Komparativ Analyse Av Knockout™ Serum med Føtalt Bovint Serum For In Vitro Langsiktig Kultur Av Humane Limbale Epitelceller

Abstrakt

de limbale epitelceller kan opprettholdes PÅ 3t3 mater lag med føtalt bovint serum supplert kulturmedium, og disse cellene har blitt brukt til å behandle limbal stamcellemangel. Imidlertid inneholder føtal bovint serum ukjente komponenter og viser kvantitative og kvalitative lot-to-lot variasjoner. For å forbedre kulturtilstanden ble den definerte KnockOut-serumutskiftningen undersøkt for å erstatte føtal bovint serum for dyrking av human limbal epitelcelle. Humane primære limbale epitelceller ble dyrket i Henholdsvis KnockOut serum og føtalt bovint serum supplert medium. Cellevekst, genuttrykk og vedlikehold av limbale epithelial stamceller ble studert og sammenlignet mellom disse to gruppene. Humane primære limbale epitelceller ble isolert og vellykket serielt dyrket i denne romanen KnockOut serum supplert medium; celleproliferasjon og stamcellevedlikehold var lik de av celler dyrket i føtalt bovint serum supplert medium. Disse dataene tyder på at Denne KnockOut serum supplert medium er en effektiv erstatning til tradisjonelle foster storfe serum supplert medium for limbal epitelcellekultur, og dette mediet har stort potensial for langsiktig vedlikehold av limbal epitelceller, limbal epitel stamceller transplantasjon, og vev gjenfødelse.

1. Innledning

Hornhinneepitel-stamceller ligger i basallaget av limbus, en bølgete og pigmentert struktur kalt Palisader Av Vogt . Disse stamcellene opprettholder kontinuerlig fornyelse av hornhinneepitelet over en levetid og erstatter skadede eller tapte hornhinneepitelceller . Limbal stamcellemangel (LSCD) og tilhørende okulære overflatesykdommer kan behandles med hell ved hjelp av dyrkede limbale epitel autograft . Suksessen til disse kirurgiske behandlingene avhenger av effektiv utvidelse AV limbale epithelial stamceller som involverte 3T3 mater lag og foster bovine serum (FBS) i de fleste tilfeller. 3t3 mater lag kultur system ble satt Opp Av Rheinwald Og Green og har blitt brukt til å utvide epitelceller fra menneskelig hud, hårsekken, limbus, conjunctiva, og munnslimhinnen vev . FBS er imidlertid ikke veldefinert, og det viser alltid kvantitative og kvalitative lot-to-lot-variasjoner . FBS inneholder også potensielt skadelige xenogene komponenter, som kan stimulere immunologiske reaksjoner og overføre dyresykdommer og patogener . Med alle disse bekymringene er det et økende behov for å utvikle veldefinert kulturmedium for å erstatte det tradisjonelle fbs-supplerte mediet.

For Tiden er det visse serumfrie alternative medier for vekst av epitelceller, som definert Keratinocytt Serumfritt Medium (KSFM™, Invitrogen, USA), keratinocyttvekstmedium (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) og Progenitorcelle Målrettet (PCT) media (CellnTEC™, Sveits). Disse produktene har vist seg å støtte utvidelsen av hornhinneepitelceller. Imidlertid trenger de fortsatt kosttilskudd av udefinerte produkter, som bovin hypofyseekstrakt (BPE) eller humant serumalbumin (HAS). Og de fleste av disse mediene krever høy celle seeding tetthet, som kanskje ikke er praktisk for utvidelse av menneskelige hornhinnen epitelceller. Videre kan ikke stamceller fra hornhinneepitel, som påvises som holokloner I 3T3 kultursystem, opprettholdes i denne serumfrie kulturen på lang sikt . Til dags dato er det ikke noe definert serumfritt medium som kan støtte utvidelse av hornhinneepitelceller på lang sikt.

KnockOut serum replacement (SR) Er en definert serumfri formulering, som ble designet for å erstatte FBS direkte for vedlikehold av embryonale stamceller (ESCs) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Det har vist seg At KnockOut SR gir konsistente vekstforhold FOR ES-celle og iPSC-kultur, OG ES-celler dyrket I KnockOut SR-suppleret medium er vesentlig mindre differensiert enn de som vokser I FBS-suppleret medium, og kimlinjeoverføring er ikke kompromittert i det minste. Gitt likheter i kulturen metoder for epitelceller OG ES-celler, og i lys Av Det Faktum Av KnockOut SR erstatte FBS I ES cellekultur, her er det antatt at KnockOut SR kan brukes til å erstatte FBS i limbal epitelcellekultur.

