Sebrafisk vedlikehold og bestander: Sebrafisk (Danio rerio)ble hevet og iscenesatt i henhold til etablerte protokoller30.Transgene linjer som ble brukt var Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, tg(fli1:MYR-EGFP)ncv233, Tg(fli1:MYR-MCHERRY)ncv134, tg(fli1:Lifeact-MCHERRY)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(uas):EGFP-UCHD) ubs1835, tgbac (pdgfrb:GFP)ncv2236 og tg (kdrl:EGFP)s84337. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care And Use Committee VED RIKEN Kobe Branch (IACUC).
Plasmider og oligonukleotider: Sebrafisk marcksl1a, marcksl1b og fscn1a ble klonet AV PCR FRA cDNA av 1 dpf-embryoer ved BRUK AV NEB® PCR-Kloningssett. Alle uttrykkskonstruksjoner som ble brukt i denne studien ble generert via Gateway® kloning og / eller In-Fusion® kloning ved bruk Av plasmider Fra Tol2Kit38. Plasmider med mutert Marcksl1a og Marcksl1b ble generert ved Bruk Av q5® Site-Directed mutagenesisett (NEB). shRNA inneholder vektorer ble konstruert ved ligering av shRNA sekvens Mellom EcoRI og PmeI steder nedstrøms Av U6 arrangøren av modifisert pEGFP-U6 vector39 (en gave Fra Zuoshang Xu, Addgene plasmid #19799). Mål sekvens for menneskelig MARCKSL1 er 5 ‘- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. Scrambled shRNA sequence 5 ‘- GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ‘ ble utformet som en umake sekvens (understreket) AV MARCKSL1 shRNA. Vektorer som inneholdt musene Marcksl1, Marcksl1-S120A / T148A / T183A (Marcksl1-AAA) og Marcksl1-S120D/T148D / T183D (Marcksl1-Ddd) underklonet til pEGFP-N1 (Clontech)10 var gaver Fra Eleanor T. Coffey (Universitetet I Åbo). Detaljert informasjon om plasmider og primere brukt i denne studien finnes I Supplerende Tabell 1 og 2.
rna-isolasjon og cDNA-syntese: Totalt RNA ble isolert ved HJELP AV TRI-Reagens (Epigenetikk) Og Direct-zolTM Rna Mikroprep-settet (Zymo Research) og cDNA ble syntetisert ved Hjelp AV SuperScript III® førstestrengsyntesesystem (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoller.
Mosaikk uttrykk for konstruksjoner og transgene sebrafisk linjer: Tol2-baserte uttrykkskonstruksjoner (5-10 pg) ble injisert i en-celle stadium sebrafisk embryoer med 50 pg Tol2 transposase mRNA transkribert Fra NotI-linearized pCS-TP vector (en gave Fra Koichi Kawakami, National Institute Of Genetics, Japan) ved hjelp av mMESSAGE mMACHINE SP6 kit (Invitrogen). For mosaikkuttrykk av transgener ble embryoer analysert ved 1 eller 2 dpf etter injeksjoner. For å generere tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 og Tg(fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26 linjer, ble injiserte embryoer oppdrettet til voksne og screenet for grunnleggere.
