Rensing Og Karakterisering Av Asparaginase Fra Phaseolus vulgaris Frø

Abstract

L-asparaginase fra bakterier har vært brukt i behandling av akutt lymfoblastisk leukemi. Målet med denne studien var å rense Og karakterisere L-asparaginase Fra Phaseolus vulgaris frø i stedet for mikrobielle kilder. L-asparaginase ble renset til tilsynelatende homogenitet. Enzymet har en molekylvekt på 79 kDa. Den rensede asparaginasen hadde svært lav aktivitet mot en rekke asparagin-og glutaminanaloger. L-asparaginase var fri for glutaminaseaktivitet. Kinetiske parametere, Km og Vmax av renset enzym, ble funnet å være henholdsvis 6,72 mM og 0,16 µ. Enzymet hadde optimal pH ved 8,0. Enzymet viste høy stabilitet ved alkalisk pH (pH 7,5–9,0) når det ble inkubert i opptil 24 timer. L-asparaginase hadde samme temperaturovermale og termiske stabilitet ved 37°C. K + var i stand til å øke asparaginaseaktiviteten kraftig med 150% sammenlignet med andre testede metaller. Til slutt viste L-asparaginase ingen glutaminaseaktivitet og god stabilitet over et bredt spekter av fysiologiske forhold, og dermed kunne den brukes som en potensiell kandidat for behandling av akutt lymfoblastisk leukemi.

1. Innledning

L-asparaginase (L-asparagin amidohydrolase E. C. 3.5.1.1) brukes til behandling av akutt lymfoblastisk leukemi og non-Hodgkins lymfom . Bruken Av L-asparaginase i kreftbehandling er basert på dets evne Til å spalte L-asparagin, en aminosyre som er essensiell for lymfoblastenes vekst, til ammoniakk og L-asparaginsyre i serum og cerebrospinalvæske, siden lymfoblaster ikke er i stand til å produsere endogen L-asparagin som fører til død av disse cellene . De fleste kreftcellene er avhengige av en eksogen kilde til denne aminosyren for å overleve. Normale celler er imidlertid i stand Til å syntetisere L-asparagin og er dermed mindre påvirket av rask uttømming på grunn av behandling med dette enzymet. L-asparaginase kan også brukes til å redusere dannelsen av akrylamid i stekt og ovnskokt mat, spesielt i potetgull . Dannelsen av akrylamid ble tilskrevet reaksjonen av fri asparagin og reduserende sukkerarter . Nedbrytningen av asparagin ved asparaginase forhindret akrylamiddannelse .

l-asparaginase er utbredt blant planter, dyr og mikroorganismer . I plante ble dette enzymet først påvist i utviklingsfrøene Til Lupinus albus . Asparaginase har også blitt renset fra testa av modne frø Av L. polyphyllus . To former av enzymet er identifisert. En K + – uavhengig form finnes I L. arboreus og l. polyphyllus og En k + – avhengig form finnes I Pisum sativum og flere andre legume arter, inkludert Andre Lupinus arter . Arbeid med antistoffer mot k + – uavhengig form Fra l. polyphyllus viste ingen kryssreaksjon med enten ert asparaginase eller En rekke varianter Av Lupinus som inneholder K + – avhengig enzym, noe som tyder på at de to formene for asparaginase er immunologisk distinkte .

Det er Rapportert svært lite informasjon om bruk av asparaginase i behandling av akutt lymfoblastisk leukemi . Derfor var hovedmålet med denne studien å rense Og karakterisere L-asparaginase fra Phaseolus vulgaris frø fri For L-glutaminase i stedet For L-asparaginase fra mikrobielle kilder som brukes som anticancer og forårsaket bivirkninger på grunn av dets immunologiske responser.

2. Materiale og Metoder

2.1. Plantematerialer

Modne frø Fra Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 ble hentet fra Agricultural Research Center, Kairo, Egypt.

2.2. Rensing Av Asparaginase

2.2.1. Rå Ekstrakt

det rå ekstraktet av asparaginase ble fremstilt ved homogenisering av 50 g frø Fra Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 i 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0 inneholdende 10% glyserol, 50 mM KCl, 12,5 mM β-merkaptoetanol og 1 mM PMSF. Homogenatet ble sentrifugert ved 10 000 ×g og supernatanten ble betegnet som rå ekstrakt. Det rå ekstraktet ble konsentrert ved dialyse mot fast sukrose.