2. Materialer Og Reagenser

cellekulturskåler, flasker, sentrifugerør og serologiske pipetter ble kjøpt fra Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbeccos Modified Eagle ‘ S Medium (DMEM), Hams F-12, HEPES, penicillin og streptomycin, L-glutamin, 0,05% trypsin-0.02% EDTA-løsning, Hevet Iii-sett OG rneasy™ – sett ble kjøpt fra Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Fetal bovine serum (FBS) ble kjøpt Fra Hyclone (Logan, ut; http://www.hyclone.com/). Mus NIH 3T3 fibroblaster (ATCC CCL 92) ble hentet Fra Amerikansk Type Kultur Samling (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II var Fra Roche. Monoklonalt antistoff (mAb) mot ABCG2 (klon BXP-21) og connexin 43 var Fra Millipore; p63 (klon 4A4), K5 og K19 kom Fra Santa Cruz; K3 mAb (klon AE5) var FRA ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-konjugert geit anti-mus sekundært antistoff var Fra Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR Og Taqman Universal PCR Master Mix AMPERASE UNG kits var Fra Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycin C, bovint insulin, humant transferrin, hydrokortison, human epidermal vekstfaktor (EGF), kolertoksin og andre reagenser var Fra Sigma-Aldrich (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).

2.1. Human Limbal Epitelcelleisolasjon Og Dyrking

Hornhinne-limbale ringer ble høstet fra fem friske givere like etter hornhindetransplantasjon, informert samtykke ble søkt, og prøvehøstingsprotokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) Fra Jilin University. Friske hornhinne-limbale ringer ble behandlet med 0,25% Dispase II ved 4°C over natten, og epitellaget ble skrubbet fra det underliggende stromavevet og behandlet med 0,05% trypsin-0,02% EDTA ved 37°C i 15 minutter. Trypsinaktivitet ble nøytralisert med 10% FBS og dissosierte limbale epitelceller ble samlet og sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter. Epitelceller levedyktighet ble bestemt av trypan blå unntatt farging og celle nummer ble talt ved hjelp av hemocytometer.

mus 3t3 fibroblaster ble opprettholdt I Dulbeccos Modifiserte Eagle ‘ S Medium (DMEM, høy glukose) supplert med 10% FBS, L-glutamin (2 mM) og penicillin-streptomycin (50 IE/mL) og dyrket med 5% CO2 og fuktet atmosfære. 3T3 celler ble subkulturert hver 6. dag når de nådde 80-90% sammenløp. 3T3 celler ble serielt opprettholdt, og bare celler før passasje 20 ble brukt til fremstilling av materlag. For å forberede materlaget ble konfluente 3t3-celler behandlet med mitomycin C (10 µ / mL) i 2 timer ved 37°c, vasket med PBS to ganger og behandlet med 0,05% trypsin i 5 minutter ved 37°C. 3T3 fibroblaster ble deretter samlet og belagt med en tetthet på 30 000 celler / cm2 en dag før såing av epitelceller.

Humane limbale epitelceller ble dyrket PÅ 3T3 mater lag ved hjelp AV ENTEN FAD medium eller serum erstatning (sr) medium. FAD-mediet er en blanding AV DMEM Og Hams f-12-medium (1 : 1) som inneholder 10% føtalt bovint serum, L-glutamin (2 mM) Og penicillin-streptomycin (50 IE/mL), epidermal vekstfaktor (10 ng/mL), insulin (5 µ/mL), adenin (0,18 mM), hydrokortison (0,4 µ/mL), koleratoksin (0,1 nM) og trijodtyronin (2 nM). SR-mediet er en blanding AV DMEM Og Hams f-12-medium (1 : 1) som inneholder 10% KnockOut SR-serumerstatning, L-glutamin (2 mM) Og penicillin-streptomycin (50 IE/mL), epidermal vekstfaktor (10 ng/mL), insulin (5 µg/mL), adenin (0,18 mM), hydrokortison (0.4 µ / mL), kolertoksin (0,1 nM), trijodtyronin (2 nM), transferrin (5 µ / mL) og selen (5 ng/mL). Limbale epitelceller ble sådd på 3T3 mater lag med en tetthet på 6000 celler / cm2 og dyrket med 5% CO2 og fuktet atmosfære. KJEPPHEST medium ble endret hver 3 dager mens SR medium ble endret hver 2 dager.

