Strukturelt grunnlag For anerkjennelse Av K48-koblet Ub-kjede ved proteasomal reseptor Rpn13

K48-koblet Ub-kjede svinger dynamisk mellom flere konformasjoner

vi brukte smFRET til å vurdere romlig arrangement av De to Ub-underenhetene i ligandfri K48-diUb. Vi introduserte fluoroforer, Alexa Fluor 488 Og Cy5, ved N-terminus av den distale Ub og C-terminus av den proksimale Ub (Supplerende Fig. S1a). Ved hjelp av forventning maksimering algoritm32, smFRET profilen Til K48-diUb kan best beskrives som tre overlappende BÅND arter (Supplerende Fig. S2). Høy-, medium-og lav-FRETARTER er sentrert PÅ FRETEFFEKTIVITET på 0,74, 0,57 og 0,23, med respektive populasjoner på ~48, ~39 og ~13% (Fig. 1a). FRETAVSTANDENE mellom sentrum av fluoroforer beregnes til henholdsvis ~43, ~50, ~64 Å. Dermed kan høy-, medium-og lav-FRETARTENE tilordnes kompakte, halvåpne og åpne tilstander som er eksisterende For K48-diUb.

a med fluoroforer konjugert ved 76 c stedet for den proksimale Ub og 0 C av den distale Ub (jfr. Supplerende Fig. S1a), kan smfret-profilen monteres på tre overlappende BÅNDARTER. Med mindre annet er angitt, brukes dette paret av konjugeringssteder for alle smfret-studier Av K48-diUb. High-FRET-arten (farget rød) tilsvarer en eksisterende kompakt tilstand. b-d den kompakte tilstanden kan selektivt berikes med full lengde Rpn13, og befolkningsøkningen kan monteres på en bindende isoterm. den kompakte tilstanden kan selektivt berikes Av Rpn13NTD, og befolkningsøkningen kan monteres for å være en bindende isotherm. h med fluoroforene konjugert PÅ N25C/N25C-steder, Kan Rpn13NTD selektivt berike den eksisterende kompakte tilstanden Til den distale diuben Til K48-tetraUb (jfr. Supplerende Fig. S5), affording en bindende affinitet. Populasjonene av smFRET-artene er i gjennomsnitt over tre uavhengige målinger, med feilene som indikerer 1 SD; KD-verdiene rapporteres som best egnet for passende feil

konformasjonsfluktuasjonen Av K48-diUb er tidligere undersøkt ved bruk av smFRET26. I den studien løste forfatterne to smFRET-arter For K48-diUb, nemlig høy-FRET og lav-FRETARTER med senterfreteffektivitet på henholdsvis 0, 69 og 0, 41, i tillegg til en ikke-FRETART. Forfatterne viste at titrering AV EN INAKTIVERT OTUB1 (OTUB1i), en deubiquitinase spesifikk For K48 isopeptid linkage33, beriker hovedsakelig lavfret-arten. Deres observasjon førte til forslaget Om At K48-diUb kan bli spesielt anerkjent AV OTUB1 gjennom en konformasjonsvalgmekanisme. Her gjentok vi smFRET titrering, og fant At OTUB1i beriker medium-FRET arter (Supplerende Fig. S3a-c). Videre kan befolkningsøkningen av medium-FRETARTENE ved OTUB1i-titrering monteres på en bindende isoterm med en KD-verdi på 7,7 ± 0.1@m (Supplerende Fig. S3d), som er nær kd-verdien tidligere rapportert26. Dermed, medium-GNAGE arter i denne studien skal tilsvare lav-GNAGE arter i forrige studie, og avviket kan oppstå fra ulike foton telling effektivitet og montering rutiner smFRET tid spor.

