Kruppel-lignende faktor 2 (KLF2) regulerer proinflammatorisk aktivering av monocytter

Resultater

KLF2-Uttrykket Reduseres Med Monocyttaktivering / Differensiering I Makrofager.

for bedre å forstå KLF2S rolle i reguleringen av immunceller som monocyt / makrofag, evaluerte vi først uttrykket AV KLF2 i primære humane monocytter. Som vist I Fig. 1 A VENSTRE, KLF2 uttrykk er robust i primære humane monocytter og sterkt redusert med differensiering i makrofager etter 5 dager. KLF2-uttrykk i den humane monocytiske cellelinjen THP-1 var mye lavere enn i primære humane monocytter. Ekspresjonen ble imidlertid ytterligere redusert ved behandling av disse cellene MED LPS eller 12-O-tetradekanoylphorbol-13-acetat, to midler som var godt etablert for å indusere cellulær aktivering eller differensiering (Fig. 1 A Høyre).

Vi søkte deretter å avgjøre OM KLF2-uttrykk er regulert i den inflammatoriske innstillingen in vivo. Monocytisk aktivering er en viktig patofysiologisk hendelse i utviklingen av aterosklerose, en kronisk lavgradig inflammatorisk tilstand, så vi begrunnet AT klf2-uttrykket kan reduseres hos disse pasientene (11). Vi undersøkte en gruppe på 14 aldersmatchede normale forsøkspersoner og 14 pasienter med omfattende aterosklerose (≈50% med tidligere koronar revaskularisering) som er stratifisert etter henholdsvis laveste og høyeste Nivå Av Finkel–Biskis–Jinkins osteosarkomgen (FOS), som har vist seg å fungere som en markør for betennelse (12). Som vist I Fig. 1 B, KLF2-uttrykk ble signifikant redusert med ≈30% hos pasienter. I kontrast ble det ikke observert noen signifikant effekt FOR KLF3, KLF6, KLF11 og KLF13. I samsvar med vår tidligere studie var FOS-uttrykket signifikant økt hos pasienter med koronararteriesykdom (12).

KLF2 Hemmer Monocyttaktivering og Fagocytisk Kapasitet.

som respons på inflammatoriske stimuli uttrykker monocytter økte nivåer av proinflammatoriske faktorer og cytokiner/kjemokiner og utviser forbedret fagocytisk kapasitet. For å få innsikt I KLF2S rolle i monocytfunksjon, gjennomførte vi overekspresjonsstudier. Thp-1-celler ble infisert med enten kontroll tomt virus (EV) ELLER KLF2 (Ad-KLF2) for 24-48 h og deretter stimulert MED LPS for 2 og 6 h. som vist I Fig. 2 A, behandling AV ev-infiserte celler MED LPS (25 ng/ml) resulterte i en robust induksjon av cyklooksygenase (COX)-2, vevsfaktor og monocytt kjemoattractant protein (MCP)-1 mRNA. I motsetning til dette ble denne induksjonen markert svekket i KLF2-infiserte celler(Fig. 2 A). Lignende effekter ble også observert I musemonocyttcellelinjen J774a (data ikke vist). Videre hemmet overekspresjon AV KLF2 sterkt utskillelsen av forskjellige cytokiner og kjemokiner. Som vist I Fig. 2 B, klf2 overuttrykk svekket DEN LPS-medierte induksjonen av faktorer SOM CD40L (med 49,6%), makrofag inflammatorisk protein 1α (48,4%), makrofag inflammatorisk protein 1β (64,2%), IL-1Β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) og MCP-1 (68,8%). Denne effekten var spesifikk fordi det ikke ble observert noen signifikant effekt på nivåene av flere andre relevante vekstfaktorer (TGFß1, blodplatederivert vekstfaktor og granulocytt-/makrofagkolonistimulerende faktor), cytokiner / kjemokiner (IL-4, IL-10, IL-12P40, IL-12P70, IL-1α og IFN-γ) eller matriksendrende enzymer (matriksmetalloproteinasetyper 1, 2, 3 og 9) (data vises ikke).

en klassisk egenskap for den aktiverte monocyten / makrofagen er fagocytose. For å avgjøre OM KLF2 overuttrykk påvirker fagocytisk evne til monocytter, overexpressed VI KLF2 eller kontroll (ev) I THP-1 celler, stimulert MED LPS, og vurderte evnen til disse cellene til Å ta Opp Texas red-merket zymosan a bioparticles. Som vist I Fig. 2 C, kontroll virusinfiserte celler inntok zymosan bioparticles. I motsetning til dette ble opptaket av KLF2-uttrykkende monocytter markert redusert (Fig. 2 C). Samlet viser disse dataene AT KLF2 kan hemme monocyttsekresjon av cytokiner / kjemokiner og fagocytose.