Generasjon av sebrafisk marcksl1a og marcksl1b mutanter: marcksl1a mutanter ble generert AV CRISPR / Cas9-mediert mutagenese. En single-guide RNA (sgRNA) rettet mot den andre exon (Supplerende Fig. 4a) ble generert ved hjelp av kloning-uavhengig protokoll40. Cas9 / sgRNA rnp-komplekset ble satt sammen like før injeksjon, og etter 5 min inkubasjon ved romtemperatur ble 200 Pg Cas9-protein (Invitrogen) og 100 pg sgRNA injisert samtidig I ett-celletrinn Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 embryo. marcksl1b mutanter ble generert av TALEN-mediert mutagenese. TALEN rettet mot den første exon av marcksl1b (Supplerende Fig. 4b) ble designet ved HJELP AV Tal Effektor Nukleotid Targeter 2.0 (https: / / tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) og ble samlet via Golden Gate method41. TALEN repeat variable di-rester (Rvd) ble klonet i En rciscript-GoldyTALEN vektor (Addgene) og avkortet mrna for Hver TALENs ble in vitro transkribert Fra SacI-linearized expression plasmider ved hjelp av mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). En-celle stadium Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 embryoer ble mikroinjisert med 200 pg RNA(100 pg av hver venstre og høyre TALE mrna). F0 grunnleggere ble identifisert ved utkryssing TALEN eller CRISPR/Cas9-injisert fisk med villtype fisk og screening av avkom for mutasjoner ved 2 dpf ved Bruk Av T7 endonuklease I (NEB) – analyse (FOR TALEN-injisert fisk) eller Sanger-sekvensering (FOR CRISPR/Cas9-injisert fisk). Kort sagt ble genomisk DNA isolert fra grupper på fem embryoer ved Hjelp Av HotSHOT method42 og tilsvarende genomiske regioner ble forsterket. Mutasjoner ble vurdert ved direkte sekvensering av rensede PCR-produkter. F1 avkom av positiv F0 ble oppdratt til voksen alder og heterozygote bærere for mutasjoner ble identifisert ved fin-klipping OG rutinemessig genotyping PCR analyse ved hjelp av de samme primere.
Seks mutante alleler i marcksl1a og fem mutante alleler i marcksl1b ble identifisert under screeningen (Supplerende Fig. 13). Allel rk23 har en 2-nt delesjon som fører til en frameshift etter aminosyre 51 og for tidlig stoppkodon ved aminosyre 56 etter 5 missense aminosyrer (Supplerende Fig. 4a, c). Allel rk24 har en 5-nt delesjon som fører til en frameshift etter aminosyre 13 og for tidlig stoppkodon ved aminosyre 17 etter 4 missense aminosyrer (Supplerende Fig. 4b, d). Av disse grunner anser vi marcksl1ark23 og marcksl1brk24 å være null alleler og fokuserte våre undersøkelser på analysene av disse mutantene.
levende bildebehandling: Embryoer ble montert i 0,8% lavsmelt agarose (Bio-Rad) I E3 medium inneholdende 0,16 mg/mL Tricaine og 0,003% fenyltiourea. Konfokale z-stabler ble anskaffet ved hjelp Av Et invertert Olympus Ix83 / Yokogawa CSU-W1 spinning disc confocal mikroskop utstyrt Med Et Zyla 4.2 Cmos kamera (Andor). Lysfeltbilder ble kjøpt på Leica M205FA mikroskop. Bildene ble behandlet Med Fiji (NIH).
Laser ablasjon: Laser ablasjon ble utført ved hjelp av en 405-nm laser (Andor) og FRAPPA modul (Andor) montert på en invertert Olympus Ix83/Yokogawa CSU-W1 confocal mikroskop Med En Olympus UPSAPO 60x/NA 1.2 vann nedsenking mål. Tre sekvensielle laserablasjoner med en oppholdstid på 1000 µ ble hver påført 51% laserkraft.
Mikroangiografi: Mikroangiografi ble utført i villtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 og marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryoer. I alt ble 2 og 3 dpf-embryoer injisert med 1-2 nl dekstrantetrametyl rhodamin eller dekstranfluorescein (mw = 2000 kDa, Invitrogen) ved 10 mg/mL og avbildet umiddelbart. Confocal z-stacks ble kjøpt med Et Olympus UPSAPO 10×/NA 0.4-mål. For å dekke hele embryoet ble flere regioner avbildet og sydd ved Hjelp Av Stitching plugin I Fiji43.