for ytterligere å bekrefte At K48-diUb svinger mellom tre eksisterende konformasjonstilstander, introduserte vi fluoroforer ved ytterligere par fluoroforkonjugeringssteder (Supplerende Fig. S1b-d). For de alternative stedene, selv om sentereffektiviteten til FRETARTENE er forskjellig, kan smFRET-profilene fortsatt beskrives som tre overlappende FRETARTER med lignende populasjoner (Supplerende Fig. S4). For eksempel, for de 25 C/25 C konjugeringsstedene, er høy -, medium-og lavfret-artene sentrert VED FRETEFFEKTIVITET på 0,68, 0,54 og 0,21, med respektive populasjoner på ~48%, ~43% og ~9% (Supplerende Fig. S4d). Således er konjugering av fluoroforene usannsynlig å forstyrre proteinstrukturen, og smfret-målingene har avslørt den iboende konformasjonsdynamikken Til K48-diUb uavhengig Av konjugeringsstedet, det vil si At K48-diUb veksler mellom tre forskjellige tilstander i fravær av et partnerprotein.

for ytterligere å vurdere Om Ub-underenheter i lengre K48-koblet Ub-kjede også svinger mellom flere konformasjonstilstander, analyserte vi smFRET-profilen Til k48-koblet tetra-ubiquitin (K48-tetraUb). Vi konjugerte fluoroforene på to n25c-steder i distal diUb (med respektert til proksimal diUb) Av K48-tetraUb. Den smFRET profilen kan også passe som tre overlappende BÅND arter (Supplerende Fig. S5a). Selv om de relative populasjonene av de tre artene er forskjellige fra en isolert K48-diUb med fluoroforer konjugert på samme steder (Supplerende Fig. S4d), sentrum SLITE effektiviteten AV SLITE arter er nesten identiske. Dermed er konformasjonstilstandene til diUb-enheten sannsynligvis bevart i lengre K48-koblet Ub-kjede, mens forskjellen i de relative populasjonene kan være et resultat av modulatorisk effekt av den proksimale diUb.

high-FRET-arten er selektivt beriket Av Rpn13

for å vurdere forholdet Mellom konformasjonsdynamikken Til K48-koblet Ub-kjede og rpn13-anerkjennelse, titrerte vi 150 pM fluorofor-merket K48-diUb med humant Full lengde Rpn13-protein. Interessant, ved tilsetning av 100 nM Rpn13, er den eksisterende høy-FRETARTER Av K48-diUb beriket fra ~48% til ~57% (Fig . 1a, b), mens populasjonen av mellomstore og lave FRETARTER minker. Bestanden av høy-FRET arter fortsetter å øke med Mer Rpn13 lagt (Fig. 1c), og bindingsisolmen kan monteres til EN KD-verdi på 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

Det har tidligere blitt vist At Rpn13NTD hovedsakelig er ansvarlig For Ub binding6, 7. Dermed utførte vi smFRET titrering for 150 pM fluorofor-merket K48-diUb ved bruk av Bare Rpn13NTD som bare omfatter de første 150 rester. Rpn13NTD også selektivt beriker høy-FRET arter Av K48-diUb (Fig. 1e, f). Befolkningsøkningen av høyfretarter kan monteres for å ha råd TIL EN KD-verdi på 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g), som er omtrent 4 ganger økning i affinitet sammenlignet med full lengde Rpn13. Hvis fluoroforene er festet på alternative konjugeringssteder (Supplerende Fig. S1b og S4b), titrering Av Rpn13NTD fører også anrikning av tilsvarende GNAGE arter etter en lignende trend, affording nesten identisk KD verdi (Supplerende Fig. S6). Dermed kan utseendet ytterligere rester ha en liten hemmende effekt på samspillet Mellom Rpn13NTD Og K48-diUb.