2.2. Colony Forming Efficiency Assay (cfe)

for cfe-analyse ble 200 humane limbale epitelceller fra FAD-kultur eller SR-kultur belagt på 100 mm petriskål som inneholdt mitomycin C-behandlet 3t3-materlag og dyrket som beskrevet ovenfor. Etter 12-dagers kultur ble oppvaskene løst med 10% formalin i 30 minutter ved romtemperatur og farget med 1% Rhodamin B i ytterligere 30 minutter. Etter vask med destillert vann ble kolonitallene talt og analysert. Kolonidannende effektivitet ble uttrykt som antall kolonier dannet dividert med 200.

2.3. Cellepopulasjonsdobbelingsanalyse

Limbale epitelceller ble opprettholdt på mitomycin C-behandlet 3t3 materlag ved BRUK AV FAD medium eller SR medium. Epitelceller ble trypsinisert når de nådde 80-90% sammenløp og passerte ved en tetthet på 6000 celler / cm2. Kulturer ble serielt opprettholdt for 10 passasjer. Ved hvert passasje ble limbale epitelceller høstet og celletall ble talt. Antall populasjonsdoblinger (PD) for hver passasje ble beregnet i henhold til følgende formel: , hvor representerer totalt antall celler oppnådd ved hver passasje og representerer antall plating celler i begynnelsen.

2.4. RNA-Ekstraksjon Og Kvantitativ Sanntids Polymerasekjedereaksjon

FOR å evaluere genuttrykksnivået for limbale epitelceller BLE PCR og sanntids PCR utført. Totalt RNA ble ekstrahert fra hornhinnen epitelceller ved Hjelp Av RNeasy kit etter produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved absorpsjon ved 260 nm og lagret ved -80°C. For å syntetisere cdnaer ble det brukt 1 µ av totalt RNA med Hevet Iii Revers Transkripsjonssett. PCR ble utført Ved Bruk Av Platinum PCR master mix (Life Technology); og real-time PCR ble utført ved HJELP AV SYBR Green PCR Master Mix (Roche) med primere beskrevet før . Pcr-reaksjoner i sanntid ble utført i tre eksemplarer med et innledende aktiveringstrinn ved 95°C i 3 minutter, etterfulgt av 45 sykluser: 95°C i 30 sekunder, 60°C i 30 sekunder og 72°C i 40 sekunder. Relativ genuttrykk ble beregnet ved å normalisere forskjellen i syklusgrenseverdi( delta Ct), verdier av gener til delta Ct-verdien av glyceraldehyder-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).

2.5. Immunfluorescerende Flekker

Humane limbale epitelceller ble sådd i kulturglass MED 3T3 materlag i FAD medium eller SR medium. Tre dager etter sådd ble kulturer løst med 4% paraformaldehyd eller kald aceton ved 4°C i 10 minutter. Etter vask med PBS to ganger ble celler blokkert med 5% geiteserum I PBS i 30 minutter. Musens primære antistoffer mot p63 (1 : 200, 4a4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) og connexin 43 (1 : 1000, Millipore) ble påført og inkubert over natten ved 4°C. Alexa Fluor 568-konjugert sekundært antistoff ble påført i 1 time etter vask med PBS to ganger. Cellekjernene ble deretter counterstained Med Hoechst 33342 (1 µ/mL I PBS) i 20 minutter. Etter vask MED PBS i 3 ganger ble cellekulturen montert med monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og undersøkt under et fluorescerende mikroskop (BX50; Olympus, Tokyo, Japan).

2.6. Western Blot Analyse

dyrkede limbale epitelceller ble lysert MED RIPA buffer (10 Mm Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% natriumdeoksykolat, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA OG proteasehemmer cocktail; Roche Diagnostikk) på is i 30 minutter. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved bruk av bikinchoninsyre (bca) proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Totale cellelysater (40 µ) ble elektroforisert i 12% gradient SDS-SIDE gel, overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad), blokkert med 5% skummet melk I Tris-bufret saltvann (TBS) i 1 time, og undersøkt med musantistoffer mot prolifererende cellekjerneantigen (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) eller p63 (4A4, Santa Cruz, CA) over natten ved 4°C. membranene ble deretter vasket tre ganger med tbs, inkubert med geit anti-mus igg (1 : 5000, hrp-konjugert, santa cruz, ca) eller Kanin Anti-geit igg (1 : 5000, HRP-konjugert, Santa Cruz, CA) i 1 time ved romtemperatur, og utviklet med forbedrede kjemiluminescerende substrater(Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Uttrykksnivåene FOR ABCG2, PCNA og p63 ble målt ved hjelp av semiquantitative intensitetsmåling og normalisert TIL GAPDH-nivå som fungerte som intern kontroll.