Celletransplantasjon: Grupper av 15-25 donorceller fra marcksl1ark23; marcksl1brk24 mutantembryoer I Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 bakgrunn ble samlet fra en tilfeldig posisjon i blastoderm og transplantert til den laterale marginale sonen i blastoderm44 av wildtype mottakerembryoer ved 4,5-6 hpf. Ekstraksjon og transplantasjon ble utført ved hjelp Av En CellTram® 4r Olje mikroinjektor (Eppendorf)med en borosilikatglass kapillær GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) laget med en horisontal micropipette avtrekker P-87 (Sutter Instrument Co .) og EN mf-900 microforge (Narishige) for a oppna en’ skje ‘ form glatt spiss. Under transplantasjon embryoer der holdt i agarose belagt petriskåler med 0,5 X E2 buffer . Ved 2 dpf ble embryoer med mCherry-positive Isver valgt for mikroangiografi og bildebehandling. Totalt åtte uavhengige transplantasjoner ble gjennomført.
Kjemisk behandling: Latrunculin B (Merck Millipore) ble oppløst I DMSO til 1 mg/ml og lagret ved -20 °C. CK666 (SIGMA) ble oppløst i DMSO til 50 mM og lagret ved 4 °C. alle forbindelser ble fortynnet til ønsket konsentrasjon I E3 Buffer.
Transfeksjon, siRNA-mediert protein knockdown og skjær stress eksperiment: HUVECs (Lonza, C-2519A) ble dyrket I EGM medium (Lonza) og brukt til passasje 4. For plasmid-transfeksjoner ble celler sådd I Opti-mem medium (Gibco) ved 5,8 × 104 celler/cm2 på poly-L-Lysin og gelatinbelagt deksel og transfisert med 2 µ plasmid ved Bruk Av Lipofektamin 3000 (ThermoFisher Scientific). To timer etter transfeksjon ble Opti-mem medium endret TIL EGM medium uten antibiotika. For siRNA transfeksjon, HUVECs (7.9 × 104 celler / cm2) ble transfisert med 20 nM siRNA ved Bruk Av DharmaFECT1 reagens (Dharmacon). Transfeksjon ble gjentatt etter 24 h. Celler ble dyrket i ytterligere 24 h før total rna-ekstraksjon eller fiksering. On-TARGETplus menneskelig MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) ble brukt til knockdown MARCKSL1. ON-TARGETplus Non-target pool (Dharmacon) ble brukt som kontroll siRNA transfeksjon. Cellene ble fikset med 4% PFA/PBS, permeabilisert med 0,1% Triton X-100 og farget med 14 µ dapi for kjernemerking, Alexa 568-phalloidin (1:1000, ThermoFisher Scientific) for visualisering Av F-actin, og anti-VE-cadherin antistoff (1: 100, Celle Signalering) etterfulgt av anti-kanin Alexa 488 sekundære antistoff (1:1000, ThermoFisher Scientific) for å markere EC veikryss.
for skjærspenningseksperimenter ble Hpaec (Lonza) dyrket på 1000-1500 celler/mm2 på 1% gelatinbelagt tallerken I EGM-2 medium (Lonza) og brukt før passasje 9. Cellene ble utsatt for statisk eller laminær skjærspenning ved 15 dyn / cm2 for 0,5, 1 eller 6 timer ved hjelp av et parallelt platetypeapparat 45,46. Den ene siden av strømningskammeret besto av en 1% gelatinbelagt glassplate som de dyrkede Hpaecene hvilte på, og den andre siden besto av en polykarbonatplate. Deres flate flater ble holdt 200 µ fra hverandre med En teflon-pakning. Kammeret ble forsynt med inngang og utgang for væsken, og inngangen ble koblet til et øvre reservoar med et silikonrør. Utgangen var åpen til et lavere reservoar. Strømmen ble drevet av en rulle / rørpumpe. Væsken (EGM-2 medium) passerte fra det øvre reservoaret gjennom strømningskammeret inn i det nedre reservoaret. Strømningshastigheten ble overvåket med en ultralyd transittidsmåler (HT107, Transonic Systems) plassert ved inngangen, og den ble styrt ved å endre forskjellen i høyde mellom det øvre reservoaret og utgangen av strømningskammeret. Intensiteten av skjærspenningen (τ, dynes/cm2) som virker PÅ EF-laget ble beregnet ved å bruke formelen τ = 6µ/a2b, hvor μ er viskositeten til perfusatet (likevekt), Q er strømningsvolumet (ml/s), og a og b er tverrsnittsdimensjonene til strømningsbanen (cm). Etter skjærspenningseksponering ble total RNA isolert for qPCR.
