Kluyveromyces marxianus utvikler etanoltoleranse under adaptiv evolusjon Med betydelige forbedringer av flere veier

Forbedret motstand mot etanol etter en 100-dagers evolusjon
DNA-analyse tyder på At k. marxianus ikke har noen endring av ploidi eller kritiske gener under adaptiv evolusjon
en global rewiring indusert av 100-dagers evolusjon
KM-100d forbedret etanolbruk
KM-100D forbedret membran lipidbiosyntese, anti-osmotisk trykk, anti-oksidativt stress og proteinfolding for å motstå etanolspenning
Validering av forbedret etanolforbruk og flere stressmotstand I KM-100D

Forbedret motstand mot etanol etter en 100-dagers evolusjon

villtype haploid k. marxianus-stammen ble dyrket i medium med 6% (v/v) etanol ved 30 °C i 100 dager om 450 generasjoner (se metoder for detaljer). Det var en kontinuerlig økning i biomasse (målt VED OD600 daglig) i denne perioden (Fig. 1a), indikerer celle overlevelse under etanol stress kan forbedres. På slutten fikk Vi En k. marxianus-befolkning med kraftig forbedret motstand mot etanol(Fig. 1b). GJENNOM, KM refererer TIL rå stammen før evolusjon, OG KM-100D refererer Til k. marxianus befolkningen etter 100-dagers evolusjon. Maksimal etanolfasthet for KM var 7% (v / v) og FOR KM-100D var det opptil 10% (Fig. 1b). Vi sammenlignet vekstprofiler MELLOM KM OG KM-100D i kulturmedier med ulike etanolnivåer (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / V, Fig. 1c). I fravær av etanol var det ingen signifikant forskjell mellom stammene. Deres forskjell økte med økningen av etanolnivå og nådde maksimumet med 6% (v/v) etanol i kulturmedier. I slike tilfeller, etter 48 h, biomassen AV KM-100d var nesten dobbelt høyere ENN KM. Begge stammene viste retarded vekst i medium med 7% etanol og klarte ikke å vokse i mediet med 8% etanol. I TILLEGG VISTE KM-100d også bemerkelsesverdig høyere maksimal vekstrate ENN KM ved 6% etanol (Tilleggsfil 1: Figur S1).

DNA-analyse tyder på At k. marxianus ikke har noen endring av ploidi eller kritiske gener under adaptiv evolusjon

for å belyse DNA-endringer I KM-100d, gjennomførte VI DNA-ploidianalyse og DNA-mutasjonsidentifikasjon. UNDER den adaptive utviklingen HAR DNA-innholdet I k. marxianus-befolkningen liten endring (Tilleggsfil 1: Figur S2); dermed fant ingen ploidiendring sted. VED DNA-seq-analyse AV KM OG KM-100D, som begge ble kartlagt til referansegenomet Av k. marxianus DMKU 3-1042, BLE SNP-stedene MELLOM KM OG KM-100D oppnådd (Tilleggsfil 2). Blant de identifiserte 57 Snp-Ene var bare 4 steder dominerende I KM – 100d-befolkningen. Tre av dem er lokalisert I kodingsområdet SAN1 -, YAP1-og KHT2-gener; den andre er ved 445 bp oppstrøms ERG26. 1324-stedet FOR SAN1 ble mutert Fra C Til T, og følgelig ble den tilsvarende aminosyren transformert fra arginin til cystein. Men ifølge analyse Av Pfam 32.0, faller denne mutasjonen ikke inn i et identifisert proteindomene. Begge mutasjonene I YAP1 OG KHT2 er synonyme mutasjoner uten proteinendring. Ovennevnte funn tyder på at endringer I DNA-sammenheng er langt fra tilstrekkelig til å støtte en slik fenotypeforbedring I KM-100D, og transkripsjonell omprogrammering må bidra til dette. Derfor utførte vi videre rna-seq-analyse.