2.7. Statistikk

Sammendrag av data FOR CFE og relativ fold av sanntids PCR ble rapportert som betyr ± SD og sammenlignet ved Bruk Av Studentens uparret test Med Microsoft Excel (2003 / XP versjon). Testresultatene ble rapportert som to-tailed verdier, der ble vurdert statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. Fenotypen Av Stamceller I Hornhinnen I SR Medium

Totalt 5 hornhinne-limbale ringvev ble høstet fra donorer i aldersgruppen 32-65 år. Disse vevene ble bevart og behandlet innen 24 timer etter høsting. Human primær korneal epitelcellekultur ble vellykket satt opp i FAD medium (Figur 1(a) og 1(b)) og SR medium (Figur 1(c) og 1(d)) også. Hornhinnen epitelceller opprettholdt I SR medium + 3t3 mater laget viste en morfologi med liten størrelse og høy kjerne / cytoplasma ratio, som var typisk utifferentiert epitelceller morfologi, og de store differensierende flat plateepitel-lignende celler ble sjelden observert (Figur 1 (c)). Epitelceller opprettholdt i SR medium begynte å danne kolonier 3 dager etter sådd (Figur 1 (c)). Størrelsene på disse koloniene var lik de som ble dannet i FAD medium + 3t3 feeder layer (Figur 1 (a)), men disse koloniene var mindre tett komprimert enn DE I FAD + 3T3 feeder layer. Innen 7 dager, epitelceller nådd samløpet I SR medium med uniform liten størrelse (Figur 1(d)), som også ble observert I KJEPPHEST kultur(Figur 1 (b)). I denne studien kunne humane hornhinneepitelceller avledes og opprettholdes I SR medium + 3t3 mater lag for alle fem donorer. For langsiktig dyrking ble humane hornhinneepitelceller serielt subkulturert I SR medium + 3t3 mater lag for mer enn 10 passasjer (). Under hver passasje ble celler trypsinisert og samlet når celler nådde 80-90% sammenløp; celle tall ble beregnet for populasjonsdobling analyse. Resultatet viser at epitelcelleutbytte fra SR-medium er nær det for celler dyrket i FAD-medium, som vist i Figur 2 (a), og disse dataene ligner på tidligere rapporter . Oppsummert viser dataene som presenteres her at SR kulturmedium + mitomycin C-behandlet 3T3 materlag støtter humane hornhinneepitelceller klonal vekst og proliferasjon.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d))

Figur 1

kulturen av humane limbale epitelceller i SR medium. (a) de humane hornhinneepitelceller dannet tett komprimerte kolonier i FAD medium etter sådd av celler i 3 dager. (b) etter 7 dager, epitelceller nådd samløpet I KJEPPHEST medium med uniform liten størrelse. (C) Humane hornhinneepitelceller dannet kolonier i SR-medium, som var lik de som ble dannet i FAD-medium, men disse koloniene var mindre tett komprimert enn DE i FAD. (d) Etter 7 dager, epitelceller nådd samløpet I SR medium med uniform liten størrelse som var lik DE I KJEPPHEST kultur Original forstørrelse: (a) ×10; (b) ×10 (skala barer: 100 µ).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d))

Figur 2

Sammenligning av cellepopulasjonsdobling (PD) og kolonidannende effektivitet (cfe) av humane limbale epitelceller dyrket i SR og FAD media. (A) Humane limbale epitelceller ble serielt subkulturert I SR medium og FAD medium for 10 passasjer (); cell population doublings (PD) nummer og akkumulert PD ble beregnet og plottet. PD ble beregnet i henhold til følgende formel:, hvor representerer det totale antall celler oppnådd ved hver passasje og representerer antall plating celler i begynnelsen av hver passasje. (b) for å analysere CFE ble limbale epitelceller sådd med en tetthet på 200 celler per 100 mm petriskål i SR og FAD media og fikk vokse i 12 dager. (c) cfe-verdier for epitelceller i SR og FAD media var og, henholdsvis. Ingen forskjeller AV CFE ble funnet mellom SR medium og FAD medium gruppe (,). (d) Prosentandel av kolonisert område i FAD var nær DET FOR SR medium. De limbale epitelceller opprettholdt i SR medium viste lignende CFE og kolonistørrelse sammenlignet med celler opprettholdt i FAD medium.