Kvantitativ pcr i sanntid: qPCR ble utført ved bruk av 1 µ av cDNA, generert fra 150 ng (HPAECs) eller 500 Ng (HUVECs) av totalt RNA, i en 10-µ reaksjonsmiks inneholdende 1X Luna Universal Qpcr Master Mix (NEB) og 400 nM forover og bakover primere. Reaksjonene ble kjørt PÅ ABI Prism 7900HT instrument i firedoble. Data ble analysert ved HJELP AV RQ Manager-programvaren (Applied Biosystems) og MARCKSL1 mRNA relative uttrykk ble beregnet med 2-Δδ Metoden47 ved bruk av gapdh som referansegen.
hel mount in situ hybridisering: Hele mount in situ hybridisering ble gjennomført i henhold til standard protokoll 48. Embryoer ble fikset i 4% PFA ved 24, 48 og 72 hpf og permeabilisert med 10 µ / mL proteinase K. Hybridisering ble utført i buffer inneholdende 5% natriumdekstransulfat (MW = 500 kDa) ved 70 °c over natten. Etter stringens vask ble prøvene blokkert med 2% blokkerende reagens (Roche) i maleinsyrebuffer og inkubert over natten med anti-digoksigenin (DIG) antistoff, konjugert med alkalisk fosfatase (Roche, 1:5000) ved 4 °C. Embryoer ble farget MED NBT / BCIP-oppløsning (Roche) i fargebuffer . Embryoer ble ryddet i 70% glyserol over natten og avbildet Ved Hjelp Av Leica M205FA mikroskop. Marcksl1a OG marcksl1b DIG-merket 1.2 kb lange riboprobes ble generert fra plasmider som koder for full lengde cDNAs ved Hjelp Av MEGAscript SP6 eller T7 kits (Invitrogen).
enkeltcellet rna-sekvensering: ECs ble isolert fra Tg (kdrl:EGFP)s843 transgene embryoer. Cellesortering ble utført Med FACSAriaII Cellesorter (BD Bioscience). Enkeltcellesuspensjon ble lastet inn I 10x Kromsystemet og cDNA-biblioteker ble konstruert ved Hjelp Av Chromium Next GEM Single Cell 3 ‘ GEM, Library Og Gel Bead Kit v2 (10x Genomics) i henhold til produsentens protokoll. Biblioteket ble sekvensert På Illumina HiSeq 1500 Sequencer (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1 ble brukt for å de-multiplex raw base call (BCL) filer generert Av Illumina sequencers TIL FASTQ filer, utføre justeringen, strekkode telling, OG UMI telling. Sekvensering leser ble kartlagt til sebrafisk genom montering (GRCz11, Ensembl release 92). Videre analyser ble utført Ved Bruk Av Seurat package49 I r-programvare (https://www.r-project.org). Uttrykket matriser ble først filtrert ved å holde gener som er uttrykt i et minimum av 3 celler og celler som uttrykte et minimum av 200 gener for nedstrøms analyse. Celler ble ytterligere filtrert ved å velge for celler som uttrykker lavt mitokondrielt innhold (< 7%). Dataene ble deretter normalisert Ved Hjelp Av Normalisertdata-funksjonen som normaliserer genuttrykket for hver celle med det totale uttrykket.
