Hi-Fi & Effektiv PCR Enzym: KOD DNA polymerase
den hypertermofile archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (tidligere Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig . 1) ble isolert fra en solfatarisk varm kilde (Fig. 2) På Kodakara island (Fig. 3) I Japan, og ble identifisert og karakterisert.
en familie B DNA-polymerase (KOD DNA-polymerase) ble funnet i DENNE KOD1-stammen og viser forskjellige unike egenskaper (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Adresse: Kodakara island, Japan)
-
Fig. 3. Billige flybilletter Til kagoshima, Japan)
KOD DNA polymerase utviser sterk 3’→5 ‘ eksonukleaseaktivitet( proof-reading aktivitet), en aktivitet Som Taq DNA polymerase mangler.
Videre viser dette enzymet utmerket prosessivitet og forlengelsesevne, og viser en fem ganger høyere forlengelseshastighet (100-130 nukleotider/sekund) og 10-15 ganger høyere prosessivitet (>300 baser) enn Den Fra Pyrococcus furiosus (PFU DNA polymerase). Forlengelseshastigheten for dette enzymet er omtrent 2 ganger høyere enn For Taq DNA-polymerase (Tabell 1) (Fig. 4) (1).
Tabell 1. Egenskaper av termostabile DNA-polymeraser
| Proterty | Verdi for indikert DNA-polymerase | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNA polymerase | Pfu DNA polymerase | Taq DNA polymerase | |
| Opprinnelse | Arkea | Arkea | Bakterier |
| Utledet molekylmasse (kDa )) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| Optimal temperatur (º) | 75 | 75 | 75 |
| Optimal pH ved 75º | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Termostabilitet (halveringstid) | 95º,12 timer; 100oC, 3,0 timer | 95º, 6 timer; 100º, 2,9 timer | 95º, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Sammenligning av forlengelseshastigheter FOR KOD PFU OG TAQ DNA polymerase.
forlengelseshastigheten ble målt i henhold til lengden av syntetisert DNA, ved Bruk Av M13 ssDNA som mal VED 75º.
parallelt med studiet av AKTIVITETENE TIL KOD DNA-polymerase ble nøytraliseringsantistoffer for polymerasen og korrekturlesingsaktivitetene utviklet (2). Disse antistoffene kan påføres «hot start PCR-teknologien» ved BRUK AV KOD DNA-polymerase.
3-D-strukturen AV DNA-polymerase ble karakterisert i 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. 3-d struktur AV KOD DNA polymerase
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
Spill På Esporter Iframemirror.Xyz KOD-201) ble utviklet basert PÅ KOD DNA polymerase og viser høy PCR-troskap (Table2).
Tabell 2. Sammenligning av mutasjonsfrekvensen til HVERT PCR-enzym.
| totale baser Sekvensert | antall muterte baser | Mutasjonsfrekvens (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNA polymerase | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq – base long-PCR enzym | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA polymerase | 102,708 | 145 | 141.2 |
Fidelity ble målt som mutasjonsfrekvensen ved å sekvensere PCR-produktet. ETTER kloning AV PCR-produktet (2,4 kb av den humane beta-globin-regionen) ble ca 96 kloner valgt og sekvensert.
KOD FX (Kode Nr. KFX-101) ble utviklet basert PÅ KOD DNA polymerase og viser en mye større PCR suksessrate (basert på effektivitet og forlengelse evner)ENN KOD-Plus – (Kode Nr. KOD-201) eller Andre Taq-baserte PCR-enzymer. KOD FX er også effektiv for forsterkning fra råprøver(f. eks.
Fig. 6. Direkte forsterkning fra en rå mus hale lysat
1,2: KOD FX
3~6: andre selskapets enzymer
M: Markører
