Knocking-down og Knocking-out gener

Gene Knocking-down
denne teknikken tillater reduksjon av uttrykket av en eller flere av anorganisme. Dette kan skje gjennom genetisk modifikasjon eller ved behandling med areagent som et kort DNA-eller rna-oligonukleotid som har en sekvenskomplementær til enten gen eller et mRNA-transkripsjon.
hvis endringen i genuttrykk skyldes et oligonukleotidbinding til en mRNA eller midlertidig binding til et gen, fører dette til samtidig endring i genuttrykk som ikke modifiserer kromosomalt DNA,og resultatet blir referert til som en «forbigående knockdown».
i en forbigående knockdown forårsaker bindingen av dette oligonukleotid til activegen eller dets transkripsjoner redusert uttrykk. Binding kan forekomme gjennomblokkering av transkripsjon, nedbrytning av mRNA-transkripsjonen(f. eks. siRNA eller rnase-h avhengig antisense), eller gjennom blokkering aventen mRNA oversettelse, pre-mRNA spleising steder, eller nuklease spleavagesites brukes for modning av andre funksjonelle Rna, inkludert miRNA (e.g.by morpholino oligos).
den mest direkte bruken av forbigående knockdowns er for å lære om et gen som har blitt sekvensert, men har en ukjent funksjon. Denne eksperimentelle tilnærmingen er kjent som omvendt genetikk. Transient knockdowns brukes oftei utviklingsbiologi fordi oligos kan injiseres ienkeltcellede zygoter og vil være tilstede i dattercellene til den injiserte cellen.

RNA-interferens (RNAi)er et middel til å stanse gener ved hjelp av mRNA-nedbrytning. Gene knockdownved denne metoden oppnås ved å introdusere små dobbeltstrengede interfereringrnas (siRNA) i cytoplasma. En gang introdusert i cellen, eksogenirnas behandles AV RISC. SiRNA er komplementær til targetmRNA å bli brakt til taushet, OG RISC bruker siRNA som en mal for å finne thetarget mRNA. ETTER AT RISC lokaliserer til målet mRNA, spaltes RNA aven ribonuklease.
RNAi brukes til genetisk funksjonell analyse. Bruk Av RNAi kan være nyttig for å identifisere potensielle terapeutiske mål, legemiddelutvikling eller andre applikasjoner.

Gen Knocking-out
Geneknockout (KO) Er en genetisk teknikk der en av en organismes gener er gjort ute av drift. Knockout organismer brukes til å studere genfunksjon, vanligvisved å undersøke effekten av gent tap. Heterozygot Og homozygot Kos: i den tidligere er bare en allel knockedout, i sistnevnte er begge de to allelene slått ut.

den rettede opprettelsen av EN KO begynner i testrøret med et plasmid,et bakterielt kunstig kromosom eller annen DNA-konstruksjon, ogfortsetter til cellekultur. Celler transfiseres med DNAconstruct. Ofte er målet å skape et transgen dyr som harendret gen.
i så fall blir embryonale stamceller genetisk transformert og satt inn i tidlige embryoer. Resulterende dyr med den genetiske forandringen ideres kimlinjeceller kan da ofte passere genknockout til fremtidengenerasjoner.