Kvantifisering av blodkarets diameter: Levende Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 transgen wildtype eller marcksl1 mutantembryoer ble avbildet ved 50-52 hpf. Confocal z-stacks ble kjøpt med Et Olympus UPSAPO 40× / NA1.25 silikonolje nedsenking mål. For da-og PCV-diameterberegninger ble det tatt 4-5 målinger mellom Isver langs plommeforlengelsen (Isver nr. 10-14). FOR isv-diameter ble det gjort et gjennomsnitt på 6 målinger langs HVER ISV (Isv nr. 10-14) mellom DA og DLAV. Målingene ble gjort Ved Hjelp Av Fiji (NIH).
Kvantifisering AV EC-nummer og spredning: FOR Å telle EC-nummer ble 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 eller marcksl1ark23;marcksl1brk24-embryoer i Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916-bakgrunnen fikset i 4% PFA og beiset med 3 µ DAPI. Confocal z-stacks ble kjøpt med Et Olympus UPSAPO 40x / NA 1.25 silikonolje nedsenkningsmål. Kjerner ble talt i HVER ISV (Isv no. 9-22) mellom DA og DLAV. For å kvantifisere mitotiske ECs i Isver, wildtype eller marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryoer I tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916-bakgrunn ble fastsatt i 4% PFA ved 30, 36 og 48 hpf, permeabilisert i 1% DMSO / 1% Triton X-100 og farget med anti-fosfo H3-antistoff (1:250, Merck Millipore) etterfulgt Av Anti-kanin Alexa 488 sekundært antistoff (1:1000, ThermoFisher Scientific) og 3 µ DAPI. Confocal z-stacks ble kjøpt med Et Olympus UPSAPO 40x / NA 1.25 silikonolje nedsenkningsmål. Mitotiske celler (pH3-positive celler) ble talt i Isv på begge sider av embryoet (Isv no. 9-22). Isver ble visualisert ved hjelp av mcherry fluorescens. Bare en pH3-positiv celle per ISV ble detektert uavhengig AV ISV-posisjon. Under telling vurderte VI EC i telofase som en enkelt celle. For å telle antall EC-divisjoner ble wildtype eller marcksl1ark23;marcksl1brk24-embryoer i Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-MCHERRY)s916-bakgrunn avbildet fra 24 til 48 hpf med 6 min intervaller ved hjelp Av Et Olympus UPSAPO 30× / NA 1,05 silikonoljeinndykkingsmål. Antall celledivisjoner i HVER ISV (Isv nr. 11-15) ble kvantifisert.
Kvantifisering av actomyosinnivåer i apikal cortex: Levende Tg (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Tg (fli1ep: EGFP-Plcδ 1ph)rk26 og Tg (fli1ep: myl9b-EGFP)rk25; Tg(kdr-l:ras-MCHERRY)s916 sebrafiskembryoer ble avbildet ved 30-34 hpf ved Bruk Av Et Olympus UPSAPO 60× / NA 1.2 mål for nedsenking av vann. Intensiteten Av Lifeact Eller Myl9b langs apikal cortex og i cytoplasma ble målt ved Bruk Av Fiji. Forholdet mellom gjennomsnittlig kortikal og cytoplasmisk intensitet ble beregnet.