videre utførte vi smFRET titrering for 150 pM K48-tetraUb med fluoroforer konjugert ved distal diUb (Supplerende Fig. S5a). Titrering Av Rpn13NTD beriker selektivt de allerede eksisterende high-FRETARTENE til den fluoroformerkede distale diuben (Supplerende Fig. S5b-d), og bindingsisolmen kan monteres TIL EN KD-verdi på 214 ± 70 nM (Fig. 1h). Den 7 ganger reduserte bindingsaffiniteten sammenlignet Med Rpn13NTD: k48-diub-interaksjonen kan tilskrives selvforbindelsen mellom distal diUb og proksimal diUb34, noe som gjør bindingsflaten mindre tilgjengelig for rpn13-binding. Det er viktig at for alle smfret-titreringer Av K48-diUb eller K48-tetraUb, endres sentereffektiviteten til high-FRET-arten lite i fravær Eller nærvær Av Rpn13 eller Rpn13NTD. Dette betyr At Rpn13 binder Seg til en eksisterende konformasjon Av K48-diUb gjennom en konformasjonsvalgmekanisme, enten K48-diUb er i seg selv eller en del av lengre Ub-kjede. Det betyr også at high-FRET-arten, dvs. den eksisterende kompakte tilstanden Til K48-diUb, ikke er helt lukket, og er klar til å samhandle med andre proteiner. Det er viktig at den selektive anrikningen av high-FRET-arten også indikerer At Rpn13 skal samhandle med Begge Ub-underenhetene samtidig.

Rpn13 bindes fortrinnsvis Til K48-koblet diUb

for å vurdere Rpn13-bindende spesifisitet For K48-kobling, vurderte vi bindingsaffinitetene Mellom Rpn13 og andre Typer Ub-proteiner. Med titrering av 200 nM Rpn13NTD i 150 pM fluorofor-merket K48-diUb, øker populasjonen av high-FRETARTENE med 15% fra ~48% til ~63% (Fig. 1f). Ved denne konsentrasjonen Er k48-diubbindingen ennå ikke mettet Med Rpn13NTD (Fig . 1g) og derfor er populasjonen av high-FRET-arten følsom for liten endring av tilgjengelig rpn13ntd-konsentrasjon. Umerket K48-diUb kan konkurrere om bindingen Til Rpn13NTD med fluorofor-merket K48-diUb. Med tillegg av 150 pM umerket K48-diUb, befolkningen i high-FRET arter reduseres med 7,5%, tilsvarende en 50% hemming Av rpn13ntd-bundet fluorofor-merket K48-diUb (Fig. 2a). Med tillegg av 300 pM umerket K48-diUb, befolkningen i høy-FRET arter reduseres med 11%, som utgjør totalt 73% hemming (Fig. 2b). Som sådan konkurrerer både fluorofor-merket Og umerket K48-diUb om det samme bindingsgrensesnittet På Rpn13 med lignende bindingsaffinitet. Dette betyr også at konjugering av fluoroforene Til K48-diUb forårsaker liten forstyrrelse av samspillet Mellom Rpn13NTD og K48-diUb.

A, B Tillegg av 200 nM Rpn13NTD beriker først høy-FRET arter av fluorofor-merket K48-diUb (jfr. Figur 1f), og ytterligere tillegg av 150 pM og 300 pM umerket K48-diUb redusere bestanden av høy-BÅND arter. c, D Tillegg av 150 pM og 300 pM umerket Ub monomer har ubetydelig effekt på bestanden av high-FRET arter. e, f Tillegg av 150 pM K48-diUb og 150 pM M1-diUb forårsake svært liten nedgang i bestanden av høy-BÅND arter

Videre til blandingen av 200 nM Rpn13NTD og 150 pM fluorophore-merket K48-diUb, la vi til umerket Ub monomer, K63-koblet diubiquitin eller M1-koblet diubiquitin, for å vurdere om andre Typer Ub kan forskyve K48-diUb. Befolkningen i high-FRET-artene endres lite med tillegg av 150 pM eller 300 pM Ub monomer(Fig. 2c, d). Med tillegg Av 150 pM K63-diUb og 150 pM M1-diUb, er befolkningen i high-FRET-artene også uendret innenfor feilområdet (Fig . 2e, f). På den annen side medfører direkte titrering av 1 µ Rpn13NTD til fluoroforkonjugert K63-diUb og M1-diUb liten endring i deres eksisterende smFRET-profiler (Supplerende Fig. S7). Sammen samhandler Rpn13NTD selektivt Med K48-diUb.