konstruksjonen er konstruert for å rekombinere med målgenet, som gjøres ved å inkorporere sekvenser fra selve genet inn i konstruksjonen.Rekombinasjon skjer da i regionen av den sekvensen i genet, noe som resulterer i innsetting av en fremmed sekvens for å forstyrre genet.
en betinget knockout tillater gen sletting i en vev eller tidsspesifikk måte. Dette gjøres ved å introdusere loxP-steder rundt genet. Thesesequences vil bli introdusert i kimlinjen via samme mekanisme som aknock-out. Denne kimlinjen kan da krysses til en annen germlinecontaining Cre-rekombinase som er et virusenzym som kan gjenkjenne disse sekvensene, rekombinerer dem og sletter genet flankert av disse nettstedene.
fordi theDNA rekombinasjon er en sjelden hendelse, inkluderer den utenlandske sekvensen valgt for innsetting vanligvis en reporter. Dette muliggjør enkelt utvalg avceller eller enkeltpersoner der knockout var vellykket. Noen Ganger setter DNAconstruct inn i et kromosom uten ønsket homologtrekombinasjon med målgenet.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
det er en teknikk hvor uttrykket av et gen reduseres. Denne reduksjonen kan skyldes EN DNA-modifikasjon eller fra et oligonukleotidbindende enten til mRNA eller til genet. I dette tilfellet er uttrykksendringen midlertidig, så visnakk om forbigående knockdown.
En av teknikkene som tillater forbigående knockdown av et gen beståri bruk Av Morpholino oligomerer. De har blitt en standard knockdown toolin dyr embryonale systemer, Så Morpholinoligos brukes ofte Til å undersøke rollen som et bestemt mRNA-transkripsjon iet embryo. Den molekylære strukturen har DNA-baser festet til en ryggrad av metylenemorfolinringer koblet gjennom fosforodiamidatgrupper. Morpholinos blokkerer tilgangen til andre molekyler til små (~25 base) spesifikke sekvenser av baseparingsflatene av ribonukleinsyre (RNA). Fordiav deres helt unaturlige ryggradene blir Morpholinos ikke gjenkjent avcellulære proteiner. Nukleaser degraderer Ikke Morpholinos, og de nedbrytes heller ikke i serum eller i celler. Det finnes ingen publiserte rapporter om Morfolinos aktiverende toll – lignende reseptorer eller medfødte immunresponser som interferoninduksjon eller nf-kB-mediert betennelsesrespons.Morpholinos er ikke kjent for å modifisere DNA-metylering.
Morpholinos utløser ikke nedbrytningen av deres mål RNA-molekyler, i motsetning til mange antisense strukturelle typer (f.eks. fosforotioater, siRNA). I stedet Morpholinosact av «steric blokkering», binding til et mål sekvens i et RNA, hemme molekyler som ellers kan samhandle MED RNA.
Morpholinos kan også endre spleising av pre-mRNA eller hemme modning og aktivitet av miRNA.
Blockingtranslation
Bundet til 5 ‘- untranslatedregion av messenger RNA (mRNA), Kan Morpholinos interferere medprogresjon av ribosomal initiering kompleks fra 5’ cap til startcodon. Dette forhindrer oversettelse av kodingsområdet for målrettet transkripsjon (kalt «slå ned»geneexpression). Dette er nyttig eksperimentelt når en undersøkerønsker å kjenne funksjonen til et bestemt protein; Morpholinos gir enpraktisk måte å slå ned uttrykk for proteinet og lære hvordandet knockdown endrer cellene eller organismen.
Modifisering av pre-mRNA spleising
Morpholinoscan forstyrre pre-mRNA behandlingstrinn enten ved å hindre split-dirigere små nukleære ribonukleoproteiner (snRNP) kompleksesfra binding til sine mål ved grensene av introner på en tråd av pre-mRNA, eller ved å blokkere nukleofil adenin base og hindre den fra å danne splice lariatstructure, eller ved å forstyrre bindingen av splice regulatoriske proteiner som splice lyddempere og splice enhancers. Forebygging av binding av snRNP U1 (på donorstedet) eller U2 / U5 (på polypyrimidindelen og akseptorstedet) kan forårsake endret spleising, vanligvis ekskludert eksoner fra modent mRNA. Målretting av enkelte spleisemål resulterer i introninneslutninger, mens aktivering av kryptiske spleisingssteder kan føre til delvise inneslutninger eller utelukkelser.Mål For U11 / U12 snRNPs kan også blokkeres. Splice modifikasjon kan værepraktisk analysert ved revers-transkriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)og ses som et båndskift etter gelelektroforese AV RT-PCR-produkter.
KNOCKOUT
en variant av den tradisjonelle gen knockout er Den Betingede gen knockout.
Betinget gen knockout er en teknikk som brukes til å eliminere aspesifikt gen i et bestemt vev, som leveren. Denne teknikken er nyttigå studere rollen som individuelle gener i levende organismer. Det adskiller seg fratradisjonell genknockout fordi den retter seg mot bestemte gener på bestemte tidspunkter enn å bli slettet fra begynnelsen av livet. Ved hjelp av den betingede geneknockout-teknikken eliminerer mange av bivirkningene fra tradisjonell genknockout. I tradisjonell genknockout kan embryonal død fra en genmutasjon forekomme, og dette forhindrer forskere i å studere genet ivoksne. Noen vev kan ikke studeres ordentlig isolert, så genet må være inaktivt i et bestemt vev mens det fortsatt er aktivt i andre. Med detteteknologi, forskere er i stand til å knockout gener på et bestemt stadium iutvikling og studere hvordan knockout av et gen i ett vev påvirker det sammegen i andre vev.
den mest brukte teknikken Er Cre-loxrecombination-systemet. Cre rekombinase enzymet gjenkjenner spesifikt tolox (loci av rekombinasjon) steder i DNA og forårsaker rekombinasjon mellom DEM. Denne rekombinasjonen vil føre til sletting eller inversjonav gener mellom de to lox-områdene, avhengig av deres orientering. Anentire-genet kan fjernes eller inaktiveres. Hele dette systemet er inducible så achemical kan legges til å slå gener ut på et bestemt tidspunkt. To av de mestvanlige brukte kjemikalier er tetracyklin, som aktiverer transkripsjon av theCre rekombinase gen og tamoxifen, som aktiverer transport Av Crerecombinase protein til kjernen. Bare noen få celletyper uttrykker Crerekombinase og ingen pattedyrceller uttrykker Det, så det er ingen risiko for utilsiktet aktivering av lox-steder ved bruk av betinget genknockout hos pattedyr.
en mus som inneholder Cre-genet og en mus som inneholder loxP-sekvensene, blir avlet for å generere en betinget knockout for en particulargene av interesse. Musene uttrykker ikke naturlig Cre rekombinase eller loxsites, men de har blitt konstruert for å uttrykke disse genproduktene for å skape det ønskelige avkom. Du må skaffe en mus der en viktig ekson er floxed (det betyr at den har aLox-P oppstrøms og nedstrøms) og en mus som har En Cre-sekvens hvis uttrykk er regulert av en celletypespesifikk promotor eller en inducerbar promotor. Deretter krysser du disse musene og du får en mus der cellene som ikke uttrykker Cre, vil ha genet med en normal funksjon, mens cellene som uttrykker Cre, vil ha en genfunksjon forstyrret i delen Mellom Lox-P.
(Francesca Luca)

