Diskusjon
den observerte produksjonen av høye nivåer av proteaseaktivitet under kontinuerlig kultur Av K. sedentarius lette rensingen av to proteaser, P1 Og P2, som var aktive mot azokasein, den β-kjeden av insulin, keratin ekstrahert fra human callus og ubehandlet callus. De generelle egenskapene til disse enzymene, inkludert substratområde, optimal temperatur og pH og følsomhet overfor proteasehemmere, antyder at de er biokjemisk like og sannsynligvis tilhører den alkaliske serinproteasefamilien. Disse proteaser er produsert av en rekke mikroorganismer og fungere som endopeptidaser (Rao et al. 1998).
om enzymene også kan klassifiseres som keratinaser, er imidlertid fortsatt et spørsmål om debatt. Keratinaser, per definisjon, bør være i stand til å hydrolysere ren innfødt keratin. Ekstraksjon av keratin kan imidlertid bare oppnås ved tidligere behandling med denatureringsmidler for å skille den fra ikke-keratinproteiner. Mekaniske behandlinger som kulemaling resulterer i spaltning av disulfidbindinger, noe som gjør proteinet mer utsatt for proteolytisk fordøyelse av proteaser som trypsin Og proteinase K, som ikke er klassifisert Som keratinaser (Noval og Nickerson 1959). På samme måte har bruken av varmesteriliserte substrater i keratinaseanalyser også blitt kritisert fordi oppvarming kan forårsake keratindenaturering.
selv om finmalt callus i den foreliggende studien ble brukt som et enzymsubstrat, var kultur supernatantfluid aktiv mot biter av intakt callus. Derfor, selv om de to proteasene ikke er strengt keratinaser, degraderer de menneskelig callus in vitro, og det er noen bevis på at dette også skjer in vivo (Nordstrom et al . 1987).
Proteaser har også blitt klassifisert som keratinaser som et resultat av deres aktivitet på redusert keratin, i hvilket tilfelle reduksjonsmidler enten har blitt tilsatt enzymanalyseblandingen eller brukt under keratinekstraksjon. Selv om den keratinolytiske aktiviteten til en rekke kutane bakterier har blitt studert ved bruk av ‘innfødt’ keratin som substrat, ble reduksjonsmiddelet dithiothreitol (DTT) inkludert i analyseblandingen. For eksempel, når tilsynelatende keratinaseaktivitet Fra Staphylococcus epidermidis ble studert i fravær AV DTT, ble det ikke påvist noen aktivitet (Mikx og de Jong 1987). Tilsvarende en serin protease Fra Candida albicans-degraderte keratiner som hadde blitt ekstrahert fra stratum corneum av humane såler med 8 mol l-1 urea I Tris-HCl og β-merkaptoetanol (Hattori et al. 1984). I den foreliggende studien hydrolyserte p1 Og P2 keratin som hadde blitt ekstrahert fra human fot callus med urea og β-merkaptoetanol, men viktigere, var også i stand til å nedbryte ubehandlet callus.
stratum corneum og human callus er en kompleks og stabil struktur som keratin er en viktig komponent. Det er 30 humane gener for keratin hvorav 18 er uttrykt på huden (Fuchs 1995). Et sammendrag av keratindatabasen har vist at hver keratin har potensielle spaltningssteder for proteaser, Og Asp-Arg og Gly‐Arg er de vanligste. Hvis keratinfilamentene i utgangspunktet brytes på disse stedene, er det mulig at gradvis nedbrytning av disse mindre enhetene forekommer ved sekundære spaltningssteder, og produserer et størrelsesområde av peptidfragmenter, som vist ved analyse av proteaseangrepet på keratiner ekstrahert fra menneskelig callus. Resultatene presentert I Fig. 3b indikerer to pH optima for callus-nedverdigende aktivitet Av P2. En mulig forklaring er at det er to enzymer i prøven. Dette virker usannsynlig fordi enzymprøven som ble brukt var sterkt renset, som vist VED SIDE med sølvfarging (Se Fig. 1, lane 6). Muligheten for to callus-nedverdigende enzymer i den rensede p2-prøven med svært like mobiliteter på SIDE kan ikke utelukkes. Imidlertid ble den samme prøven testet ved bruk av de samme buffere med azocasein-analysen, og bare en ph optimal ble detektert ved pH 10·2. En alternativ forklaring er at det komplekse callus-substratet / enzyminteraksjonen ved forskjellige pHs er en balanse mellom enzymaktivitet og subtile konformasjonsendringer av substratet, noe som fører til dual pH optima.
