Sletting AV Kdm6a, En Histondemetylase Som Interagerer MED MLL2, Hos Tre Pasienter med Kabuki Syndrom | Jumbuck

Hovedtekst

Kabuki syndrom (KS; MIM 147920) ble først beskrevet I 1981 Av Niikawa Og Kuroki,1,2 og mer enn 400 tilfeller er rapportert i litteraturen. De viktigste kliniske egenskapene er karakteristiske ansiktsegenskaper, utviklingsforsinkelse, mild til moderat intellektuell funksjonshemming, postnatal vekstretardasjon og tilleggsfunksjoner, inkludert skjelettavvik, hypodonti og vedvarende føtale fingertuppputer. Sammenlignende genomisk hybridisering (cgh) mikroarray analyse klarte ikke å oppdage en tilbakevendende anomali i 72 KS individer.3-8 Bruk av exome-sekvenseringsstrategien førte nylig til identifisering AV MLL2 (MIM 602113) mutasjoner som en viktig årsak TIL KS.9 i fem nylig publiserte serier ble mutasjoner i MLL2 funnet hos 56%-76% AV ks-pasientene.9-13

fordi en betydelig andel av pasientene ikke har en påviselig MLL2-mutasjon, postulerte vi eksistensen av flere gener assosiert med KS. I jakten på en annen ks-forårsaker genetisk mutasjon, ti gener som interagerer MED MLL2 ble screenet i 15 MLL2-mutasjon-negative ks individer, og ingen patogene mutasjoner ble identifisert.11 Et annet gen som koder for ET MLL2-interagerende protein, KDM6A (tidligere kjent som UTX; MIM 300128), ble screenet hos 22 MLL2-mutasjonsnegative ks-individer, og igjen ble det ikke påvist noen forårsakende mutasjoner.13

ved å bruke array cgh-analyse (Agilent platform 244k) identifiserte vi de novo xp11. 3 mikrodeletjoner i To Belgiske MLL2-mutasjonsnegative ks-jenter (pasienter 1 og 2). Fordi begge slettingene var de novo, er de sannsynligvis patogene. Begge slettingene inkluderte enten en del AV ELLER hele KDM6A. Videre var DET Ingen kdm6a slettinger i en kohort av 411 normale kontroller i en tidligere studie.14 slettingen i pasient 1 inkluderte KDM6A exons 21-29, som kode for den terminale delen AV det katalytiske domenet TIL KDM6A, Og CXorf36, et gen som nylig var involvert I x-koblet autisme.15 i pasient 2 ble KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) og FUNDC1 (Figur 1) fjernet fullstendig. FUNKSJONENE TIL DUSP21 OG FUNDC1 forblir ukjente.

Region Xp11.3 Viser Slettingene

Region Xp11.3 viser slettingene hentet fra GENOMLESEREN (GRCh37/hg19) for pasienter 1, 2 og 3. De svarte fulle sporene representerer hver pasients sletting, og hver pasients nummer er over hans eller hennes respektive spor. Slettingen i pasient 1 spenner over 283,5 kb fra base 44,941,324 til base 45,224,829, pasient 2s sletting spenner over 815.7 kb fra base 44 377 858 til base 45 193 629, og patient 3s sletting spenner over 45,4 kb fra base 44 866 302 til base 44 912 718. Genene i området er notert under slettingssporene. CNVs I Databasen Av Genomiske Varianter er vist på bunnlinjen. DET er ingen tidligere rapporter OM kdm6a kopi-nummer endringer.

Vi sekvenserte DERETTER KDM6A ved Sanger-sekvensering og så etter intrageniske slettinger eller duplikasjoner med en målrettet tilpasset Agilent array CGH i en kohort av 22 MLL2-mutasjonsnegative ks-individer (8 kvinner, 14 menn). I samsvar med De etiske standardene Til Institut De Pathologie et De gé etikkutvalget ble foreldres samtykke innhentet for DNA-analyse av alle deltakerne i denne studien og for publisering av fotografier. Cgh microarray data (supplemental data, tilgjengelig på nettet) diskutert i denne publikasjonen har blitt deponert I National Center For Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression OMNIBUS (GEO)16 og er tilgjengelig under tiltredelse GSE32567 (se Tiltredelse tall seksjon).

ingen punktmutasjoner ble påvist, men vi identifiserte en de novo intragenisk delesjon (eksoner 5-9) hos en italiensk, mannlig KS-person (pasient 3). Vi sekvenserte OGSÅ UTY (MIM 400009), y-kromosom paralog AV KDM6A (se nedenfor), og så etter intrageniske slettinger eller duplikasjoner som nevnt ovenfor, men vi oppdaget ikke noen mutasjoner.