KLF2 Hemmer Ikke Monocyttrekruttering.

vi søkte deretter å vurdere effekten AV KLF2 på monocyttfunksjon in vivo. Som svar på en skade eller en inflammatorisk stimulus rekrutteres monocytter fra blodet til vev. Vi foretok først studier for å vurdere om monocyttrekruttering ble endret AV KLF2-uttrykk. For å minimere bidraget fra andre celletyper brukte Vi C. B-17-Scid-beige mus som er mangelfull I T -, B – og naturlige dreperceller. Disse dyrene (n = 5 per gruppe) ble deretter utsatt for bestråling av hele kroppen og rekonstituert Med J774a-celler adenoviralt infisert med enten kontrollvirus (EV) eller KLF2 ved injeksjon av halevene (beskrevet I Materialer og Metoder). Dyr ble deretter utsatt for ip-injeksjon av tioglykolat (en potent kjemisk irriterende som induserer monocyttrekruttering), og antall GFP-positive celler ble vurdert 48 timer senere ved flowcytometrisk analyse. Som vist I Fig. 2 C og D, klf2 hemmet ikke rekrutteringen AV GFP + J774a monocytter til bukhulen. FAKTISK observerte vi reproduserbart AT KLF2-transduserte dyr viste en signifikant økning I gfp + – celler. Disse dataene tyder på AT KLF2 ikke hemmer, men forsterker monocytisk rekruttering til et inflammatorisk sted.

KLF2 Hemmer Karrageenanindusert Betennelse.

etter rekruttering og migrasjon til vev monocytter utskiller cytokiner, kjemokiner og vekstfaktorer for å opprettholde den inflammatoriske responsen. Som vist I Fig. 2 B, vi bemerket AT KLF2 overuttrykk dempet utarbeidelsen av flere cytokiner og kjemokiner. For å avgjøre OM KLF2 påvirker monocytisk proinflammatorisk funksjon, brukte vi en veletablert modell for betennelse: karragenan-indusert footpad injeksjon. Injeksjon av dette kjemikaliet har tidligere vist seg å reproduserbart indusere en inflammatorisk respons preget av poteødem (13-15). C. B-17-Scid-beige mus (n = 4 per gruppe) ble bestrålt som beskrevet ovenfor, rekonstituert med kontroll-eller KLF2-uttrykkende j774a-celler, og deretter utfordret med karrageenan injeksjon i footpad (beskrevet i Materialer og Metoder). Potevolumet ble bestemt ved å bruke et hydropletismometer modifisert for små volumer (Ugo Basile, Milan). Som vist I Fig. 2 F, ev-infiserte dyr viste en 17 ± 1,08-mm3 og 23,3 ± 3,05-mm3 økning i potevolum etter henholdsvis 1 og 2 timer karrageenaninjeksjon. I motsetning viste dyr rekonstituert Med KLF2-uttrykkende j774a-celler bare en 6,25 ± 0,85 mm3 og 7,5 ± 0,95 mm3 økning i potevolum ved henholdsvis 1 og 2 timer etter karrageenaninjeksjon (Fig . 2 F). I samsvar med denne brutto effekten viste histologisk analyse av potene redusert væskeekstravasjon, noe som fører til ødemdannelse (Fig. 2 G, piler).

Effekt AV Klf2 Knockdown på Inflammatorisk Genuttrykk.

for å fastslå betydningen AV KLF2 i monocytisk inflammatorisk genuttrykk, ble det også gjennomført små interfererende RNA (siRNA)-medierte knockdown-studier. Som vist I Fig. 2 Timer, sammenlignet med ubehandlede (kontroll) og ikke-spesifikke siRNA-behandlede celler, resulterte knockdown AV KLF2 (≈60% knockdown) I j774a-celler i en induksjon av inflammatoriske gener SOM MCP-1 og en mer beskjeden effekt PÅ COX-2 og vevsfaktoruttrykksnivåer. Disse resultatene ble også verifisert med PCR-analyse i sanntid (Fig. 2 I).

KLF2 Hemmer NF-kB Og AP-1 Promotøraktiviteter.