rna interferensmekanisme

RNA-interferensen (RNAi), anancient cellulær antiviral respons, er en naturlig mekanisme for å stanse genuttrykk. Det kan utnyttes for å tillate spesifikk inhibering av funksjon av anytarget-genet. RNAi viser seg å være et uvurderlig forskningsverktøy, det hjelpemidler i identificationof nye gener involvert i sykdomsprosesser.

RNAi er ikke den eneste mekanismen forsilencing genuttrykk (tabell 1).

Tabell 1: Sammenligning mellom ulike metoder for gendeaktivering.

rna interferens (RNAi) oppstår som respons på innføring av dobbeltstrenget RNA (dsRNA)i en celle. DsRna-introduksjonen utløser aktiveringen avdsrna-avhengig proteinkinase-R (PKR). Aktivert PKR fosforylerer initieringsfaktoren EIF2: denne effekten, i forbindelse Med aktivering Av Rnase-L og induksjon av interferonproduksjon, stopper proteinsyntese og fremmer apoptose. Samlet sett antas dette å representere en antiviralforsvarsmekanisme. Rnai er en svært bevart mekanisme gjennom taksonomiske arter . I tillegg til å ha en antiviral aktivitet, antas RNAi også å undertrykke ekspresjonen av potensielt skadelige segmenter av genomet, som transposoner, som kan destabilisere genomet ved å virke som insertional mutagener.

selv om mekanismen ikke er fullstendig belyst, representerer RNAi resultatet av en flertrinnsprosess (Figur 1). Ved å komme inn i cellen er lange dsrnaerførst behandlet Av rnase III-enzymet Dicer. Denne funksjonelle dimer inneholderhelicase, dsrna binding og PAZ domener (deres roller er ikke heltlucidated). Dicer produserer 21-23 nukleotid dsrna fragmenter med twonukleotid 3 ‘ end overheng, dvs. siRNAs. RNAi er mediert AV RNA-indusert silencing complex (RISC) som, guidet av siRNA, gjenkjenner mRNA som inneholder asekvens homolog til siRNA og spalter mRNA på et sted lokalisert omtrent midt i den homologe regionen. Dermed er genuttrykkspesielt inaktivert på et post-transkripsjonelt nivå.

