2.3.4.1 Strukturen
apo-sCTLA-4-homodimeren ble uttrykt som et Trombin-spaltbart Fc-fusjonsprotein I CHO-celler i nærvær av kifunensin.23 Etter deglycosylering ga homodimeren krystaller som diffrakte Til Braggs mellomrom på 1.8 Å, med enhetscelledimensjoner på a = 43.86 Å, b = 51.46 Å og c = 102.85 Å og romgruppen P212121 (Ref . 130). Strukturen ble løst ved molekylær erstatning. Den asymmetriske enheten besto av en disulfid-bundet homodimer som tillot sammenligninger med sctla-4/sB7-1 og sCTLA-4/sB7-2 komplekser, og med sCTLA-4 bundet til et konstruert lipokalin.131
de to monomerene i den asymmetriske enheten besto av β-sandwich-domener MED AGFCC ‘ og ABED topologi som forventet Av Metzler et al.132 en kort åtte-rester «stengel» disulfid-limt På Cys122 knyttet IgSF domener til membranen. Uventet var de to halvdelene av apo-CTLA – 4 homodimeren mindre lik hverandre enn deres komplekse motstykker, og understreket at bindingen ikke er ledsaget av store strukturelle omarrangementer (Fig. 2.2 H). Automatiserte struktur sammenligninger identifisert CD28 OG PD-1 som strukturer mest lik CTLA-4. Viktige forskjeller MELLOM CTLA-4 OG CD28 var: (i) tilstedeværelse av en kink I β-streng G PÅ CD28, (ii) endringer i sløyfestørrelse inkludert utvidede AB -, BC-og CC-løkker I CTLA-4 og en avkortet C»D-sløyfe og (iii) H-binding Av C’ og C» β-tråder som følge av reposisjonering AV C’ C» – sløyfen I CD28. Av sentral betydning var i stor grad identisk konformasjon AV FG loop 99MYPPPY104 sekvens danner kjernen av deres ligand-bindende overflater. Bare et enkelt vannmolekyl kunne bli funnet i den uvanlig tørre ligandbindende overflaten av apo-CTLA-4, mens 228 farvann ble oppdaget andre steder.
ETTER CD28 og PD-1 var DE nest mest liknende strukturene TIL CTLA-4 V-set-domenet 215 antistoff-eller TCR V-domener, som for det meste bare varierte i sløyfelengder. R.m. s. – forskjellen for superposisjon AV CTLA – 4 med det mest liknende TCR Va-domenet var 2,09 Å for 102 rester, i motsetning til 2,89 Å for 86 rester for superposisjon med D1 FOR CD2. Viktige fellestrekk med Va-domenet inkluderte den lange cc-sløyfen og konserverte β-buler i C ‘og G β-strengene som påførte EN uttalt vri PÅ AGFCCS’ β-ark. Spesielt bemerkelsesverdig var den høye graden av sekvensbevarelse og Ca-konformasjon nær g-strengen β-bule, det VIL SI GNGTQIYV (CTLA-4) og GDGTQLVV (Va). I CD2 og CTLA-4 var løkkene like, og domenene varierte i den grad som: (i) i CD2 det var ingen H-binding av ßA og ßB tråder, (ii) det var ingen vri på EN’GFCC’ β-sheet i CD2 på grunn av omposisjonering av β-buler, (iii) plasseringen av C» β-strand i CD2 men ikke CTLA-4 tillatt kanonisk H-binding og utvidelse av AGFCC’C» β-sheet, og (iv) CTLA-4 manglet vri i FG-løkke til stede i CD2 (og også, for eksempel, B7-1). Analysen av femtito V-set igsf-domener ved hjelp av et sekvensielt strukturjusteringsprogram133 indikerte AT CD28/CTLA-4-familien omfatter EN undergruppe Av v-set-domener som er forskjellig fra grupperingene AV CD8, antigenreseptorer og» adhesjonsmolekyler», for eksempel B7-1 og CD2. SAMLET sett var DET større likhet MELLOM CD28 / CTLA – 4-undergruppen og antigenreseptorfamilien, sammenlignet med adhesjonssettet. Analysen antydet AT CD28 / CTLA – 4 familieproteiner og antigenreseptorer delte en felles forfedre muligens lik PD-1, med de to familiene divergerende tidlig.
Apo-CTLA-4 besto av en homodimer med sine underenheter som adopterte et arrangement som favoriserte ortogonale bivalente interaksjoner med ligander plassert på apposerende celleoverflater. Sammenligninger med CTLA-4-monomerparene I b7-1-og B7-2-kompleksene 106,107 og monomeren i lipocalin-komplekset131 viste svært begrenset rotasjonsfleksibilitet ved homodimer-grensesnittet og bemerkelsesverdig få, om noen, endringer som kan tilskrives ligandbinding. De eneste forskjellene var tydelige I b7-2-komplekset, med liten reposisjonering AV BC – og CC-løkkene, og Av C » β-strengen og nabosløkkene, og konformasjonsforskjeller I G β-strengen Ved Sin C-terminus. Disse lokale variasjonene var fjernt fra ligandbindingsstedet TIL CTLA-4, og i intet tilfelle skilte apo-monomerer seg systematisk fra alle fem komplekserte CTLA – 4-monomerer. Hovedkjedeatomposisjonene TIL 99mypppy104-sekvensen var i det vesentlige identiske.
strukturene til kompleksene dannet AV CTLA-4 Med B7-1 og B7-2, som ikke tidligere var sammenlignet, var ganske forskjellige.130 Substitusjon I B7-2, Av Val28 vs Arg29 I B7-1, dannet en bindende lomme I B7-2 som bare ble fylt delvis AV CTLA-4. Dette sørget For At b7-1/CTLA-4-komplekset viste bedre form komplementaritet enn b7-2/CTLA-4-komplekset. Kompenserer litt for dette, overflatearealet begravd I B7-2 AV CTLA-4 var noe større enn For B7-1. Samlet sett bundet B7-1 CTLA-4 på en enda mer stiv kroppslignende måte ENN CTLA – 4 engasjert B7-1. B7-2 binding AV CTLA-4 var imidlertid mer kompleks og bar kjennetegnet av » indusert passform.»I CTLA – 4 bound-vs apo-B7-2 var det et 2,3–3,5 Å skifte Av b7-2 FG-sløyfen mot CTLA-4, som ble initiert av en ~ 120 graders rotasjon Av Phe31 Av B7-2 (Ref. 130). Dette ga en stablingsinteraksjon Av Phe31 med Pro102 AV 99mypppy104-sekvensen AV CTLA-4.