Løsningsstruktur Av Rpn13NTD:K48-diub complex

selv om Vi nå har vist Rpn13NTD selektivt interagerer med K48-diUb, har bare den komplekse strukturen Mellom Rpn13NTD og Ub monomer blitt bestemt6,8. For å forstå hvordan de to underenhetene I K48-diUb samtidig kan samhandle med Rpn13NTD, satte vi oss for å bestemme løsningsstrukturen Til Rpn13NTD: K48-diUb-kompleks ved hjelp av kjernemagnetisk resonans (NMR). Ved dannelsen av proteinkompleks vil grensesnittrester oppleve forskjellige lokale miljø og derfor vise NMR-signaler. Vi fant at titrering av umerket K48-diUb TIL 15N-merket Rpn13 forårsaker store kjemiske skiftforstyrrelser (CSPs), som hovedsakelig involverer rester 73-83 og 93-106 (Fig. 3a). Disse restene danner en sammenhengende overflate På Rpn13, som dekker et område som er større enn forventet fra den tidligere bestemte komplekse strukturen Mellom Rpn13NTD og Ub monomer6, 7. På den annen side, titrering av umerket Rpn13NTD Til K48-dUb, med enten proksimal Eller distal Ub 15n-merket og den andre underenheten umerket, observeres Csp-ene hovedsakelig for rester i β-arkområdet for Begge Ub-underenhetene. Noen av grenseflaterester også forsvant ved dannelsen av komplekset (Fig. 3b, c).

a-c CSP gjennomsnitt over 1H og 15N dimensjoner av backbone amide protoner ved dannelsen av komplekset med 0,2 mM isotop-merket og umerkede proteiner. Innfelt: den 15n-merkede underenheten er illustrert med overflatepresentasjon, og de rødfargede rester har CSPs over den stiplede linjen. d, e med en paramagnetisk sonde konjugert på e24c-stedet i den distale Ub, ble intensitetsforholdene mellom paramagnetiske og diamagnetiske spektra og DE PRE Γ 2-verdiene vurdert for ryggradsamidprotoner AV 15N-merket Rpn13NTD. Grå bokser indikerte rester med svært store intermolekylære PREs. f med den paramagnetiske sonden konjugert ved n25c-stedet for den proksimale Ub, ble Γ2-verdier målt for amidprotoner AV 15N-merket distal Ub i K48-diUb. Feilfeltene angir 1 S. D., og rester helt utvidet ut i komplekset er betegnet med stjerner

Nuclear Overhauser effect (NOE) rapporterer avstandsforhold (<6 Å) mellom kjerner. Videre kan 13c halvfiltrert NMR-eksperiment gi NOE mellom 12c-bundet proton og 13c-bundet proton, dvs. intermolekylært avstandsforhold. Vi oppnådde intermolekylære NOEs mellom Rpn13NTD og den proksimale Ub, Mellom Rpn13NTD og den distale Ub, og mellom proksimale Ub og distale Ub (Supplerende Fig. S8). Videre konjugerte vi en maleimide-EDTA-Mn2 + paramagnetisk sonde PÅ E24C-stedet for den distale Ub, og samlet paramagnetisk avslapningsforbedring (PRE) FOR ryggrad amidprotoner Av Rpn13NTD, etter den etablerte protokollen22,35. Som vurdert enten ved toppintensitetsforhold av paramagnetiske versus diamagnetiske spektra eller ved transversal avslapningsforbedring Γ2-hastighet, Opplever rpn13-rester 30-42 og 101-106 stor PREs med alvorlig linjeutvidelse (Fig. 3d, e). Vi konjugerte også den paramagnetiske sonden PÅ N25C-stedet for den proksimale Ub, og evaluerte transversal relax enhancement rate Γ 2 for den distale Ub (Fig . 3f). Store pre-verdier observeres mellom De To Ub-underenhetene til den ligandfrie K48-diUb, og tilsetningen Av Rpn13NTD øker inter-Ub PREs, men med en lignende pre-profil. PRE NMR eksperimenter dermed bekrefte At Rpn13NTD beriker den eksisterende kompakt tilstand Av K48-diUb.