en global rewiring indusert av 100-dagers evolusjon

for å forstå etanoltoleransen grundig, utførte VI EN RNA-seq-analyse for å sammenligne genuttrykk AV KM og KM-100d gjær som vokste i media med 4% og 6% (v/v) etanol. Basert på vekstprofiler (Fig. 1c) ble det observert at vekstevne MELLOM KM – 100D OG KM hadde maksimal forskjell ved 48 h; derfor ble prøver ved 48 h samlet for rna-seq-analyse. Innstilling| log2ratio / ≥ 1 og p verdi < 0.05 som kriterium for å definere signifikante Differensielt Uttrykte (de) gener, utførte VI de genidentifikasjon i syv grupper (Fig. 2, betegnet som 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 7). I hver gruppe ble de-analysen utført i henhold til pilen som pekte på kontrollen. Tilleggsfil 3 gir uttrykksverdier og differensial uttrykksstatistikk over alle gener. DET er en global uttrykksforskjell MELLOM KM og KM-100D da begge vokste i et etanolfritt medium(Fig. 2 gruppe①). KM-100d gjær har 1342 gener med høyere uttrykk enn KM gjær, mens bare 188 gener har lavere uttrykk. I media med 4% og 6% (v/v) etanol, er antall opp-regulerte gener I KM-100d sterkt redusert til 415 (Gruppe②) og 453 (Gruppe③), henholdsvis. Imidlertid er de oppregulerte gennumrene fortsatt mye mer enn de med lavere uttrykk (henholdsvis 104 og 182 gener). DISSE resultatene tyder på AT KM-100d gjær blir transkripsjonelt rewired ved å aktivere et stort antall gener. Forslaget ble ytterligere støttet av etanol-induserte uttrykksendringer INNENFOR KM og KM-100D gjær. Under induksjon av 4% og 6% (v/v) etanol HAR KM-gjærene 1452 og 1465 up-regulerte gener (Grupper⑤) mens KM-100d-gjærene bare har 631 og 596 up-regulerte gener (Henholdsvis Grupper ④ og⑤). I tillegg brukte vi heatmap.2 programvare I R-pakke til klyngegener og grupper basert på log2ratio-verdier (Tilleggsfil 1: Figur S3) og fant at gendifferensialuttrykksprofilen I Gruppe ① er nær Den For Grouptionary. TIL sammen opprettholdt KM-100d gjær mange etanolinducerte uttrykksfunksjoner, selv om de vokste i et etanolfritt medium. Funksjonene gjør at den utviklede cellen blir mer adaptiv til kommende etanolstimulering, dvs. KM – 100d gjær trenger ikke aktivere så mange gener SOM KM gjør.

Deretter utførte vi i hver gruppe gene ontology (GO) anrikningsanalyse FOR de gener (Tilleggsfil 1: Figur S4), og fant at de berikede GO-termene dekket et bredt spekter av cellulære grunnleggende fysiologiske prosesser, inkludert ribosombiogenese,aminosyrebiosyntese, DNA-reparasjon, RNA-behandling, etc., men ikke direkte relevant for etanolresistens. Derfor, i det følgende, fokuserte vi spesielt på veier som er sterkt forbundet med etanolmetabolisme og toleranse, ved å analysere de tilknyttede de-gener(Tilleggsfil 4).

KM-100d forbedret etanolbruk

for å lette grafillustrasjonen ble log2ratio-verdiene av involverte de-gener (Tilleggsfil 4) delt inn i fem intervaller: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (og ovenfor), som vist I Fig. 3.

forskjellen MELLOM KM OG KM-100D i etanolforbruk ble undersøkt. Som illustrert I Fig. 3, to ruter kan eksistere for direkte forbruk av etanol, og var både oppregulert I KM og KM-100D når de møtte etanol(Grupper④,⑤,⑤, and④). En måte er via cytoplasmatisk ADH6, som katalyserer etanol til acetaldehyd, tilrettelagt AV NADP+. Den andre er ved mitokondriell ATF1, som fremmer etanol forestring ved hjelp av acetyl-CoA. SPESIELT I KM-100D under etanolspenning (Grupper ④ og⑤) BLE YGL039W oppregulert for å generere MER NADP+, og kan dermed levere flere koenzymer for å konvertere etanol til acetaldehyd for å redusere etanoltoksisitet. I mitokondrier, FOR KM eksponert i etanolstress (grupper ⑤ og④), VAR BARE C2E1P301 og ADH4 oppregulert. MENS I KM-100D, UNDER prosessen fra etanol til aldehyd til acetat, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 og ALD6 var alle opp-regulert (Gruppe①). De nevnte endringene indikerer AT KM-100D kan skaffe seg ny evne til å lindre etanoltoksisitet ved å øke etanolforbruket. Teorien forklarer AT KM-100d utført OVER KM i medium med etanol.