Pasienter 1 og 3 hadde en typisk ks-fenotype, inkludert lange palpebrale sprekker, lateral vridning av nedre øyelokk og moderat til alvorlig utviklingshemming (Tabell 1 Og Figur 2). Selv om ansiktstrekk av pasient 2 var ikke så klassisk, hun viste mange funksjoner i denne lidelsen, inkludert lateral sparseness av øyenbrynene, lange øyevipper, skjeling, lange palpebral sprekker, store og fremtredende ører, vedvarende foster fingertuppen pads, aorta coarctation, areolar fylde i barndom, og hirsutisme. Hun presenterte en mild utviklingsforsinkelse og hadde en normal verbal intelligenskvotient (IQ) score, en dårlig ytelse IQ score og hyperaktiv oppførsel (Tabell 1 Og Figur 2). Vi merket oss at pasienter 1 og 2 hadde lange hallusinasjoner(Figur 3).

Ansiktsutseende Hos Berørte Personer

(A) Pasient 1.

(B) Pasient 2.

(C) Pasient 3.

Legg merke til de lange palpebrale sprekkene hos pasienter 1 og 2 og de buede øyenbrynene hos pasienter 1 (milde) og 3.

Utseende Av Føtter Hos Berørte Personer

(A) Pasient 1.

(B) Pasient 2.

Legg Merke til de lange hallusinasjonene hos begge pasientene.

DERMED er KDM6A-slettingene hos disse tre pasientene forbundet med et bredt fenotypisk spektrum som spenner fra typiske KS-individer (pasienter 1 og 3) til en mildere klinisk presentasjon (pasient 2). Denne kliniske variabiliteten er også en funksjon hos pasienter med MLL2-mutasjoner.13 mulige effekter Av cxorf36-sletting hos pasient 1 og cxorf36 -, DUSP21-og FUNDC1-sletting hos pasient 2 på deres respektive fenotyper bør imidlertid også vurderes.

KDM6A (29 eksoner) er Et Av x-kromosomale gener som i stor grad unngår x-inaktivering.17 det koder for et 1,401 restprotein som inneholder to funksjonelle domener. Det katalytiske domenet er en histondemetylase som spesifikt katalyserer demetylering av mono -, di-og trimetylert lysin 27 på histon H3 (H3K27).18,19 denne demetyleringen medierer vevsspesifikt uttrykk for ulike gener og er for det meste involvert i utviklingsprosesser og cellesyklusen.19-22 Interessant, KDM6A og MLL2 virker sammen i epigenetisk kontroll av transkripsjonelt aktiv kromatin ved å motvirke Polycomb-gruppe (PcG) proteiner.22 DET andre funksjonelle domenet TIL KDM6A spiller en rolle i kromatinremodellering ved å samhandle med switch/sukrose nonfermentable (SWI/SNF) remodelleringskomplekset som inneholder transkripsjonsaktivatoren Brg1.23

SOM MLL2 spiller KDM6A en rolle i embryogenese og utvikling. Homozygot dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) Drosophila mutanter manifest grove øyne, dysmorfe vinger, og modifikasjon av kjønn kammer.21 denne fenotypen ligner trithorax-fenotypen, og støtter videre forestillingen OM AT KDM6A motvirker PcG-undertrykkelse.21 Videre UTX – 1 (C. elegans KDM6A ortholog) kan påvirke utviklingsavgjørelser i c. elegans vulval forløperceller via transkripsjonsregulering av gener som koder for retinoblastom (RB) proteinkompleks, som har blitt bevart fra ormer til mennesker.20 Kdm6a1 er også viktig i uttrykket av bakre HOX-gener i Sebrafisk.19 I TILLEGG spiller KDM6A sammen MED MLL2 en viktig rolle i reguleringen av muskelspesifikke gener under embryogenese.22,24 til slutt, medlemmer av en annen viktig utvikling gen familie (t-box gener, som virker i mesoderm i dannelsen av hjertet og ryggvirvlene) rekruttere KDM6A å aktivere sine målgener, igjen understreker ROLLEN KDM6A i utviklingsprosesser.23 Interessant er de fleste av de patogene mutasjonene for rapporterte t-box-gener i humane sykdommer lokalisert I t-box-domenet som interagerer MED KDM6A.23