KLF2 kan kraftig hemme LPS-mediert induksjon AV MCP-1, COX-2 og vevsfaktor (Fig . 2 A). Induksjonen av disse målene ved proinflammatoriske stimuli er kjent for å være regulert av transkripsjonelle veier som NF-kB og AP-1. VI begrunnet at KLF2 i prinsippet kan hemme disse banene på flere nivåer som uttrykk, DNA-binding eller induksjon av transkripsjonell aktivitet.

vi fokuserte først PÅ NF-kB gitt sin sentrale rolle i betennelse. Overuttrykk AV KLF2 endret ikke kjernefysisk akkumulering av p65 eller kjernefysiske nivåer Av IkB kinase (IKK) α og IKKy (Fig. 3 A). VIDERE endret KLF2-overuttrykk ikke kinetikken Til IkB-fosforylering eller nedbrytning eller cytoplasmiske nivåer av IKKa, Ikk, Og IKKy(Fig. 3 B). I samsvar med disse observasjonene påvirket IKKE KLF2 nf-kB-bindingen til DNA. Som vist I Fig. 3 C, behandling av kontrollvirusinfiserte celler (EV) med LPS induserte et enkelt hovedbånd. Konkurranse – og supershift-studiene bekreftet at dette bandet representerer NF-κΒ Et nesten identisk mønster AV nf-kB-binding ble observert I klf2-overuttrykkende celler. For å vurdere OM KLF2 kan påvirke nf-kB-mediert transkripsjonell aktivering, ble gene reporter-analyser foretatt. Som vist I Fig. 3 D, transfeksjon av p65 med en nf-kB luciferase reporter plasmid indusert transkripsjonell aktivitet ved ≈11 ganger. Denne induksjonen ble sterkt redusert i NÆRVÆR AV KLF2, noe som indikerer AT KLF2 hemmer nf-kB transkripsjonsaktivitet. Lignende effekter AV KLF2 ble observert FOR AP-1-banen (Fig. 5 A-C, som er publisert som støtteinformasjon på PNAS nettsted).

Rekruttering AV COACTIVATOR CBP-Associated Factor (PCAF) AV KLF2 som En Samlende Mekanisme.

Tatt sammen, resultatene I Fig. 3 indikerer AT KLF2 kan hemme nf-kB-mediert transaktivering uavhengig av effekter PÅ DNA-bindingen av disse faktorene. En mulig mekanisme er rekruttering av kritiske coactivators. For eksempel krever optimal nf-kB-binding interaksjon med flere nøkkelkoaktivatorer som STEROIDRESEPTORKOAKTIVATOR (SRC)-1, PCAF og p300/CBP. KLF2 kan interagere med en eller flere av disse faktorene, rekruttere dem bort FRA NF-kB, og som konsekvens redusere nf-kB-mediert transkripsjonsaktivitet.

For å fastslå PCAFS rolle i KLF2-mediert hemming AV nf-kB transkripsjonell aktivitet, utførte vi cotransfeksjonsstudier med eksogen PCAF. Transfeksjon AV PCAF (men ikke p300; data ikke vist) betydelig reddet KLF2-mediert undertrykkelse AV NF-kB concatemer (Fig. 4 A). En delvis redning ble også observert på KLF2S evne til å hemme AP – 1 transkripsjonsaktivitet (Fig. 5D). For å avgjøre OM KLF2 og PCAF interagerer med hverandre, utførte VI gst-nedtrekks-og coimmunoprecipitasjonsanalyser. Ved hjelp av in vitro transkriberte og oversatte produkter fant VI AT KLF2 og PCAF kan samhandle direkte i et cellefritt system (Fig. 4 B). For å vite om PCAF binder SEG TIL KLF2 in vivo, overexpressed VI KLF2 (hemagglutinin-merket) og PCAF (Flagg-merket) I COS-7 celler. Immunopresipitasjon med et Anti-Flagg antistoff etterfulgt Av Western blotting med et anti-hemagglutinin antistoff viste AT KLF2 bindes MED PCAF i celler (Fig. 4 C).

For å avgjøre om mekanismene bak de observerte effektene er operative in vivo, gjennomførte vi kromatin immunoprecipitation (ChIP) studier. SOM forventet førte lps-stimulering AV THP-1-celler til rekruttering av p65 og PCAF til COX – 2-promotoren(Fig. 4 D). I tillegg ble samtidig acetylering av HH3 og HH4 observert. I SAMMENHENG MED KLF2-overuttrykk er IMIDLERTID PCAF-rekruttering og histonacetylering sterkt svekket (Fig. 4 D). I samsvar med våre gel-shift-analyser ble DET ikke observert noen signifikant effekt AV KLF2 på p65-rekruttering.