Total RNA ble ekstrahert Ved Hjelp Av Tripure Isolasjon Reagens (Roche).
rna-prøver ble behandlet med Rnase-fri DNaseI og renset ved Hjelp Av Rneasy Mini Kit (QIAGEN). Det resulterende RNA ble utarmet av ribosomalt RNA ved Bruk Av Ribo-Zero Rrna Removal Kit (Human/Mouse/Rat) (Epicenter). Det rRNA-utarmede RNA ble brukt til å syntetisere den første strengen cDNA ved Hjelp Av hevet® III Førstestrengsyntesesystem (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble den andre strengen generert ved Bruk Av E. COLI DNA ligase (Invitrogen), E. coli DNA polymerase (Invitrogen), og dUTP, dCTP, dATP, og dGTP sett (10 µ Hver, Promega), I Den Andre Trådbufferen (Invitrogen). Deretter ble cDNA skåret med Covaris til omtrent 300bp. Etter fragmentering ble prøver renset Med MinElute kolonner (Qiagen). Og de fremspringende 3′ og 5′ endene av fragmentene ble reparert ved Hjelp Av T4 DNA-Polymerase (NEB) og T4 DNA-Polynukleotidkinase (NEB) I T4 DNA-ligasebuffer (NEB). Deretter ble da ender generert ved å bruke Klenow Fragment (3 ‘- > 5 ‘ exo -, NEB), I Buffer 2 (NEB). Adapterligeringsreaksjoner ble deretter satt opp ved hjelp av indekserte adaptere og Hurtig Ligase (NEB). Produktene ble brukt som mal FOR UNG (Fermentas) behandling OG PCR forsterkning ved Hjelp Av Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Bibliotekene ble visualisert på 2% E-Gel® Generelle Formål Agarose Gels (Invitrogen). De strekkodede bibliotekene ble sekvensert på en enkelt kjørefelt Av En HiSeq2500 (Illumina).
