk aggregering i vår 5-h-prøve. Dette resultatet er høyere enn det som er rapportert av Beganović et al. , som viste At L. fermentum A8 hadde 60.9 ± 3.91% autoaggregasjon etter 5 h inkubasjon, eller som rapportert Av Bao et al. , who demonstrerte autoaggregasjon på mindre enn 28% for 10 stammer Av l. fermentum etter en 20-h inkubasjon. Basert På våre resultater, l. fermentum aggregater godt, og hvis det inntas, vil det trolig være i stand til å fortsette i det menneskelige tarmmiljøet i lange tidsperioder.

Til slutt vurderte Vi følsomheten AV TCUESC01 til en rekke antibiotika. Kunnskap om antibiotikaresistens er ekstremt viktig når vi vurderer tre viktige faktorer: den sjeldne muligheten For infeksjon Av Lactobacillus, risikoen for horisontal overføring av resistensgener til innfødte mikrober, og sammenhengen mellom probiotiske bakterier og antibiotikabehandling. L. fermentum TCUESC01 viste følsomhet for flertallet av antibiotika, med unntak av nukleinsyresyntesehemmere (norfloxacin, ciprofloxacin, sulfonamid og cotrimoksazol) og to celleveggsyntesehemmere (vancomycin og cefoksin). Disse resultatene bekrefter data publisert Av Kirtzalidou et al. på 74 stammer Av Lactobacillus ssp. isolert fra menneskelig avføring, hvorav 94.5% stammer var resistente mot amikacin, alle var resistente mot kanamycin og ciprofloksacin, 84,7% av stammene var resistente mot vancomycin, 1,6% stammer var resistente mot cefalotin, og 8,5% av stammene var resistente mot bacitracin. Generelt viser laktobaciller iboende resistens mot kinoloner, trimetoprim, sulfonamider, vancomycin og de fleste nukleinsyrehemmere, mens de viser følsomhet overfor proteinsyntesehemmere med unntak av aminoglykosider . Det er verdt å merke seg at resistens mot antibiotika observert her er iboende for slekten som tydelig fra publiserte studier, og horisontal genoverføring er derfor uvanlig. Oppsummert støtter motstandsprofilen Til L. fermentum TCUESC01 muligheten for bruk sammen med antibiotika som virker ved å hemme nukleinsyresyntese.

5. Konklusjoner

Til tross for å være en ekstraintestinal stamme isolert under kakaofermentering, Viser l. fermentum TCUESC01 sterkt potensial som et probiotisk for anvendelse i matvarer. Det forblir levedyktig over et bredt pH-spektrum og er derfor egnet for inkludering i ulike typer matvarer. Når det lagres i et kjølt melkeprodukt, opprettholder det levedyktighet over nivåene anbefalt av anerkjente nasjonale og internasjonale organisasjoner til produktets utløpsdato. Under forhold som etterligner gastrointestinal transitt, overlever den også i mengder som er tilstrekkelige for vedlikehold av probiotisk potensial. Når det gjelder sin forventede oppførsel i tarmene, viser l. fermentum TCUESC01 en sterk tendens til å automatisk aggregere. Til slutt utviser denne stammen antibiotikaresistens og resistensprofiler som vil tillate bruk sammen med medikamentterapier. Til sammen tyder Disse egenskapene På At l. fermentum tcuesc01 har stort potensial som et trygt probiotisk matadditiv.

Interessekonflikter

forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Anerkjennelser

denne forskningen ble støttet av et stipend Fra Fundaçã De amparo A pesquisa Do estado Da bahia (fapesb). Conselho De Desenvolvimento Cient ④fico e Tecnológico (CNPq) og Koordinateneçã De aperfei Hryvoamento De personnels de niveau superior (capes) ga produktivitet og kandidatstipend for noen forfattere.