3.2. CFE Assay

Neste vi undersøkte Og sammenlignet CFE av hornhinnen epitelceller dyrket i FAD og SR media. For å analysere CFE, korneal epitelceller dyrket I SR og FAD media ble høstet og sådd med en tetthet på 200 celler per 100 mm petriskål, som ble preseeded med mitomycin C-behandlet 3t3 mater lag, og denne kulturen fikk lov til å vokse i 12 dager. Hornhinnen epitelceller begynte å danne kolonier 5-7 dager etter kultur initiering. Som vist i Figur 2 (b), etter dyrking i 12 dager, viste hornhinnen epitelceller opprettholdt I SR medium lignende CFE og kolonistørrelse sammenlignet med celler opprettholdt i FAD medium. CFE verdi for epitelceller I SR og FAD media var og, henholdsvis (Figur 2 (c)). Statistisk analyse viste at det ikke var noen signifikante forskjeller i kolonidannende effektivitet () og gjennomsnittlig areal av koloniene () mellom SR og FAD media(Figur 2 (c)). Vi kvantifiserte prosentandelen av kolonitypene basert på koloniområdet. Resultatene viste at prosentandelen av abortive kolonier (koloniområde <1 mm2) dannet i SR medium var lik DEN i FAD medium (). Tilsvarende var prosentandelen av store kolonier (koloniområde >4 mm2) dannet i SR-medium nær DET I FAD-medium () (Figur 2 (d)). Disse resultatene indikerer at hornhinneepitelceller dyrket i SR medium har en tilsvarende høyere grad av proliferativt potensial sammenlignet med celler dyrket i FAD medium.

3.3. PCR OG Real-Time PCR Analyse

FOR å studere genuttrykk BLE PCR og real-time PCR utført på epitelceller dyrket i BÅDE FAD og SR media. Housekeeping gene GAPDH ble brukt som en intern kontroll. PCR data viser at cellen dyrket i BÅDE KJEPPHEST medium og SR medium viser høyt nivå transkripsjon uttrykk for proliferativ markør PCNA. Cellene i begge medier viser positivt uttrykk for cytokeratin 3 og cytokeratin 12, som er i samsvar med deres limbus-opprinnelse. Det positive uttrykket av basalsjiktepitelcellemarkør, cytokeratin 15, ble også observert i begge kulturer. ABCG2 Og Hryvnp63α uttrykk ble påvist i begge kulturer, SELV OM ABCG2-uttrykk gikk noe ned etter primærkultur i SR-medium. Det lave nivået av connexin 43-ekspresjon ble observert i begge kulturer og antydet lavt nivå av epitelcelledifferensiering i begge medier. For sanntids PCR viste kvantitativ analyse av mRNA-nivået at det ikke var noen signifikant uttrykksforskjell () av p63 og ABCG2 mellom epitelceller dyrket i FAD og SR media(Figur 4 (a)). Sanntidsanalyse av hornhinneepiteldifferensieringsmarkøren cytokeratin 3 og cytokeratin 12 ble også utført. Begge disse to markørene var knapt detekterbare i BÅDE FAD-og SR-cellekulturer, og overraskende er det ingen signifikant forskjell () i uttrykksnivå mellom disse to kulturer.

3.4. Immunfluorescent Farging

for å bekrefte at epitelceller dyrket I SR medium opprettholdt stemness og utifferentiert tilstand, immunfluorescent farging av flere proliferasjon, differensiering, og antatte epitel stamcellemarkører ble utført. Som vist i Figur 4, I SR medium, de fleste av epitelceller vises en liten og ensartet morfologi, og de fleste celler ble sterkt farget med p63, den antatte epitel stamcellemarkør. ABCG2 positive beiset celler ble også observert i en usammenhengende fordeling innenfor de limbale epitelcellekolonier. Cellene opprettholdt i SR medium ble svakt farget for connexin 43 og cytokeratin 3. Det lave uttrykket for disse to differensieringsmarkørene antyder lavt nivå av epitelcelledifferensiering i cellekulturen. Den lignende fargestilen ble også observert i celler opprettholdt med FAD medium (Figur 4(b)). Disse dataene innebærer at humane limbale epitelceller dyrket I SR medium opprettholdt høyt nivå ekspresjon av antatte epiteliale stamcellemarkører, mens de uttrykker lavt nivå av differensieringsmarkører.

