Kinase Assay
Fremstilt Av Swathi Arur
Proteinkinase (lagerløsninger av 1-10 mg/ml rene kinaser) – for disse analysene bruker jeg renset ERK2 kinase (NEB). For hvert enzym er det viktig å bestemme optimal buffer, ionisk styrke og pH for aktivitet. Hvis disse betingelsene ikke er etablert, kan protokollen som er oppført nedenfor, brukes som utgangspunkt.
Substrat (lagerløsning på 10 mM) – Substrater inneholder vanligvis ett Serin /Treonin i et fosforyleringsstedmotiv. Som kontroll bruker Jeg Myelinbasisk Protein (oppnådd Fra Sigma), som BLE brukt AV NEB for å kalibere ERK2-kinasen.
i tillegg bør substratene ha en netto positiv ladning for å lette bindingen til fosfokellulosefiltre som brukes i analysen. For kvantitativ binding til fosfocellulosepapiret anbefales det å ha minst 2 basale rester og en fri aminoterminal. Hvis et fosforyleringsstedmotiv ikke er kjent, kan et generelt tyrosinkinasesubstrat brukes. For eksempel ,» Myelin Basic Protein » (er et ikke-spesifikt substrat for Mange MAPKs). For første reaksjoner bør en substratkonsentrasjon på 0,7-1,5 mM brukes. For å bestemme de kinetiske parametrene for fosforylering av det syntetiske peptidet, er det nødvendig med en rekke peptidkonsentrasjoner
10X Kinasebuffer-inneholder 5 mg/mL BSA (for å forhindre kinaseadsorpsjon til analyserøret), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (kjøpt Fra Upstate Biotech-Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – en lagerløsning på 1-5 mM er praktisk. Merk at De fleste MAPKs har Km-verdier for ATP i OMRÅDET 10-150 uM, så for kinetiske eksperimenter er det viktig å bruke mettende KONSENTRASJONER AV ATP for å komme til verdier Av Km og Vmax for peptidene.
ATP – 10 mCi/mL.
ERK2 Kinase Analyser
a) AUTORADIOGRAFI ANALYSE:
- en standard kinaseanalyse utføres i et volum på 25 ul:
- 2,5 ul AV 10x kinasebuffer
- 5 ul av 1,0 mM mgcl2 / ATP (0,2 mM endelig konsentrasjon)
- ATP (100-500 cpm / pmol)
- 3 ul av 10 mM substrat (1.2 mM endelig konsentrasjon)
- 1 U AV ERK2-kinasen
- H2O til 25 ul
1. Før forsøkene, lag en cocktail som inneholder nok buffer, ATP og ATP for å fullføre analysene. For analyser ved forskjellige substratkonsentrasjoner, bør substratet fortynnes og tilsettes separat til hvert rør. Etter dispensering av cocktailen i 1,5 ml mikrosentrifugerør, plasser rørene i et vannbad ved 30 grader C i 30 minutter. Reaksjoner bør initieres ved tilsetning av kinase og tillates å fortsette ved 30 grader C.
2. Etter ønsket tid, avslutte reaksjonene ved å legge til 2 X sds sample buffer og kjøre ut på en gel.
3. Tørk gelen På Et Whatman 3.0-papir, og utsett den tørre gelen til et autoradiogram og hold kassetten på-70Cfor 2 timer. (for lengre eksponeringer kontroller at filmen er tørr igjen før du setter en ny autoradiogram på den).
b) KINETISK ANALYSE:
1. Utfør kinase-analysen som ovenfor, denne gangen bruk forskjellige konsentrasjoner av substratene fra 50nM til 1mm. Stopp reaksjonen etter 30 minutter ved å tilsette 45 ul iskald 10% trikloreddiksyre (TCA) til hver reaksjon. Vortex reaksjonene.
3. Spinn i 2 minutter i mikrocentrifuge (10K rpm).
4. Spot 35 ul av supernatanter på 2,1 cm Diameter Whatman P81 cellulose fosfat filter sirkler.
6. Vask P81-filterkretsene tre ganger med 500 ml kald 0,5% fosforsyre (5-10 minutter per vask). Fremdriften av vasketrinnene kan følges ved å fjerne p81 filtersirkelen for en tom reaksjon og sjekke den med En Geiger-teller.
7. Vask en gang med 200 ml aceton ved romtemperatur i 5 minutter.
8. La filterkretsene tørke ved romtemperatur.
9. Sett filter sirkler i scintillation ampuller og måle 32P inkorporering ved å telle pads tørr i en scintillation teller. DEN spesifikke aktiviteten TIL ATP i en kinasereaksjon (f. eks. i cpm/pmol) kan bestemmes ved å spotte en liten prøve (2-5 ul) av reaksjonen på En P81 filtersirkel og telle direkte (ingen vasking). Teller per minutt oppnådd i kinasereaksjonen (minus blank) deles deretter av den spesifikke aktiviteten for å bestemme mol fosfat overført i reaksjonen.
Kinetikk Av Substratfosforylering
de kinetiske parametrene for fosforylering av et substrat av EN MAPK kan bestemmes ved hjelp av en variasjon på protokollen ovenfor.
1. Utfør en reaksjon ved høy konsentrasjon av substrat for å fastslå at proteinet er et substrat.
2. Varier enzymkonsentrasjonen i analysen. Frekvensen av substratfosforylering bør være proporsjonal med enzymkonsentrasjonen under analysebetingelsene. Dette eksperimentet brukes også til å bestemme mengden enzym som trengs for kinetiske studier.
for å bestemme priser, bør en tidskurs av substratfosforylering utføres. I så fall lag en større enzymreaksjon(vi bruker 150 ul). På de ønskede tidspunktene, trekk 25 ul alikvoter og overfør dem til mikrosentrifugerør som inneholder 45 ul iskald 10% TCA, og analyser reaksjonene som beskrevet ovenfor. Fosforylering av substratet bør være lineær med tiden, og for måling av kinetiske konstanter bør de første reaksjonshastighetene (5%) brukes.
3. Varier substratkonsentrasjonen i analysen. Bruk et plott av hastighet vs peptidkonsentrasjon for å få et innledende estimat Av Verdien Av Km. Et bredt spekter av substratkonsentrasjoner (f. eks. 20 uM til 2 mM) bør brukes i denne innledende måling.
4. For å bestemme Km (substrat) og Vmax , varierer substratkonsentrasjonen og måler frekvensen av fosfatoverføring. Et godt utvalg av substratkonsentrasjoner er følgende multipler Av Km: 0,125 X Km, 0,25 X Km, 0,5 X Km, 1,0 X Km, 2,0 X Km, 4,0 X Km, 8,0 X Km. Reaksjonene bør utføres i tre eksemplarer for best resultat.
5. Kinetiske konstanter bestemmes av vektede ikke-lineære minste kvadrater som passer til den hyperbolske hastigheten vs. tomter ved hjelp av iterative programmer som NFIT (Island Products, Galveston, TX).
BEREGNING AV RAR:
RAR: Relativ Akseptorforhold = Vmax / Km definert som et samlet mål på et proteins evne til å fungere som substrat.
jeg normaliserer RAR av et gitt substrat med Myelinbasisk Protein, dvs. beregne VERDIEN AV RAR for hvert substrat og divider den deretter med VERDIEN AV RAR Av Myelinbasisk Protein (dermed sette MBP på 1,0).