KDM6A unnslipper X inaktivering, 17 men det har blitt foreslått At hos mus Er kdm6a-uttrykk fra det inaktive X-kromosomet betydelig lavere enn det fra det aktive X-kromosomet.25 Kdm6a-uttrykk er høyere i den voksne hjernen, den voksne leveren og spesifikke utviklende hjernegrupper hos kvinner enn hos menn.25 UTY er paralog AV KDM6A På Y-kromosomet.17 UTY har 84% aminosyre sekvens likhet MED KDM6A og kan kompensere for økt uttrykk FOR KDM6A i kvinner, til tross for at demethylase aktivitet har ennå ikke vist for DENNE KDM6A paralog.14,25

det er ikke overraskende å finne et annet gen assosiert MED KS på X-kromosomet fordi DET har vært rapporter OM ks-lignende pasienter med små ring X (r) kromosomer.26-34 i tillegg er det en klar overlapping mellom medfødte hjertefeil som er utbredt hos mannlige KS-pasienter(aorta coarctation og andre venstre sidede hindringer) og de som finnes hos pasienter med monosomi X og r (X) kromosomer.28,35 Små r (X) kromosomer fører vanligvis Til Turners syndrom gjennom fullstendig inaktivering av r (X). Det er imidlertid uklart hvorfor noen individer utvikler EN ks-lignende fenotype. Ufullstendig X-kromosominaktivering og påfølgende ekspresjon av vanligvis undertrykte gener har blitt foreslått som en forklaring PÅ ks-fenotypen hos noen r (X) – pasienter.32-34 KDM6A ble slettet hos de tre pasientene som hadde BÅDE EN ks-lignende fenotype og en r (X) der brytningspunktene var kartlagt; dette funnet er i samsvar med hypotesen om AT kdm6a-sletting spiller en viktig rolle i den ks-lignende fenotypen observert hos noen pasienter med en r (X).30,32,34 Vi kunne ikke bevise haploinsuffisiens for KDM6A hos pasienter 1 og 2 fordi kdm6a-ekspresjon var svært lav i perifere blodlymfocytter (data ikke vist). Likevel har studier vist at to kopier Av Kdm6a er nødvendige for normalt uttrykk i kvinnelige musembryoer og voksne mus,25 som tyder på at haploinsufficiency kan være den patogene mekanismen. Denne forklaringen forklarer imidlertid ikke det faktum at 45 -, X – og andre r(X) – pasienter med kdm6a-sletting ikke alle utvikler Kabukifenotypen.

hos pasienter 1 og 2 er molekylær x-inaktiveringsforholdet sterkt skjevt og er henholdsvis 89:11 og 97:3. X-inaktiveringsprofilen ble bestemt VIA PCR-forsterkning AV cag-repetisjonen i ekson 1 av androgenreseptorgenet før OG etter DNA-fordøyelse med HpaII og CfoI. For å avgjøre om den slettede kopien AV KDM6A var lokalisert på det aktive Eller inaktive X-kromosomet, utførte vi fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse MED EN kdm6a probe På x-kromosomene som hadde blitt differensielt merket ved inkorporering av 5-bromo-2′-deoxyuridin (5-BrdU). Resultatene viste at den slettede kopien AV KDM6A var lokalisert på det inaktive X-kromosomet i alle de 70 mitosene som ble analysert hos begge pasientene(Figur 4). Det FAKTUM AT KDM6A unnslipper X-inaktivering17 antyder at phytohemagglutinin (PHA)-stimulerte lymfocytter som har en slettet kopi AV KDM6A på det inaktive X-kromosomet, har en overlevelsesfordel over cellelinjer som har en slettet kopi AV KDM6A på det aktive X-kromosomet. Dette forslaget er i tråd med hypotesen om AT SELV OM KDM6A unngår X inaktivering, er uttrykket lavere fra det inaktive X-kromosomet enn fra det aktive X-kromosomet.25