2.2.2. DEAE-Sepharose Kolonne

Konsentrert rå ekstrakt ble påført PÅ EN DEAE-Sepharose kolonne (15 × 1.6 cm i. d.) som tidligere var equilibrated med 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0. Enzymet ble eluert ved forskjellige konsentrasjoner Av KCl fremstilt i samme buffer ved en strømningshastighet på 60 mL / time og 3 mL fraksjoner ble samlet. Tre proteintopper ble eluert med asparaginaseaktivitet i henhold til elueringsordren (asparaginaser I, II OG III).

2.2.3. Sephacryl S-200

Asparaginase i med høyest aktivitet ble påført På en sephacryl S-200 kolonne (90 × 0.6 cm i.d.) som tidligere ble equilibrated med samme buffer ved en strømningshastighet på 30 mL/t og 3 mL fraksjoner ble samlet.

2.3. Asparaginaseanalyse

aktiviteten Til L-asparaginase ble målt ved modifisert Metode For Håndledd . L-asparaginasen katalyserer L-asparagin til L-asparaginsyre og ammoniakk, og sistnevnte reagerer Med nesslers reagens for å produsere et oransjefarget produkt. Enzymanalyseblandingen besto av 900 µ nylaget L-asparagin (20 mM) i 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0), 50 mM KCl og 100 µ rå ekstrakt av enzymet. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37°C i 30 min og reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 100 µ av 15% trikloreddiksyre. Reaksjonsblandingen ble sentrifugert ved 10 000 ×g i 5 min ved 4°C for å fjerne utfellinger. Ammoniakken frigjort i supernatanten ble bestemt ved bruk av kolorimetrisk teknikk ved å tilsette 100 µ nesslers reagens i prøven som inneholdt 100 µ supernatant og 800 µ destillert vann. Innholdet i prøven ble vortexert og inkubert ved romtemperatur i 10 min og OD ble målt ved 425 nm. Ammoniakken produsert i reaksjonen ble bestemt basert på standardkurven oppnådd med ammoniumsulfat. En enhet Av l-asparaginaseaktivitet er definert som mengden av enzymet som frigjør 1 µ ammoniakk per min ved 37°C.

2.4. Proteinbestemmelse

Protein ble kvantifisert Ved Metoden Bradford Med bovint serumalbumin som standard.

2.5. Bestemmelse av molekylvekt

den opprinnelige molekylvekten ble bestemt Av Sephacryl S-200. Kolonnen ble kalibrert med cytokrom C (12 400), karboanhydrase (29 000), bovint serumalbumin (67 000), alkoholdehydrogenase (150 000) og β-amylase (200 000). Dekstranblå (2.000.000) ble brukt til å bestemme tomromsvolumet (Vo). Subenhet molekylvekt ble estimert VED sds-polyakrylamid gel elektroforese . SDS-denaturert fosforylase b (94 000), bovint serumalbumin (67 000), ovalbumin (43 000), karbonsyreanhydrase (30 000), soyabønnetrypsinhemmer (20 000) og α-laktalbumin (14 200) ble brukt til kalibreringskurven.

2.6. Karakterisering Av Asparaginase

2.6.1. Substratspesifisitet

Asparaginaseaktivitet ble bestemt med noen analoger Av L-asparagin. Den relative aktiviteten ble uttrykt som prosentandelen av enzymaktiviteten bestemt mot forskjellige strukturanaloger Av L-asparagin til enzymaktivitet Med L-asparagin.

2.6.2. Kinetiske Parametere

Verdiene Av Michaelis-konstanter (Km) og maksimal hastighet (Vmax) ble bestemt ved Bruk Av L-asparagin som substrat i området 2-20 mM. Kinetiske parametere ble bestemt fra Lineweaver-Burk-plot.

2.6.3. Effekt av pH

den optimale pH for asparaginaseaktiviteten ble bestemt ved å analysere aktiviteten ved forskjellige pH-verdier. Ph-stabiliteten ble testet ved inkubering av enzymet ved pH på 5,0–9,0 for 24 timer ved 4°C i fravær av substrat og restaktivitet ble bestemt under standardanalysebetingelsene.

2.6.4. Effekt Av Temperatur

den optimale temperaturen for asparaginaseaktivitet ble bestemt ved å analysere enzymet ved forskjellige temperaturer. Varmestabilitet ble målt ved å inkubere enzymet alene ved forskjellige temperaturer i 1 h. etter varmebehandling ble enzymoppløsningen avkjølt og restaktiviteten ble analysert etter tilsetning av substratene.