3.5. Western Blot

for å doble bekrefte kvantitative genuttrykk og immunfluorescerende fargeresultater, ble ekspresjonen av potensielle epiteliale stamcellemarkører (p63 OG ABCG2) og proliferasjonsmarkør (PCNA) evaluert ved hjelp av western blot. Ved bruk av monoklonalt p63-antistoff (klon 4A4, Santa Cruz) ble p63-proteinet (70 KD, Δα isoform) påvist ved høyt ekspresjonsnivå i SR medium. Uttrykket AV ABCG2 (70 KD) ble detektert i hver passasje av celler dyrket i SR-medium. PCNA, proliferasjonsmarkør, ble også påvist i celler dyrket i SR-medium(Figur 3 (c)). Og uttrykksnivåene for p63, ABCG2 og PCNA var like i 10 passasjer med semikvantitativ intensitetsmåling(Figur 3 (d)) ved BRUK AV GAPDH som intern kontroll.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d))

Figur 3

Genuttrykk og proteinuttrykk i humane limbale epitelceller. (A) Genuttrykk analyse av humane limbale epitelceller. PCR-data viser at cellene dyrket i BÅDE FAD medium og SR medium viser høyt nivå uttrykk for spredning transkripsjon PCNA I P1, P4, P7, Og P10. Cellene i begge medier viser positivt uttrykk for cytokeratin 3 og cytokeratin 12, noe som innebærer deres limbus-opprinnelse. Det positive uttrykket av basalsjiktepitelcellemarkør, cytokeratin 15, ble også observert i begge kulturer. Abcg2 Og Δ 63α uttrykk ble påvist i begge kulturer; deres uttrykk ble observert å bli redusert noe etter passasje 7 (P7) i begge kulturmedier. Det lave nivået av ekspresjon av connexin 43 (Cx43) ble observert i begge kulturer og antydet lavt nivå av epitelcelledifferensiering i begge medier. (B) Kvantitativ sanntids PCR analyse av humane limbale epitelceller dyrket i SR og FAD media. Real-time PCR ble utført på epitelceller dyrket ved hjelp av BÅDE FAD og SR media. Housekeeping gene GAPDH ble brukt som en intern kontroll. Analyse av de limbale epiteliale stamcellemarkørene p63 og ABCG2 mRNA fant at det ikke var noen signifikant forskjell (, ) i uttrykk mellom epitelceller dyrket I FAD og SR media. Sanntidsanalyse av hornhinneepiteldifferensieringsmarkøren cytokeratin 3 og connexin 43 ble utført. Alle disse markørene var knapt detekterbare i BÅDE FAD-og sr-cellekulturer, og overraskende er det ingen signifikant forskjell (, ) av uttrykksnivå mellom disse to kulturer. ALLE sanntids PCR-eksperimenter ble utført i tre eksemplarer. (C) Western blot analyse av humane limbale epitelceller dyrket I FAD og SR media. Ekspresjon av proliferasjonsmarkør (PCNA) og potensielle epithelial stamcellemarkører (p63 OG ABCG2) ble evaluert ved hjelp av western blot. Ved bruk av monoklonalt antistoffklon 4a4 ble p63-proteinet (70 KD) detektert ved høyt ekspresjonsnivå i SR-medium. Uttrykket AV ABCG2 ble detektert i hver passasje av celler dyrket i SR-medium. PCNA, cellekjerneantigenet, en celleproliferasjonsmarkør, ble også påvist i epitelceller dyrket i SR-medium. (d) uttrykket FOR ABCG2, p63 og PCNA ble kvantifisert og plottet ved hjelp av semiquantitative intensitetsmåling. Blottettheten AV ABCG2, p63 og PCNA ble målt og normalisert til NIVÅET AV GAPDH.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Ekspresjon av epiteliale stamcelleprodusenter og differensieringsmarkører i humane limbale epitelceller. De humane limbale epitelceller ble sterkt farget MED ABCG2 og p63 (grønn) i SR og FAD media. Cellene opprettholdt i SR og FAD media viste svak farging for connexin 43 (Cx43) og cytokeratin 3 (K3). (a) SR medium og (b) FAD medium. Opprinnelig forstørrelse: (a) ×10; (b) ×10 (skala barer: 100 µ). Studiene ble utført i tre eksemplarer, og representative tall er vist her.

