C. Polyakrylamid Innebygd Med Fluorescerende Perler
som beskrevet i forrige avsnitt, viste silisiumsubstrater seg verdifulle for å måle kreftene som utøves av raskt bevegelige keratocytter. Imidlertid er disse samme substratene mye mindre nyttige for å studere de fleste pattedyrceller. For trekk som skal beregnes nøyaktig, må substratet justeres for å matche motiliteten og kraftgenereringen av en gitt celletype. Det er vanskelig å nøyaktig produsere et silisiumsubstrat av ønsket samsvar for langsommere bevegelige celler som er i stand til å utøve høyere krefter. For å overvinne denne begrensningen brukte Dembo Og Wang (1999) et substrat av polyakrylamid innebygd med fluorescerende perler i submikrometerstørrelse. Overholdelse av polyakrylamidsubstrata kan avstemmes kjemisk ved å variere monomer-og tverrbindingskonsentrasjonene (Pelham og Wang, 1997). Polyakrylamid gir flere ekstra fordeler over silisiumsubstrata. Over et bredt spekter av deformasjoner utviser den lineært elastisk oppførsel. Også, polyakrylamid er vanligvis ikke mottagelig for cellebinding på egen hånd, uten konjugering av spesifikke celle adhesjon ligander (Nelson et al., 2003). Derfor er det et perfekt stillas for å studere celleadhesjon og oppførsel på en kontrollerbar, definert måte.
beregningsmetoden ved hvilken deformasjoner i substratet brukes til å bestemme trekkene som utøves av cellen, er svært lik metodene som brukes på den nevnte stressede silisiumsubstrata. Bruk av fluorescerende markører har imidlertid forbedret sporingsmetoden og evnen til å beregne et nøyaktig belastningsfelt.
dembo og Wang publisert flere studier ved hjelp av den resulterende teknikk, trekkraft mikroskopi, som belyse mekanismene for fibroblast migrasjon. Spesielt har de vist at lamellipodien til cellen gir nesten all den kraften som kreves for fremover bevegelse (Munevar et al.( 2001a). Deres resultater indikerer at lamellipodiet er en mekanisk enhet forskjellig fra resten av cellekroppen. Interessant, synes denne samme mekaniske delingen i cellen ikke å eksistere I H-ras-transformerte celler, kanskje forklarer forskjellen i deres motile oppførsel. I tillegg, Beningo et al. (2001) undersøkte rollen som fokaladhesjoner i regulering av trekkgenerering og fant at størrelsen på fokaladhesjoner er omvendt relatert til mengden kraft som genereres. Videre samsvarer fordelingen av adhesjoner ikke godt med fordelingen av trekkraftkrefter. Forfatterne konkluderer med at disse resultatene kan indikere at tidlige fokale komplekser er ansvarlige for sterke drivkrefter, og modning av disse adhesjonsstedene resulterer i en endring i passive forankringssteder — en konklusjon som har blitt mye diskutert i litteraturen. I tillegg undersøkte Dembo og kollegaer de dynamiske rollene som front-versus-bakre adhesjoner (Munevar et al., 2001b), m. i. iib (Lo Et al., 2004), fokal adhesjonskinase (Wang et al., 2001), og strekkaktiverte Ca2+-kanaler spiller i fibroblastmigrasjon (Munevar et al., 2004). Ved hjelp av trekkraftmikroskopi har Dembo og kollegaer gjort betydelige fremskritt i å forstå rollen som kraftgenerering i fibroblastmigrasjon.
En av de viktigste tekniske fremskrittene ved bruk av polyakrylamidgel er evnen til pålitelig å kontrollere overholdelse av det cellulære substratet uten å endre ECM-tettheten. Tuning overholdelse av substratet var et kritisk vendepunkt i utviklingen av trekkraftmikroskopi, da det tillot undersøkelse av nesten hvilken som helst celletype og forståelse av celleadferd som en funksjon av det mekaniske miljøet. Før Studien Av Pelham Og Wang (1997) fokuserte de fleste studier som undersøkte cellemigrasjon og adhesjon på cellemigrasjon som respons på dets oppløselige kjemiske miljø (kjemotaksis) eller som respons på liganden konjugert til substratet (haptotakse). I tillegg fokuserte studier som involverte cellens mekaniske miljø på responsen på grunn av pålagte krefter som væskeskjærspenning og mekanisk strekk. Ved å endre stivheten i substratet skapte Pelham Og Wang (1997) Imidlertid et betydelig skifte i måten forskere nærmer seg cellulær respons og mekanotransduksjon. Ved hjelp av polyakrylamidsubstrata holdt Pelham Og Wang ECM-tettheten på substratet konstant mens de endret mekanisk overholdelse. De viste at fibroblaster er i stand til aktivt å reagere på mekanisk overholdelse av deres substrat. Celler på stivere geler er mer spredt og migrerer langsommere enn celler på mer kompatible geler. Videre reflekteres cellens evne til å fornemme den mekaniske overholdelse av deres substrat i deres evne til å endre fosforyleringstilstanden til mange proteiner inneholdt i fokaladhesjonsstrukturen. Fokaladhesjoner på stive underlag er større, lengre og mer stabile, mens fokaladhesjoner på mer kompatible underlag inneholder mindre fosforylert pp125FAK og paxillin og virker mye mer uregelmessig. Disse resultatene var de første som tyder på at mekaniske ECM-signaler kan være like viktige som kjemiske tegn for å regulere celleadhesjon.
Siden den banebrytende artikkelen Av Pelham og Wang (1997) har en rekke studier undersøkt effekten av samsvar på celleadferd. Lo et al. (2000) brukte polyakrylamidkjemi til å skape et substrat som inneholder et trinn i stivhet – et sentralt område av substratet der to substrater med forskjellige overholdelser møtes. De viste en oppførsel som kalles durotaxis, hvor cellene var i stand til aktivt å oppdage og reagere på endringer i substratets overholdelse. Celler som migrerte på det myke substratet, ved å treffe grensen til den stive myke overgangen, ville krysse på det stive substratet, mens celler på stive underlag viste høyere trekk og mer spredt område, og enten trukket tilbake eller endret retninger som svar på den stive myke grensen. Senere, Wong et al. (2003) undersøkte fibroblasters evne til å migrere på polyakrylamidhydrogeler som inneholder gradienter av samsvar, i stedet for et trinn, som Det Ble gjort Av Lo og medarbeidere. De fant at vaskulære glatte muskelceller har en tendens til å migrere raskere på mykere underlag enn på stivere underlag (15 kPa vs 25 kPa), og at celler har en tendens til å akkumulere på stivere underlag. Videre syntes migrasjonsmønsteret på gradient-kompatible geler å være rettet mot de stivere gelområdene i stedet for å vise det typiske tilfeldige gangmønsteret som er karakteristisk for cellemigrasjon. Engler et al. (2004) undersøkte videre cellerespons på kompatible geler og viste at responsen i stor grad er formidlet av samlingen av actin cytoskelettet. Ved å teste for endringer i cytoskelettet, Engler og kolleger var i stand til å vise at liten overuttrykk av aktin i cellen kan kompensere for tap av spredning sett i myk gel responser. I tillegg, Yeung et al. (2005) viste at følsomhetsgrensen for compliance sensing er celletypespesifikk og at cellecellekontakter også kan bidra til å redde morfologiske endringer sett i de myke substratene for å mer likne morfologien til celler på stivere substrater (Yeung et al., 2005). Samlet sett er studien av durotaxis fortsatt relativt ung, og mye gjenstår å bli lært om hvordan en celle mekanisk sanser og reagerer på materialegenskapene til substratet og miljøet.