KM-100D forbedret membran lipidbiosyntese, anti-osmotisk trykk, anti-oksidativt stress og proteinfolding for å motstå etanolspenning

Foruten å bli konsumert, påvirker den akkumulerte etanolen direkte cellemembranintegritet, endrer indre og ytre osmotisk trykk, forstyrrer proteinkonformasjon og induserer reaktiv oksygenart (ROS) generasjon, og forårsaker dermed alvorlig skade på gjærcelle . I det følgende analyserte VI de gener i disse veiene for anti-etanol-forårsaket skader I k. marxianus(Fig. 4).

etter etanoldrevet evolusjon ble alkoholstressresponsveien I KM-100D aktivert. ASR1, som translokerer fra cytoplasma til kjernen ved eksponering for etanol , og ETP1, som fungerer som et cytoplasmatisk retensjonsprotein med en rolle i etanolavhengig transkripsjonell aktivering av varmesjokkproteingener , ble begge oppregulert I KM-100d (Grupp①), og delvis oppregulert I KM-møtt etanol (Grupper ⑤ og④), noe som tyder på AT SELV I et etanolfritt medium, KAN KM-100D forberede responsive veier for etanolutfordring, akkurat som KM respons på etanol.

dannelsen av membran lipid spiller en viktig rolle i å holde cellemembran integritet under etanol stress . Umettede fettsyrer, nøkkelkomponentene i cellemembranstruktur, er nært knyttet til etanoltoleranse . Illustrert I Fig. 4, fra acetyl-CoA til umettet fettsyrebiosyntese for å inkorporere i fosfolipid, ble de involverte generene PPT2, FAD2 og TAZ1 alle oppregulert I KM-100d (Gruppe①), noe som tyder på AT ETTER evolusjon KAN KM-100d allerede forbedre umettet fettsyrebiosyntese for å levere flere råvarer til cellemembranbiogenese. Og nedreguleringen av gener ACC1, TSC13, FAS1 i KM eksponert i etanol (grupper ⑤ og④), er i samsvar med forrige rapport, som kan utgjøre k. marxianus ‘ svake etanoltoleranse før adaptiv evolusjon.

et stort antall gener assosiert med cellemembran lipidbiogenese, inkludert fosfoglycerid, sfingolipid og sterol, ble differensielt uttrykt under etanolspenning (Fig. 4). Spesielt gener involvert i fosfoglyserid biosyntese var generelt opp-regulert I KM – 100d (Gruppe①) og I km-faced etanol (Grupper ① og④), noe som indikerer at fosfoglyserid kan være hovedkomponenten i cellemembran for etanolresistens. ERG9 OG ERG7) nedregulert I Grupper ④ og⁰, og flere gener ble oppregulert I Gruppe ⑤ (F. eks ERG25) Og Gruppebasert (F. eks ERG26), noe som tyder på at sterol biogenese kan være viktig for å stå opp til høy etanol, men ikke for lav etanol. I tillegg var gener CKI1, ERG2 OG ERG25, involvert i fosfoglyserid og sterolbiosyntese, bare oppregulert I Gruppe⑤; dette kan være en av ledetrådene FOR KM-100ds bedre ytelse ENN KM i høy etanol.