in vivo celleformanalyse: Enkeltcellemerking Av ECs i Isver ble oppnådd ved mosaikkuttrykk av enten fli1ep: lynEGFP plasmid i wildtype, marcksl1brk24 eller marcksl1ark23;marcksl1brk24 mutantembryoer eller fli1ep:marcksl1b-EGFP plasmid i wildtype embryoer. Ved 2 dpf ble mikroangiografi utført og fartøy ble avbildet Med Et Olympus UPSAPO 60×/NA 1.2 nedsenkningsmål for vann med optisk Z-planintervall på 0.25 µ. Celle form analyse Av ECs Av Isv ble utført i en semi-automatisert måte ved hjelp av en custom-skrevet ImageJ script utviklet I Python, utvide metoden beskrevet i ref. 50. Bilder ble først grovt beskåret for å redusere nedstrøms minnebehov og ytterligere metadata (fartøystype og embryoidentifikator) ble befolket. Et eget skript ble deretter kjørt for å projisere og pakke ut celler fra rundt et fartøy på EN 2d-overflate. Kort sagt ble de beskårne bildene først rotert basert på fartøystype for å grovt justere fartøyets akse med z-retningen i en bildestabel, og kanalen til den fluorescerende mosaikkcelleetiketten ble valgt for projeksjon. For å overvinne problemer med automatisert fartøysegmentering i blodpoolfluorescenskanalen forårsaket av variable fluorescerende bakgrunnsstrukturer og perfusjon av dekstran-rhodamin utenfor fartøyet, ble fartøyets akse identifisert ved manuelt å definere fartøyets posisjon omtrent hver 10 µ gjennom bildestakken og deretter utføre En Catmull-Rom spline-passform og interpolering. Dataene ble deretter transformert for å rette fartøyets akse i tre dimensjoner. Deretter ble posisjonen av maksimal intensitet i projeksjonskanalen identifisert langs stråler ved 1° intervaller rundt fartøyets akse. Denne informasjonen ble brukt til å projisere fluorescensintensitet på et plan hvor aksene er posisjon langs fartøyets akse og vinkelposisjon, og å kartlegge avstand fra fartøyets akse ved hver posisjon på det projiserte planet. Cellen ble identifisert fra det projiserte bildet Ved Hjelp Av Imagejs innebygde Intermodes-metode. Buelengdene representert av sidene av hver piksel forbundet med cellen ble deretter beregnet (\(l = \frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), hvor r er avstanden mellom celleassosiert piksel og fartøyets akse og d er siden av en piksel) og brukes til å generere målinger av celleoverflate og aspektforhold.
in vitro celleformanalyse: Faste HUVECs ble avbildet med Et Olympus UPSAPO 40× / NA 1.25 silikonolje nedsenkningsmål. I alt ble 10-20 bilder fra hvert dekkslip tatt for kvantifisering og analysert på en halvautomatisk måte ved hjelp av et spesialskrevet ImageJ-skript. Flerkanals z-stabler ble maksimalt projisert og kanalen som viser EN gfp markør ble identifisert fra instrument metadata. Imagejs innebygde otsu-terskelmetode ble brukt til å skille celler av interesse fra bakgrunnen; resulterende binære bilder ble rengjort ved å fjerne regioner mindre enn 105 µ2 og regioner i kontakt med grensen til synsfeltet. Et senere trinn med manuell inngripen tillot brukeren å eventuelt endre celleområder av interesse basert på dette binære bildet for å skille feil sammenslåtte celler eller inkludere celler som ble savnet av terskeloperasjonen. Skriptet deretter beregnet områder og perimeters for HVER CELLE ROI. I tillegg ble en ‘spikiness index’ beregnet for hver celle basert på forholdet mellom cellens omkrets og omkretsen av det tilsvarende konvekse skroget, og en verdi for aspektforholdet til cellen ble beregnet som forholdet mellom de store og mindre aksene til en ellipse montert på CELLENS ROI.
Analyse av membranblebbing: Tomter knyttet til membranblebbing ble generert på en halvautomatisk måte ved hjelp av et spesialskrevet ImageJ-skript. For hver avbildede membran ble forholdet mellom konturlengden til en membrankant og Den Euklidske avstanden mellom kantendepunktene beregnet ved hvert tidspunkt. Fra den resulterende tidsserien ble strømspektral tetthet beregnet Ved Welchs metode51. Strømspektral tetthet ble deretter gjennomsnitt over et vindu av interesse, definert empirisk som den karakteristiske tiden over hvilken blebs dannet (0,04-0,06 Hz); disse gjennomsnittlige verdiene ble sammenlignet mellom eksperimentell (Marksl1b overuttrykk) og kontrollforhold.