4. Diskusjon

Epitelceller dyrket PÅ 3t3 mater laget har blitt avledet og brukes til behandling av ulike kliniske situasjoner, for eksempel alvorlige forbrenninger, diabetiske fotsår, hud defekter, og munnslimhinnen defekter . Den første transplantasjonen av limbale epiteliale stamceller ble beskrevet i 1997 Av Pellegrini et al. . I løpet av de siste tiårene har flere forskjellige kulturmetoder blitt utviklet, inkludert kultur av limbale epitelceller på human amniotisk membran (HAM) med ELLER uten 3T3 materlag , kultur av epitelceller på temperaturresponsive plater og kultur av epitelceller med kommersielt serumfritt kulturmedium. Som nylig rapport indikerer at det kliniske utfallet av hornhinne/limbus epitelceller transplantasjon avhenger av om de limbale stamceller er bevart i cellekulturen, ble det påpekt at holokloner bare ble beholdt I FAD + 3T3 kultursystem . Da denne kulturprotokollen innebærer bruk AV FBS, er det økende sikkerhetsproblemer at FBS er dårlig definerte animalske produkter og har potensial til å overføre dyreavledede sykdommer til pasienter . Derfor er det økende behov for å utvikle dyreproduktfritt og FBS-fritt kulturmedium for å erstatte tradisjonelt KJEPPHESTMEDIUM .

i denne studien utviklet vi et nytt serumfritt kulturmedium, der KnockOut SR erstattet FBS. Fenotypene av limbale epiteliale stamceller i dette nye serumfrie kulturmediet ble evaluert ved immunostaining med antistoffer for foreslåtte stamcellemarkører (p63, ABCG2) og differensieringsmarkører (cytokeratin 3, connexin 43).

kjernetranskriptfaktoren p63 ble tidligere foreslått å være en markør for epiteliale stamceller, og Δα er den dominerende isoformen av p63-isoformer i disse cellene . Våre resultater er i samsvar med disse tidligere rapportene; nuclear p63 ble sterkt uttrykt i limbal cellekultur, som ble vist ved immunostaining, real-time PCR, og western blot. Tilstedeværelsen av p63 i limbal cellekultur indikerer deres høye proliferative og selvfornyelsespotensial. ABCG2, et medlem AV ATP binding cassette (ABC) transportører, opprinnelig kjent som brystkreftresistent protein 1 (BCRP1), har blitt foreslått som en annen antatt stamcellemarkør for voksne stamceller, inkludert limbus epithelial stamceller . Det høye uttrykket FOR ABCG2 i SR-mediet ble påvist ved immunostholdende OG sanntids PCR.

K3 Og K12 er kjent som hornhinnespesifikke markører . Konsekvent viste våre immunostholdende OG SANNTIDS PCR-resultater at cellene Var K3 og K12 negative, noe som bekrefter deres limbus-opprinnelse. Connexin 43 er medlem av gap junction proteins familien; det tillater direkte diffusjon av lavmolekylære løsemidler mellom naboceller. Connexin 43 ble rapportert å bli uttrykt av differensierte epitelceller, og fraværet av disse intercellulære kommunikasjonsmolekylene kan være et trekk ved epithelial stamceller.

i våre resultater uttrykte en større prosentandel av celler p63 OG ABCG2, mens få celler uttrykker differensieringsmarkører K3 / K12 og CX43. Således viste humane limbale epiteliale stamceller i SR serumfritt medium lignende fenotyper og opprettholdt utifferentierte tilstander, sammenlignet med FBS-medium.

i konklusjonen, ved Hjelp KnockOut SR erstatte FBS, vår nye serum-fri medium opprettholder menneskelige hornhinnen epitelceller vekst og proliferasjon og beholder epitel stamceller i deres utifferensiert fenotype. Denne nye serumfrie kulturmetoden er tilleggsdefinert og relativt enkel å kontrollere. Det har stort potensial til å bli brukt i klinikken limbal epitelcelletransplantasjon og vevregenerering.

Konkurrerende Interesser

forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.

Takk

dette arbeidet ble støttet av stipend Fra Jilin University Og National Natural Science Foundation Of China (NSFC 30500548).