Bilde AV FISK Studie På X-Kromosomer Differensielt Merket med 5-BrdU

et bilde AV EN FISK studie viser X-kromosomer differensielt merket ved inkorporering av 5-BrdU. Det inaktive x-kromosomet (i den hvite sirkelen) ser lysere ut enn det aktive X-kromosomet. Xqter subdelomere prober hybridiserer til Begge X-kromosomer (blå piler). KDM6A-signalet (hvit pil) er fraværende fra det inaktive X-kromosomet og er tilstede på det aktive X-kromosomet. For dette forsøket ble perifere blodlymfocytter fra pasienter 1 og 2 stimulert med fytohemagglutinin og dyrket i 72 timer. for å identifisere det senrepliserende inaktive X-kromosomet behandlet vi cellene med 5-BrdU (30 µ/ml) 5 timer før høsting. Kolkemid ble deretter tilsatt til en konsentrasjon på 0,2 µ / ml, og 1 time senere ble metafasepreparater produsert ved standardprosedyrer som involverte hevelse i 75 mM KCl og fiksering i 3: 1 metanol / eddiksyre. VI utførte FISKEANALYSE ved samtidig å bruke en subdelomer xqter-sonde merket Med SpectrumOrange (Vysis) for å indikere x-kromosomene (blå pil) og RP11-435K1 merket Med SpectrumOrange (Amlitech) for å skille mellom de slettede Og ikke-delete x-kromosomene (hvit pil). For å lette påvisning av inkorporert 5-BrdU denaturerte vi cellulært DNA I 2n HCl i 30 minutter ved 37°C. 5-BrdU ble deretter merket med et 5-BrdU-spesifikt monoklonalt antistoff konjugert til fluorescein (Roche) (1 µ/ml). TIL slutt, vi counterstained DNA ved å bruke en antifade løsning som inneholder 0.1 hryvnias / ml DAPI.

ROLLEN TIL UTY er i stor grad ukjent, og den har ingen in vitro demetylaseaktivitet. Funnet av en mannlig KS-person (pasient 3) med intragenisk sletting AV KDM6A og med klinisk alvorlighetsgrad som ligner på pasient 1, antyder at UTY delvis kunne kompensere for tapet AV KDM6A hos mannlige individer, som tidligere foreslått i litteraturen.25

SOM FOR MLL2 har somatiske homozygote og hemizygote mutasjoner I KDM6A blitt identifisert i ulike krefttyper (multippelt myelom, esophageal plateepitelkarsinom, nyrecellekarsinom, myeloid leukemi, brystkreft, kolorektal kreft og glioblastom), noe som tyder på AT KDM6A er et tumorsuppressivt gen.14 likevel er kreft Ikke et sentralt trekk ved KS, da denne komplikasjonen er rapportert hos bare syv ks-pasienter36,37 (akutt lymfoblastisk leukemi, Burkitt lymfom, fibromyxoid sarkom, synovial sarkom og hepatoblastom ble rapportert en gang, og neuroblastom ble rapportert hos to ks-individer).35,36 hvis tap av begge alleler er tilstrekkelig nok til å forårsake kreft, ville man forvente kreft å forekomme oftere i ks, for eksempel i retinoblastom (mim 180200) eller Wilms tumor (MIM 194070). Dette antyder enten at tap av det andre allelet I MLL2, KDM6A eller UTY er nødvendig, men ikke tilstrekkelig nok for kreftutvikling, eller at denne komplikasjonen er undervurdert, noe som viser betydningen av naturhistoriske studier i sjeldne syndromer.37

følgende histonmetylaser og histondemetylaser har vært involvert i andre multiple anomali-syndromer: EHMT1 (MIM 607001; Kleefstra syndrom ), SETBP1 (MIM 611060; Schinzel-Giedion syndrom), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensen-type, X-bundet mental retardasjonssyndrom), PHF8 (MIM 300560; Siderius-type, X-bundet mental retardasjonssyndrom) og MLL2 i KS. Identifikasjonen AV kdm6a patogene mutasjoner hos ks-pasienter utvider rollen som histonmodifikasjonsfaktorer i intellektuell funksjonshemning og medfødt misdannelse.

avslutningsvis rapporterer VI kdm6a mutasjoner som ÅRSAK TIL KS hos en hann og to hunner. Våre funn bekrefter BÅDE ks genetisk heterogenitet og et locus På X-kromosomet,som tidligere har blitt foreslått. Fordi NOEN KS-pasienter var negative FOR MLL2 -, KDM6A-og UTY-sekvensering og ikke viste slettinger eller duplikasjoner under screening, er det sannsynlig at andre ks-assosierte gener fortsatt gjenstår å bli oppdaget.