for å finjustere Rpn13NTD:K48-diub kompleks struktur mot eksperimentelle begrensninger, utførte vi stiv kroppsdokking med torsjonsvinkelfrihet gitt til diUb linker rester og til sidekjedene av grensesnittrester. For de 20 laveste energi konformatorer er rot-middel-kvadrat (RMS) avviket for backbone tunge atomer av alle stive rester 0.86 ± 0.54 Å (Supplerende Fig. S9 Og Tabell S1). De to Ub-underenhetene Til K48-diUb forblir forbundet i det komplekse, begrave løsemiddel tilgjengelig overflateareal (SASA) på ~1130 Å2. På Den annen side kiler Rpn13NTD inn, begraver ~940 Å av SASA med den proksimale Ub og ~1300 Å AV SASA med den distale Ub(Fig . 4a). Den komplekse strukturen Mellom Rpn13NTD og proksimal Ub Av K48-diUb i den foreliggende studien er lik den kjente komplekse strukturen Mellom Rpn13NTD og Ub monomer6,7, med rms forskjellen for ryggrad tunge atomer 2.17 ± 0.31 Å (Supplerende Fig. S10a). Interessant, selv om de hydrofobe rester L8, I44 Og V70 i den proksimale Ub er involvert for samspill Med Rpn13, de samme tre rester i den distale Ub er begravet I Ub-Ub-grensesnitt.

En Struktur Av Rpn13NTD: K48 – diub kompleks. Dannelsen av komplekset begraver omfattende grensesnitt mellom underenhetene. B Elektrostatiske potensielle overflater Av Rpn13NTD og distal Ub Av K48-diUb, trukket ved ± 3 kbt skala. Rester R104 i Rpn13NTD Og D39 i distal Ub vises som baller-og-pinner. c R104E charge-reversal mutasjon i Rpn13NTD forårsaker en 300 ganger reduksjon I bindingsaffinitet For K48-diUb, vurdert ved smFRET (jfr. Supplerende Fig. S11). KD-verdien er rapportert som passende passende feil. D Western blot analyser viser at transfeksjon av rpn13 r104e mutant (Med En N-terminal flagg) øker den totale mengden Av k48-koblede polyUb proteiner i cellen. E Celleviabiliteter ved varmesjokk (i forhold til celler uten varmesjokk) viser at transfeksjon Av rpn13 r104e mutant, men ikke av villtype Rpn13, gir termotoleranse. * P < 0,05, * * * P < 0.001, for å kontrollere celler i samme gruppe, uparret t-test; # # P < 0,01, # # # P < 0,001, til ubehandlede celler med varmesjokk, enveis ANOVA; & & P < 0.01, &&&P < 0.001, til wildtype rpn13 transfiserte celler med varmesjokk, enveis ANOVA

Rpn13NTD: K48 – diub kompleks struktur kan også bekreftes av enkeltmolekylet FRETDATA. Basert på den komplekse strukturen modellerte vi fluoroforene på deres konjugeringssteder I K48-diUb. Den gjennomsnittlige avstanden er 43.2 ± 5.8 Å mellom de geometriske sentrene av fluoroforaromatiske ringer, noe som tilsvarer en teoretisk BÅNDEFFEKTIVITET på 0,73 ± 0,13 (Supplerende Fig. S10b). Denne verdien er nesten den samme som sentereffektiviteten observert for high-FRET-arten(Fig. 1a).

Forstyrrelse Av Rpn13NTD: distal Ub-interaksjon forårsaker akkumulering av ubiquitinerte proteiner i celle