denne undersøkelsen har vist At k. sedentarius produserer to ekstracellulære proteaser som har callus-nedverdigende aktivitet. Grunnleggende informasjon om deres relative molekylære størrelser, deres pi, er bestemt. Konvensjonelle enzymkinetiske studier kunne imidlertid ikke adresseres fordi det naturlige substratet som ble brukt i disse in vitro-forsøkene var en kompleks blanding av polymerer, uoppløselig i vann. Den økte enzymaktiviteten Til P2 i nærvær av 800 mmol 1-1 salt kan være relevant for mikroorganismens overlevelse på menneskelig hud, som har en skiftende saltkonsentrasjon avhengig av eccrine kjertelaktiviteten bestemt av personens treningshastighet og miljøtemperaturer. Mekanismen(e) som er involvert i natriumklorideffekten er ikke behandlet. Det foreslås foreløpig at natriumklorid kan påvirke enten den tertiære strukturen til enzymet og substratet, eller begge deler, for å forbedre tilgangen til enzymets aktive område til de spesifikke spaltningsstedene til substratet.
den enkleste forklaringen på resultatene observert er at I en kultur supernatant Av k. sedentarius er det to callus-nedverdigende enzymer, serinproteaser, som også løseliggjør menneskelig keratin tilstede i callus. Det er mulig At K. sedentarius produserer en protease, kodet av ett gen, og at autokatalytisk eller annen proteaseaktivitet produserer to enzymer med forskjellig molekylvekt. Alternativt er det to gener som koder for to uavhengige og nært beslektede enzymer. Den sistnevnte hypotesen støttes av en tidligere studie (Holland et al. 1992). Prøver fra kontinuerlig kultur Av K. sedentarius ved steady state ved ulike fortynning priser analysert PÅ SIDE, og kledde med kasein, viste to enzymer, en konstitutiv og den andre påvist ved høye konsentrasjoner ved lave fortynning priser. Det er viktig at det ikke ble oppdaget ved fortynningsrater nær µ. Bestemmelse Av den n-terminale aminosyresekvensen Av p1 (21 rester) og p2 (15 rester) polypeptider viste at de var helt forskjellige. Dette resultatet, tatt sammen med informasjonen fra continuous culture experiment, vil foreslå at enzymene er uavhengig kodet.
resultatene av denne undersøkelsen har styrket hypotesen om at spesifikke proteaser Av k. sedentarius kan utgjøre nedbrytningen av callus karakteristisk for pitted keratolysis. Beviset til dags dato tyder også på at to proteaser er involvert, og at de er aktive ved pH i hudstedet, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Tolkningen av resultater oppnådd fra in vitro-eksperimenter til in vivo-miljøet kan bli stilt spørsmålstegn, selv om menneskelig callus ble brukt som substrat. Ideelt sett bør menneskelige hudbiopsier tas, inkludert områder med normal og pitted hud. Tilstedeværelsen og plasseringen eller fraværet av proteasene kan da bestemmes ved histologiske teknikker ved bruk av monoklonale antistoffer som prober for proteasene og K. sedentarius. Etisk godkjenning vil imidlertid ikke bli gitt for biopsier fra ønsket sted, fotens bærende sted, fra et representativt antall personer. Involvering av k. sedentarius i pitted keratytosis av en mekanisme for produksjon av proteaser nedverdigende keratin er ikke formelt bevist. Det er imidlertid ingen bevis som avviser hypotesene, og dens troverdighet har blitt styrket av resultatene som presenteres her. Sterke in vitro-bevis har blitt presentert som impliserer K. sedentarius og dets ekstracellulære callus-nedverdigende enzymer i tilstanden pitted keratolysis. Ved normal hud pHs og overflatehydrering vil produksjonen og aktiviteten til disse enzymene være lav, Med P1 som den mer aktive. Under miljøforhold av okklusjon og på dårlig hygein beveger hudens pH til og litt over nøytralitet. Disse forholdene favoriserer P2. Begge enzymene er mest sannsynlig å rense enzymer, slik At k. sedentarius kan oppnå karbon-og nitrogenkilder, små peptider, låst i bosatt og uoppløselig kompleks polymer, keratin. For tiden er reguleringen av produksjonen av disse enzymene ukjent, og det er deres relative bidrag til callus nedbrytning in vivo. I tillegg til de kliniske implikasjonene har keratinolytiske proteaser stor verdi for næringslivet, da de er nyttige i en rekke industrielle prosesser, inkludert nedbrytning av keratinavfall fra fjærfe – og lærindustrien (Shih 1993; Onifade et al. 1998). Den høye keratinolytiske aktiviteten Til K. sedentarius proteaser ved relativt lave temperaturer og pH, sammenlignet med mange andre proteaser, presenterer en potensiell anvendelse av disse enzymene i bioteknologisk industri.