I C. elegans, Dicer har blitt vistå samhandle med rde proteiner. Rde-proteinene binder seg til lang dsRNA og arebelieved å presentere den lange dsRNA Til Dicer for behandling. Mutanter som viser en høy grad av resistens mot RNAi har blitt rapportert å ha mutasjoner atrde-1 og rde-4 loci.

Figur 1: Mekanisme For RNAinterference

forekomsten av doublestranded (ds) RNA i en celle (f. eks. som en konsekvens av virusinfeksjon)utløser en kompleks respons, som inkluderer blant annet fenomener (f. eks.interferonproduksjon og dens konsekvenser) en kaskade av molekylære hendelser kjentsom RNAi. Under RNAi binder det cellulære enzymet Dicer til dsRNA og spalter seg i korte stykker av ~ 20 nukleotidpar i lengde kjent som smallinterfering RNA (siRNA). Disse rna-parene binder seg til det cellulære enzymet som kalles drna-indusert silencing complex (RISC) som bruker en streng av siRNA til å binde til enkeltstrengede RNA-molekyler (dvs.mRNA) av komplementær sekvens. Dauclease aktivitet AV RISC degraderer deretter mRNA, og dermed silencing uttrykk ofthe viral gen. På samme måte antas det genetiske maskineriet av celler å utnytte RNAi for å kontrollere uttrykket av endogen mRNA, og dermed legge til et nytt lag av post-transciptional regulering. RNAi kan utnyttes ieksperimentelle innstillinger for å slå ned målgener av interesse med en høyspesifikk og relativt enkel teknologi (se tekst for flere detaljer).

Foruten genesilencing, Kan RNAi være involvert i andre fenomener av genregulering.. Det ser ut Til At RNAi også kan fungere ved metylering av cytosiner, samt Cpgsekvenser som er mer klassisk forbundet med metylering. Hvis målsekvensen deler homologi med en promoter, kan transkripsjonell silencing forekomme viametylering. Videre SER RNA ut til å interagere med kromatin-domener, somkan til slutt direkte DNA-metylering. Studier Av c. elegans har vist thatRNAi kan spre seg mellom celler gjennom mekanismer som ikke kan hengsle på siRNA.Den systemiske rna interferens mangelfull (sid) locus, sid-1, koder en conservedprotein med et signal peptid sekvens og 11 antatte transmembrane domener, noe som tyder på at sid-1 protein kan fungere som en kanal for lang dsrna,siRNA, eller en for tiden uoppdaget rnai-relatert signal. Sid-1 mutanter retaincell-autonome RNAi, men unnlater å vise spredning Av RNAi. Det forblir uklart om denne systemiske RNAi forekommer hos pattedyr, selv om en sterk likhet er rapportert mellom sid-1 og spådde humane og museproteiner.

(Justine Floret)

Kilde : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang=» en-gb » xml:lang= «en-gb»>

ZFN , TALEN, CRIPR/CAS9

Disse tre molekylære teknologiene tillater edittgenom på en stedsspesifikk måte, hver teknikk med en annen mekanisme. Zinkfingernukleaser (Zfner) og transkripsjonsaktivatorlignende effektornukleaser (TALENs) er kimære nukleaser som består av programmerbare, sekvensspesifikke DNA-bindende moduler knyttet til et ikke-spesifikt DNA-spaltningsdomene. ZFNs og TALENs muliggjør et bredt spekter av genetiske modifikasjoner ved å indusere DNA-dobbelttrådsprekk som stimulerer feilutsatte ikke-homologe endeforbindelser eller homologirettet reparasjon på bestemte genomiske steder.

Bilde tatt fra http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

allsidigheten Til ZFNs og TALENs stammer fra evnen til å tilpasse DNA-bindende domenet for å gjenkjenne nesten hvilken som helst sekvens. DISSE DNA-bindende modulene kan kombineres med mange effektor-domener for å påvirke genomisk struktur og funksjon, inkludert nukleaser, transkripsjonelle aktivatorer og repressorer, rekombinaser, transposaser, DNA-histonmetyltransferaser og histonacetyltransferaser. Dermed er evnen til å utføre genetiske endringer i stor grad avhengig AV DNA-bindende spesifisitet og affinitet av designede sink-finger-og TALEPROTEINER.