høy etanolkonsentrasjon i et medium pålegger osmotisk stress på gjærceller . Som vist I Fig. 4, plasmamembranens osmotiske sensorer (SLN1, OPY2 OG SHO1) og gener (HOG1, SSK1 og SSK2) involvert i nedstrøms responsiv vei var alle oppregulert I KM eksponert i lav etanol (Gruppe⑤), og individuelt oppregulert I KM-100d (Gruppe①), I KM-100d møtte etanol (Grupper ④ og⑤), OG I KM konfrontert med høy etanol (Groupinois). Glyserolproduksjon er en viktig måte For s. cerevisiae å motstå osmotisk trykk . NÅR KM og KM-100D møtte etanol, ble de fleste gener relatert til glyserolbiogenese nedregulert. Ovennevnte funn tyder på at Før Og Etter evolusjon, K. marxianus forbedrer alltid veier for å føle og transdusere osmotiske stresssignaler; imidlertid kan strategien for å motstå osmotisk stress ikke stole på glycerolproduksjonsruten, det må eksistere noen andre måter.

Cellevegg gir tilstrekkelig mekanisk styrke for cellen til å motstå osmotisk trykk, og den sekretoriske banen transporterer ikke bare celleveggproteiner utover, men overfører også lipider til plasmamembran for å styrke membranstrukturen; derfor kan disse to prosessene være ansvarlige for anti-osmotisk stress. Vi analyserte de gener i sekretorisk vei og celleveggbiogenese (Tilleggsfil 1: Figur S5). Gener involvert i sekretorisk vei og celleveggbiogenese ble generelt oppregulert I KM-100d (Grupp①), og noen av dem ble også oppregulert I KM eksponert i etanol (Grupper①). DET innebærer AT KM-100D ikke bare opprettholdt oppreguleringen i sekretorisk vei for KM motstandsdyktig mot etanolspenning, men også utvidet aktiveringsområdet for sekretorisk vei for å forberede etanolangrep; derfor kan forbedring av sekretorisk vei og celleveggdannelse være DEN nye strategien KM-100D utviklet for å tåle etanol-forårsaket osmotisk stress. PÅ DEN annen side, FOR KM og KM-100D eksponert i lav etanol (Grupper ④ og⁰), var mange gener i sekretorisk vei begge nedregulert, noe som tyder på at sekretorisk baneaktivering kanskje ikke er den nødvendige måten For k. marxianus å reagere på lav etanol.

For mot oksidativt stress utløst av etanol (Fig. 4), HYR1, som fungerer som en sensor og transduser av hydroperoksidspenning, ble oppregulert I KM og KM-100D, begge eksponert i høy etanol (Grupper ⑤andascript). Oksidativt stress-responsive transkripsjonsfaktorer SKN7 OG STB5 ble oppregulert I KM – 100d (Gruppe①) og I KM møtte høy etanol (Grouptionary). MTM1 OG PRX1) generelt opp-regulert I KM-100D enten eksponert i etanol eller ikke (Grupper①, ④ og⑤). For tioredoksinsystemet kan gener (f. eks., MXR1 OG TRR1) ble oppregulert I KM OG KM-100D begge møtt etanol. Tioredoksin og dets reduktase ble også rapportert å øke k. marxianus toleranse for flere lignocellulosederiverte hemmere . For glutaredoxin-systemet ble gener GRX2 OG GLR1 bare oppregulert I KM – 100d eksponert i høy etanol (Gruppe⑤). For peroksisombiogenese ble gener som PEX6 OG PEX7 oppregulert I KM – 100d (Gruppe①), og noen andre gener (F.eks. OVENNEVNTE innebærer AT KM-100D globalt kan styrke antioksidasjonsevnen.

for å sikre riktig proteinfolding under etanolspenning (Fig . 4), var varmesjokk transkripsjonsfaktoren HSF1 oppregulert I KM og KM-100D overfor lav etanol (Grupper ④ og⁰), en rekke chaperonrelaterte gener (F. eks. CPR4) nedregulert I km-mot etanol ble ikke nedregulert I KM-100d. DERFOR KAN KM-100D generelt forbedre proteinfolding for å gi et mer stabilt cellulært miljø.