i den komplekse strukturen Mellom Rpn13NTD Og K48-diUb, interaksjonen Mellom Rpn13NTD og den proksimale Ub er lik den mellom Rpn13NTD og Ub-monomer, som tidligere rapportert (Supplerende Fig. S10a). Dermed designet vi eksperimenter for å vurdere funksjonell betydning for samspillet Mellom Rpn13NTD og den distale Ub Av K48-diUb. Mange ladede rester er plassert i grensesnittet Mellom Rpn13NTD Og den distale Ub Av K48-diUb, og derfor kan elektrostatisk kraft spille en viktig rolle for å stabilisere komplekset (Fig. 4b). Blant dem er rest D39 i den distale Ub nær rest R104 I Rpn13. Vi muterte således rpn13-rester R104 til et glutamat, og titrerte den muterte rpn13ntd til fluorofor-merket K48-diUb. Mutantproteinet beriker høy-FRETARTENE Av K48-diUb (Supplerende Fig. S11). Bindingsaffiniteten blir imidlertid mye svakere. Den bindende isotermen kan utstyres til EN kd-verdi på 10.0 ± 3.3 µ, omkring 300 ganger svakere enn wildtype Rpn13NTD (Fig. 4c). Som sådan er foreningen med den distale Ub viktig for den spesifikke anerkjennelsen Mellom Rpn13 og K48-diUb.

den reduserte bindingsaffiniteten TIL r104e-mutanten tillot oss å vurdere den funksjonelle betydningen av samspillet Mellom Rpn13 og K48-koblet Ub-kjede. Transient transfeksjon av wildtype Rpn13 øker mengden av k48-koblede polyubproteiner (Fig. 4d). Det er mulig at en overskuddsmengde av fri rpn13 konkurrerer om binding Til k48-koblede polyubproteiner med proteasomassosiert Rpn13 ved transfeksjon Av rpn13, noe som gjør rekrutteringen av allestedsnærværende substratproteiner til proteasomet mindre effektiv. På den annen side øker transfeksjonen Av rpn13 r104e mutant mengden K48-koblede polyubproteiner, sammenlignet med cellene transfisert med wildtype Rpn13 (Fig . 4d). Som en positiv kontroll inkuberte vi cellene med 1 µ MG132, en potent proteasomhemmer36. På grunn av blokkering av nedbrytning av labile proteiner øker tilsetningen AV MG132 signifikant mengden k48-koblede polyubproteiner. Til SAMMEN KAN r104e-mutasjon Av Rpn13 føre til akkumulering av ubiquitinerte substratproteiner. Dette kan tilskrives svakere interaksjon mellom proteasomassosiert rpn13 mutant Og K48-diUb Og K48-poyUb.

Varmesjokk kan redusere cellens levedyktighet. Vi fant at 30 min varmesjokk ved 43 °C kan redusere levedyktigheten TIL HEK293 celler til 75%. I likhet med de forrige rapportene36, 37, fant vi også at behandlingen AV MG132 har en beskyttende effekt på celleoverlevelse ved varmesjokk, med cellevennlighet redusert til ~90% (Fig . 4e). Dette skyldes AT MG132 hemmer proteasomal nedbrytning, noe som gjør de ellers kortvarige varmesjokkproteinene mer tilgjengelige (Fig. 4d). Vi analyserte også levedyktigheten til varmesjokkede celler transfisert med wildtype Rpn13, og fant ingen signifikant forskjell fra kontrollcellene uten rpn13-transfeksjon. På den annen side reduserte cellens levedyktighet Av rpn13 r104e transfiserte celler til ~83% ved varmesjokk, noe som er betydelig høyere enn for kontrollceller og celler transfisert med wildtype Rpn13(Fig . 4e). Dette innebærer at mutant Rpn13 har en beskyttende effekt på celleoverlevelse ved varmesjokk, tilsvarende EFFEKTEN AV MG132. Samlet sett er samspillet Mellom Rpn13 Og K48-bundet Ub-kjede avgjørende For Rpn13-mediert anerkjennelse av ubiquitinerte substratproteiner av proteasomet, mens en grensesnittpunktmutasjon I Rpn13 kan forårsake akkumulering av visse substratproteiner som varmesjokkproteiner, og gi termotoleranse til de transfiserte cellene.