Analyse av aktin og myosin II dynamikk i blebs: Tomter knyttet dynamikken i aktin eller myosin i blebbing celler ble generert i en semi-automatisert måte ved hjelp av en custom-skrevet ImageJ script. Multikanal time-lapse z-stabler ble først maksimalt projisert langs z dimensjon. Programvaren identifiserte deretter automatisk kanten av en bleb mellom to brukerdefinerte ankerpunkter på alle tidspunkter ved Hjelp Av Imagejs innebygde otsu-terskelmetode som kjører På Marksl1b-EGFP-kanalen som en surrogat for membranmerking. Etter en bruker kvalitetskontroll trinn for å sikre nøyaktig identifisering av bleb kanten, aktin / myosin-kanal intensitetsprofil langs kanten ble ekstrahert ved hvert tidspunkt og plottet mot tiden i en kymograph. Ved hvert tidspunkt ble intensitetsstatistikk hentet sammen med blebområdet, definert her som det z-projiserte området omsluttet av kanten og linjen som ble med i punktene på hver side av bleb lengst fra blebspissen langs en akse vinkelrett på linjen som ble med i de brukerdefinerte ankerpunktene, og gjennomsnittlig aktin / myosin-kanalintensitet og blebområde ble plottet mot tiden.
Kvantifisering av kortikal aktintetthet og buntbredde: Høyoppløselige bilder av aktin I HUVECs ble kjøpt ved hjelp Av En Plan-APOCHROMAT 63x olje objektiv montert På En Zeiss LSM880 confocal mikroskop utstyrt Med En Airyscan Og GaAsP detektor. Omtrent 3 µ i andre regioner innenfor hver observasjon ble tilfeldig valgt og beskåret typisk 8 optiske seksjoner som dekker det kortikale nettverket ut av disse regionene. Projiserte bilder langs z-aksen av beskjærte stabler ble generert av maksimal intensitetsprojeksjon og underkastet følgende prosedyre. Siden aktinfilamenter i bildet var tvetydige og det var umulig å evaluere hele nettverket, kvantifiserte vi antall aktinfilamenter innenfor de begrensede områdene som tettheten av actin meshwork. Dette ble utført ved å sette skannelinjer langs X – og Y-akser på hver 4 piksler, og pikselverdier langs hver av skannelinjen ble utsatt For Savitzky-Golay filter52 for å beregne de første ordens derivater. Aktinfilamenter ble deretter identifisert ved å finne null-krysspunkter, som er intensitetstoppene i skannelinjen. Tellinger for topper ble delt av pikseltellingene på skannelinjen (bredde eller høyde på bildet) og tettheten av filamentene over bildet ble beregnet ved å ta gjennomsnittet av disse verdiene.
for å kvantifisere actin buntbredde ble de sentriske linjene i actin buntene generert ved å finne null-krysspunkter for førsteordensderivater beregnet av Savitzky-Golay-filteret og etterfulgt av Å bruke Hilditch-tynningsalgoritmen. For å eliminere en mulighet for at forgrenings – eller krysspunkter av aktinfilamenter påvirker målinger, ble forgreningspunkter funnet i den skeletoniserte linjen eliminert og segmentert. Den ortogonale aksen til det totale segmentet ble bestemt ved å oppnå egenvektoren, og fluorescerende intensiteter ble samplet langs den ortogonale aksen som kjørte tyngdepunktet av segmentet Med Lanczos-5 interpoleringsmetoden. Deretter ble diameteren av et filament bestemt av bredden av regionen som viste større eller lik halvparten av toppintensiteten innenfor linjen samplet langs den ortogonale aksen til det totale segmentet.
Statistikk: Statistisk analyse ble utført ved Bruk Av Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Utvalgsstørrelser var ikke forhåndsbestemt, forsøkene ble ikke randomisert, og etterforskerne ble ikke blindet for allokering under forsøk og utfallsvurdering.
Rapporteringssammendrag
Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.