Det ble rapportert at i s. cerevisiae var trehaloseakkumulering viktig for etanoltoleranse, på grunn av at trehalose fungerte som kompatibelt stoff for å hindre tilstrømning av overskytende salter i gjærceller ; i mellomtiden ble gener involvert i trehaloseforringelse også indusert av etanol, for å justere den ved optimal konsentrasjon . For k. marxianus (Fig. 4), fant vi at gener som deltar i trehalosebiosyntese og nedbrytning (f. eks., NTH1 OG TSL1) ble ofte oppregulert når de ble behandlet med lav etanol (Grupper ④ og⁰), men ikke gene oppregulert i trehalosemetabolisme når de ble eksponert i høy etanol (Grupper ⑤ og④). Dette antyder At i k. marxianus kan trehaloseakkumulering være en spesiell strategi for å takle lav etanol, men ikke for høy etanol.

differensialuttrykkene av 15 gener involvert i de ovennevnte etanoltolerante banene ble validert MED RT-qPCR-analyse (Fig . 5). Genenes uttrykk I Gruppen ① (Fig. 5a) var generelt oppregulert. På den annen side, opp-regulering av gener I Gruppe ④ (Fig. 5d) Og gruppe ⑤ (Fig. 5e) var ikke så høy som I Gruppen ⑤ (Fig. 5b) Og Gruppebasert (Fig. 5c). Vår analyse bekreftet at gener som bidrar til etanoltoleranse, kontinuerlig aktiveres I KM-100d, selv etter at etanolstress er trukket tilbake. Det kontinuerlige genuttrykket kan være nyttig for å stabilisere det intracellulære miljøet og dra nytte av vekst av celler i kommende stress.

Validering av forbedret etanolforbruk og flere stressmotstand I KM-100D

vi sjekket veksten AV KM OG KM-100d gjær i YNB medium med forskjellige karbonkilder(Fig . 6a). BÅDE KM OG KM-100D gjær har samme evne til å utnytte glukose som den eneste karbonkilden. MEN i nærvær av 1% og 2% (v/v) etanol som eneste karbonkilde, VOKSTE KM-100d gjær bedre ENN KM gjær. Resultatet støtter vår nevnte hypotese at KM – 100d gjær utnyttet etanol mer effektivt enn KM gjær gjorde.

på Den annen side, basert På Fig. 4, KM-100D kan utvikle motstand mot etanol-forårsaket flere spenninger samtidig, inkludert osmotisk stress, oksidativt stress og termisk stress (for varmesjokkproteiner tatt som chaperoner for proteinfolding). For å evaluere gjærenes toleranser for flere spenninger, gjennomførte vi cellevibilitetsanalysen for henholdsvis temperatur, oksidasjon og osmotisk trykk (Fig. 6b-d). I de grunnleggende omstendighetene (dvs. 30 °C, 0% H2O2 og 0 M NaCl) mangler en forskjell på levedyktighet MELLOM KM og KM-100d gjær. IMIDLERTID, i nærvær AV DE forskjellige stressene, VISER KM-100d gjær betydelig bedre levedyktighet enn KM-gjærene. Videre er fordelene mer signifikante mens stressene ble mer alvorlige(Fig. 6b-d). Vi forventet at toleransene for flere spenninger kunne introdusere nye funksjoner til gjærene i etanolproduksjon.

vi undersøkte videre etanolproduktiviteten MELLOM KM og KM-100D gjær under flere belastninger. I grunnleggende omstendigheter (30 °C og 0% etanol, Fig. 6E), KM OG KM-100D gjær er nesten det samme i både glukoseforbruk og etanolproduksjon. IMIDLERTID VISTE KM – 100d gjær betydelige fordeler i nærvær av høy temperatur(45 °C, Fig. 6f) eller mer etanol (6% eller 8%, Fig. 6g, h); det vanlige miljøet skjedde vanligvis på sent stadium av gjæring. VI gjennomførte EN RT-qPCR analyse for BÅDE KM OG KM-100D gjær gjæret i media med 6% etanol ved 48 h, 72 h og 120 h (Fig. 7). De fleste av disse etanoltolerante genene ble oppregulert I KM-100d sammenlignet MED I KM, spesielt på tidligere stadium (48 h) for innledende justering av etanol (Fig. 7). FOR å oppsummere, ved å regulere uttrykk for etanoltolerante gener, OVERGIKK KM-100d-gjærene KM-gjærene under stressende miljøer med økte etanolutbytter.