Rpn13NTD: K48 – diub-interaksjon kan målrettes for å modulere rpn13-funksjonen

Rpn13 rekrutteres dynamisk til proteasomet via samspillet Mellom Rpn13NTD og C-terminalhalen Til Rpn27,13. Den komplekse strukturen her indikerer at bindingsgrensesnittet På Rpn13NTD For Rpn2 er nær, men overlapper ikke med bindingsgrensesnittet For den distale Ub Av K48-diUb(Fig . 5a). Vi forblandet dermed de siste 16 rester Av Rpn2 (Rpn2CTD) Med Rpn13NTD eller med full lengde Rpn13 ved 1:1-forhold, og titrert Rpn13NTD:Rpn2CTD kompleks til fluorofor-merket K48-diUb. Forblandingen Av Rpn2CTD økte kd-verdien Av Rpn13NTD: K48-diUb fra 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g) til 66.8 ± 13.9 nM (Supplerende Fig. S12a-c Og Fig. 5b), mens redusert kd verdien Av Rpn13: K48-diUb fra 119 ± 24 nM(Fig . 1d) til 43.9 ± 12.8 nM (Supplerende Fig. S12d-f Og Fig. 5c). Ved å gi måleusikkerheten forårsaker foreningen Av Rpn2CTD bare liten forstyrrelse for bindingsaffiniteten Mellom Rpn13 og K48-diUb, som også kan ha å gjøre med tilstedeværelsen av linker og C-terminaldomenet Til Rpn13.

a bindingsflaten til den distale Ub Av K48-diUb på Rpn13NTD ligger ved siden Av bindingsflaten Til Rpn2CTD. Med rpn13ntd-rpn2ctd kompleks struktur (PDB kode 5V1Y) oppå rpn13ntd, er Rpn2CTD vist som rød tegneserie. Rpn13 rest K34 er nær C-terminus av distal Ub (vist som en prikket linje). B, c Binding slektskap ble oppnådd fra smFRET titreringer av equimolar Rpn13NTD: Rpn2CTD eller Rpn13: rpn2ctd til fluorofor-merket K48-diUb. KD-verdiene rapporteres som passende passende feil. D Binding Av Rpn2-forankret Ub monomer sannsynlig opptar den samme bindende overflaten av den distale Ub, forårsaker forskyvning av sistnevnte. e, f smFRET konkurranse eksperimenter, med ytterligere tilsetning av 150 pM Rpn2CTD-Ub fusion protein, til blandingen av 200 nM Rpn13NTD eller full lengde Rpn13 Og 150 pM fluorophore-merket K48-diUb (c.F. Figur 1c og f). Feilen indikerer 1 S. D. fra tre uavhengige målinger av populasjonene av smFRET-arten

Rpn2 og distal Ub Av K48-diUb opptar nærliggende overflater På Rpn13NTD. Derfor kan et fusjonsprotein med Ub-monomer vedlagt Ved C-terminus Av Rpn2CTD stikke ut og forstyrre samspillet Mellom Rpn13NTD og den distale Ub Av K48-diUb(Fig . 5d). Som vi har vist, tillegg av 200 nM Rpn13NTD øker bestanden av høy-FRET arter av 150 pM fluorofor-merket K48-diUb til ~63% (Fig. 1f), mens tillegg Av Ub monomer ikke kan konkurrere Om rpn13ntd binding (Fig. 2c, d). Når vi la til ytterligere 150 pM umerket Rpn2CTD-Ub fusjonsprotein, reduseres populasjonen av høyfretarter med ~4% til ~59% (Fig . 5e). På den annen side har vi vist at tillegg av 200 nM full lengde Rpn13 øker populasjonen av høy-FRETARTER av 150 pM fluorophore-merket K48-diUb til ~60% (Fig. 1c). Ytterligere tilsetning av 150 pM umerket Rpn2CTD-Ub fusjonsprotein reduserer populasjonen av høy-FRETARTER med ~4,5 til ~55,5% (Fig. 5f). Merk at å legge Til En Ub på Rpn2CTD har nesten ingen effekt på samspillet Mellom Rpn2CTD og Rpn13NTD (Supplerende Fig. S13). Dermed indikerer våre data At Rpn2 og K48-diUb bindende grensesnitt På Rpn13NTD er nær hverandre. Enda viktigere, rpn2-forankret Ub kan fysisk blokkere tilgangen til distal diUb Til Rpn13, og svekke samspillet Mellom K48-diUb og Rpn13.