2.6.5. Metallioneffekt

effektene av forskjellige metallioner på enzymaktivitet ble bestemt ved preincubating enzymet alene med 10 mM metallioner i 15 min før tilsetning av substratet. Aktiviteten som ble analysert i fravær av metallioner ble tatt som 100%.

3. Resultater Og Diskusjon

resultatene av rensingstrinn av asparaginase Fra p. vulgaris er oppsummert i Tabell 1. Elueringsprofilen til kromatografien PÅ deae-Sepharose-kolonnen (Figur 1) viste tre topper av proteiner med asparaginaseaktivitet. Peak one med høyest asparaginaseaktivitet ble påført På En sephacryl s-200 kolonne (Figur 2). L-asparaginase i ble renset 21,7 ganger med en spesifikk aktivitet 846 enheter / mg protein. Asparaginasen i ble vist å være ren etter Sephacryl s-200 kolonne som vurdert AV SDS-SIDE(Figur 3). Molekylvekten av asparaginase I Av Sephacryl S-200 og SDS-SIDE prosedyrer ga en verdi på 79 kDa som monomer subenhet. Dette funnet er i samsvar med molekylvekt for asparaginaser fra Vigna unguiculata (70 kDa) Og Lupinus polyphyllus (75 kDa). En middels molekylvekt på 58 kDa ble påvist for asparaginase fra ertblader . For bakterielle asparaginaser varierte molekylvekten fra 140 til 160 kDa med tetramer-underenheter . En Meget lav molekylvekt på 11,2 kDa ble påvist For Streptobacillus sp. KK2S4 asparaginase .

Figur 1

en typisk elueringsprofil for kromatografi av asparaginase Fra P. vulgaris på DEAE-Sepharose-kolonnen (15 × 1,6 cm i.d. tidligere likevekt med 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0 ved en strømningshastighet på 60 mL / time og 3 mL fraksjoner.

Figur 2

Gelfiltrering av asparaginase I FRA DEAE-Sepharose fraksjon På Sephacryl S-200 kolonne (90 × 1.6 cm i. d.). Kolonnen ble equilibrated med 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0 ved en strømningshastighet på 30 mL / t og 3 mL fraksjoner.

Figur 3

SDS-SIDE for homogenitet og molekylvekt bestemmelse av asparaginase I Fra Phaseolus vulgaris. (1) proteinmarkører; (2) Sefakryl S-200 asparaginase I.

substratspesifikiteten til asparaginase I har blitt undersøkt ved bruk av en rekke asparagin-og glutaminanaloger (Tabell 2). Aktiviteten Med l-asparagin ble ansett som 100% aktivitet. DL-asparagin viste 30% av enzymaktiviteten, HVOR DL-asparagin består av en 1 : 1 racemisk blanding. D-asparagin, L-asparaginsyre og l-glutaminsyreanaloger hadde svært lav aktivitet mot asparaginase I. ingen aktivitet ble påvist i nærvær Av L-glutamin. Derfor er asparaginasen I Fra p. vulgaris fri for glutaminase. Forurensningen av asparaginase med glutaminaseaktivitet forårsaket bivirkninger i løpet av kreftbehandling . L. arboreus asparaginase hydrolyserte bare L-asparagin og DL-aspartylhydroksamat . V. unguiculata-asparaginasen var spesifikk For L-asparagin, hydrolyserte Ikke D-asparagin og var ikke spesifikk For L-glutamin .

Kinetiske parametere, Km og Vmax for renset enzym, ble funnet å være henholdsvis 6,72 mM asparagin og 0,16 µ ammoniakk/mL (Figur 4). Tilsvarende Km-verdier på 6,6 og 7,0 mM ble bestemt for asparaginaser fra Henholdsvis l. arboreus og l. angustifolius . Asparaginase Fra Lupinusfrø har høy Km for asparagin (12,2 mM) . Lav Km (1.2 mM) ble bestemt for asparaginase Fra v. unguiculata . For bakterier Var Km-verdiene for L-asparaginase fra Escherichia coli og Erwinia carotovora henholdsvis 3,5 og 7,14 mM .

Figur 4

Lineweaver-Burk plot relatert av asparaginase i Fra p. vulgaris hastigheter til ulike l-asparagin konsentrasjoner.