Cys2-His2 zinc finger proteiner

Cys2-His2 zinc-finger domenet er blant de vanligste TYPENE DNA-bindende motiver som finnes i eukaryoter og representerer det nest mest kodede proteindomenet i det menneskelige genomet. En individuell sinkfinger består av omtrent 30 aminosyrer i en konservert ββα-konfigurasjon. Flere aminosyrer på overflaten av α-helixen kontakter vanligvis tre basepar i hovedsporet AV DNA, med varierende selektivitet. Den modulære strukturen av sink-finger proteiner har gjort dem til et attraktivt rammeverk for design AV tilpassede DNA-bindende proteiner. Nøkkelen til anvendelsen av sink-finger proteiner for spesifikk DNA-anerkjennelse var utviklingen av unaturlige arrays som inneholder mer enn tre sink-finger domener. Dette fremskrittet ble tilrettelagt av den strukturbaserte oppdagelsen av en svært konservert linkersekvens som gjorde det mulig å bygge syntetiske sinkfingerproteiner som gjenkjente DNA-sekvenser 9 til 18 bps i lengde. Fordi 18 bps DNA-sekvens kan gi spesifisitet innen 68 milliarder bp DNA, tillot denne metoden for spesifikke sekvenser å bli målrettet i det menneskelige genom for første gang.

Transkripsjon Aktivator-lignende effektorer

TALEs er naturlig forekommende proteiner Fra plantepatogene bakterier slekten Xanthomonas, og inneholder DNA-bindende domener sammensatt av en serie av 33-35 aminosyre gjenta domener som hver gjenkjenner en enkelt bp. TALE spesifisitet bestemmes av to hypervariable aminosyrer som er kjent som repeat-variable diresidues (Rvd) . Som sink-fingre, modulære TALE gjentar er koblet sammen for å gjenkjenne sammenhengende DNA-sekvenser. Men i motsetning til sink finger proteiner, det var ingen re-engineering av sammenhengen mellom gjentar nødvendig å konstruere lange arrays Av Historier med evne til teoretisk adresse enkelt områder i genomet. I tillegg til deres rolle i å tilrettelegge HDR (Homolog direkte rekombinasjon), tillater stedsspesifikke nukleaser også rask generering av cellelinjer og organismer med nullfenotyper; NHEJ-mediert reparasjon av en nuklease-indusert DSB fører til innføring av små innsettinger eller slettinger på det målrettede stedet, noe som resulterer i knockout av genfunksjon via rammeskiftmutasjoner.

Bilde tatt fra http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

Forskjellig fra de stedsspesifikke nukleasene beskrevet ovenfor, HAR CRISPR-systemet (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associated (Cas) nylig oppstått som et potensielt lett og effektivt alternativ Til ZFNs og TALENs for å indusere målrettede genetiske endringer. I bakterier gir CRISPR-systemet oppnådd immunitet mot invaderende fremmed DNA via RNA-styrt DNA-spaltning. I TYPE II CRISPR / Cas-systemet er korte segmenter av fremmed DNA, kalt «spacers» integrert i CRISPR genomisk loci og transkribert og bearbeidet til short CRISPR RNA (crRNAs). Disse crRNAs anneal til transaktiverende crRNAs (tracrRNAs) og direkte sekvensspesifikk spaltning og silencing av patogen DNA av Cas-proteiner. Nylig arbeid har vist at målgjenkjenning av Cas9-proteinet krever en» frø » – sekvens i crRNA og en konservert dinukleotidholdig protospacer tilstøtende motiv (PAM) – sekvens oppstrøms for crRNA-bindende regionen. CRISPR / Cas-systemet kan dermed re-målrettet for å spalte nesten ENHVER DNA-sekvens ved å re-designe crRNA. Vesentlig, CRISPR / Cas-systemet har vist seg å være direkte bærbart til humane celler ved samtidig levering av plasmider som uttrykker Cas9 endonuklease og de nødvendige crRNA-komponentene.

Bilde tatt fra https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php