Asparaginase jeg viste pH optimal ved 8.0 (Figur 5). Mellom pH 6,0 og 9,0 ble mer enn 50% av aktiviteten beholdt. Selv om maksimal aktivitet ved fysiologisk pH er en av forutsetningene For L-asparaginase for antitumoraktivitet, ville det rensede enzymet være nyttig fordi 80% av enzymaktiviteten ble beholdt ved pH 7,5. Enzymet viste stabilitet ved alkalisk pH (pH 7,5–9,0) da det beholdt 90% av sin opprinnelige aktivitet når det inkuberes opp til 24 timer (Figur 6). Imidlertid varierte pH-optimumet For L-asparaginaser fra flere planter fra 8,0 til 8,5 . De fleste av l-asparaginaser fra bakterier viste alkalisk pH optima (8,0–10).

Figur 5

pH optimal av asparaginase I Fra P. vulgaris. Enzymaktiviteten ble målt ved forskjellige pH-er ved hjelp av standardanalysemetoden som tidligere beskrevet.

Figur 6

ph-stabilitet for asparaginase I Fra P. vulgaris ved forskjellig pH etter inkubering i 24 timer ved 4°C.

Asparaginase i ble funnet å ha optimal temperatur ved 37°C (Figur 7). Tilsvarende optimal temperatur for asparaginase fra v. unguiculata (40°C) ble rapportert . Denne temperaturen var også lik den som ble rapportert For Pseudomonas aeruginosa og Pectobacterium carotovorum . Den optimale aktiviteten Til Streptobacillus sp. asparaginase ble registrert ved 35° Tvert imot ble L-asparaginase fra Chrombacteriaceae og Proteus vulgaris observert ved henholdsvis 20°C og 57°C . Det ble påvist en ikke-lineær sammenheng mellom asparaginase I og temperaturstabilitet (Figur 8). Enzymaktiviteten var stabil opp til 37°C etter inkubasjon i 1 time. Asparaginase Fra V. unguiculata var stabil opp til 40°C etter inkubasjon i 15 min . Asparaginaser Fra P. carotovorum og C. annuum beholdt sin opprinnelige aktivitet etter inkubasjon ved henholdsvis 40°C og 45°C i henholdsvis 60 min .

Figur 7

Temperatur optimal av asparaginase I Fra P. vulgaris. Enzymaktiviteten ble målt ved forskjellige temperaturer ved hjelp av standardanalysemetoden som tidligere beskrevet.

Figur 8

Termisk stabilitet av asparaginase I Fra P. vulgaris. Reaksjonsblandingen ble preincubated ved forskjellige temperaturer i 60 min før substrattilsetning, etterfulgt av avkjøling i et isbad. Enzymaktiviteten ble målt ved hjelp av standardanalysemetoden som tidligere beskrevet. Aktivitet på null tid ble tatt som 100% aktivitet.

effekten av forskjellige metallioner på asparaginase i ble undersøkt(Tabell 3). Metallioner ble brukt i en konsentrasjon på 10 mM. k+ var i stand til å øke aktiviteten av asparaginase i med 150%. I plant ble k+-uavhengige og k + – avhengige asparaginaser identifisert . K + fungerte også som forsterker På P. carotovorum asparaginase . Ca2 + økte aktiviteten litt med 110%, Men Cu2+ hemmet aktiviteten av asparaginase i. I Tillegg forårsaket Pb2+ og Hg2+ delvis hemmende effekt på asparaginase I. v. unguiculata asparaginase ble imidlertid aktivert Av Ni2+ Og Co2+ og ble hemmet Av Mn2+, Zn2+, Ba2+ og Hg2+ . EDTA som metallkelatormiddel forårsaket delvis hemmende effekt på asparaginase I. EDTA hadde imidlertid ingen effekt på p. carotovorum asparaginase .

4. Konklusjoner

L-asparaginasen I Fra p. vulgaris ble renset i glutaminasefri form, noe som kan redusere muligheten for bivirkninger i løpet av kreftbehandling. Enzymet viste god stabilitet over et bredt spekter av fysiologiske forhold som pH og temperatur. I neste trinn av prosjektet vil L-asparaginase i fra p. vulgaris bli brukt som en potensiell kandidat for behandling av akutt lymfoblastisk leukemi.

Interessekonflikter

forfatterne har ingen interessekonflikter som er relevante for dette papiret å avsløre.

Anerkjennelser

dette prosjektet ble finansiert av Nasjonal Plan For Vitenskap, Teknologi Og Innovasjon (MAARIFAH), Kong Abdulaziz By For Vitenskap og Teknologi, Saudi-Arabia, pris nr. (11-BIO-1516-03). Forfatterne anerkjenner også Med Takk Science And Technology Unit, King Abdulaziz University, for teknisk støtte.