KSRP specificerer monocytisk og granulocytisk differentiering gennem regulering af miR-129-biogenese og RUNKS1-ekspression

monocytisk og granulocytisk differentiering af cellelinjer

den humane monocytiske cellelinie THP-1 og den promyelocytiske cellelinie NB4 og HL-60 blev købt fra ATCC (Manassas, USA) og vedligeholdt i rpmi1640 suppleret med 10% føtal bovint serum (gibco, Carlsbad, CA). Celler blev screenet ved PCR til godkendelse og ved immunofluorescenstest for frihed fra mycoplasma-kontaminering. Monocytisk differentiering af THP-1-og HL-60-celler blev induceret ved behandling af cellerne med 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland) for 0, 24, 48 og 72 h. granulocytisk differentiering af NB4-og HL-60-celler blev induceret ved behandling af cellerne med 1 liter atra (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Ingen cellelinjer anvendt i denne undersøgelse blev fundet i databasen over almindeligt fejlagtigt identificerede cellelinjer, der vedligeholdes af ICLAC og NCBI Biosample. Cellelinjer blev testet for mycoplasma-kontaminering, men er ikke blevet godkendt igen.

sortering af CD34+ HPC ‘ er

humant navlestrengsblod (UCB) blev opnået fra normale fuldtidsleverancer på Peking Union Hospital, og knoglemarv (BM) fra normale donorer blev opnået fra det 307.Hospital i Det Kinesiske Folks Befrielseshær. Informeret samtykke og godkendelse af Forskningsetikudvalget blev opnået. Mononukleære cellefraktioner (MNC) blev isoleret fra UCB og BM ved anvendelse af en percoll densitetsgradient (d = 1,077; Amersham Biotech, Tyskland). CD34 + celler blev beriget fra MNC ‘ er ved anvendelse af positiv immunomagnetisk selektion (CD34+ MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Tyskland).

monocytisk differentiering af HPC ‘er

de berigede CD34+ hæmatopoietiske progenitorceller (HPC’ er) blev dyrket i IMDM med høj glukose suppleret med 30% føtal bovint serum (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 liter 2-ME, 2 ng/mL rekombinant human IL-3, 100 ng/mL rekombinant human SCF, 50 ng/mL rekombinant human M-CSF, 100 ng/ml rekombinant humant FLT3, 1 ng/ml rekombinant humant IL-6, 60 mg/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin til inducering af monocytdifferentiering. Cytokiner blev købt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celler blev høstet hver 3-5 dage. Til morfologiske analyser blev celler smurt på glasrutschebaner, fikseret i methanol 10 min, farvet med maj-gr Larvvald / Giemsa og analyseret ved 400 gange forstørrelse under et mikroskop (Nikon TE2000, Japan) udstyret med et digitalt kamera.

granulocytisk differentiering af HPC ‘er

de berigede CD34+ hæmatopoietiske progenitorceller (HPC’ er) blev dyrket i IMDM med høj glukose suppleret med 30% føtal bovint serum (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 liter 2-ME, 2 ng/mL rekombinant human IL-3, 100 ng/mL rekombinant human SCF, 20 ng/mL rekombinant human G-CSF, 10 ng/mL ml rekombinant humant IL-6, 60 mg/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin til Inducering af Granulocytdifferentiering. Cytokiner blev købt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celler blev høstet hver 3-5 dage. Morfologiske analyser blev udført på samme måde som monocytisk differentiering.

oligonukleotider og konstruktioner

mir-129 efterligninger (5′-CUUUUUGCGGUCUGGCUUGC-3′), miRNA-hæmmere (anti-129) og negative kontrolmolekyler (NC) blev opnået fra Dharmacon (Austin), og celler blev transficeret med en endelig koncentration af disse konstruktioner på 100 nM ved anvendelse af DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TKS). siRNA ‘er (specielt til KSRP og RUNKS1) og kontrolsirna’ er (Si-Con) blev syntetiseret af Dharmacon, og celler blev transficeret med 100 nM sirna ‘ er ved hjælp af DharmFECT1.

for ksrp-overekspression blev den menneskelige ksrp (NM_003685.2) cDNA ORF-klon (pEGFP-KSRP) købt fra Addgene (Addgene, MA). Til ksrp-nedslag blev KSRP sh-RNA klonet i pSIH-H1-vektoren nedstrøms for H1-promotoren (lenti-sh_KSRP) eller direkte købt i form af lentivirale konstruktioner (TL311984, Origene, Rockville, MD). For pri-129-1 overekspression blev en 700-bp vildtypekonstruktion klonet ind i pCMV6-vektoren (129) eller ind i pmirna1-plasmidet (lenti-129). De mutante ksrp-bindingssteder i pri-129-1 (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 og 129_mutf) blev også oprettet i pCMV6-vektorer. For mir-129 nedslag blev mirsip-129 og mirsip-kontrol købt fra System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). For RUNK1-overekspression blev RUNK1-ORF klonet ind i pmirna1-vektoren (Lenti-RUNK1).

til reportergenanalysen af Mir-129-mål blev den omvendte komplementære sekvens til miR-129 indsat i pMIR-reporteren nedstrøms for firefly luciferase-genet for at generere den positive reporterkonstruktion (129_positive). 3 ‘ – UTR af human RUNKS1 mRNA blev forstærket og klonet ind i den samme pMIR-reporter nedstrøms for firefly luciferase genet for at danne vildtype reporter (RUNKS1_VT). Mutationer af Mir-129-bindingsstederne i 3’ – UTR af humane runks1 mRNA-sekvenser blev oprettet ved hjælp af det Stedstyrede Mutagenesesæt (Runks1_mut1, Runks1_mut2 og Runks1_mut3). Celler blev transficeret med disse konstruktioner ved hjælp af enten Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) til 293tn-celler eller Lipofectamine&PLUS for THP-1-celler og NB4-celler i henhold til producentens protokoller. Alle primere er anført i supplerende Data 7.

lentivirus production

det relevante lentivirus-emballagesæt blev købt hos System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) og anvendt i henhold til producentens retningslinjer. De høstede virale partikler (lenti-129, lenti-mirsip-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNKS1, lenti-sh_runks1 og lenti-GFP) blev tilsat til CD34+ HPC ‘ er, THP-1 eller NB4 celler, og cellerne blev derefter vasket med IMDM efter 24 timer og belagt til efterfølgende forsøg.

miRNA dyb sekventering

THP-1 celler blev elektroporeret med pEGFP-KSRP eller pEGFP ved hjælp af Neon transfektionssystemet og derefter sorteret efter FACS for at indsamle de GFP-positive celler. Små RNA ‘ er blev isoleret fra det samlede RNA med mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TC) ifølge producentens anvisninger. Små RNA-biblioteker og miRNA-sekventering blev udført af Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, Kina) ved hjælp af en Illumina Hisek2000 (Illumina, USA). Sekventeringsdataene blev filtreret, ekspressionsprofilerne blev konstrueret, og adapterdimer-læsningerne blev adskilt fra miRNA-læsningerne, der allerede var identificeret i miRbase 17.0. RNA-sek-data blev analyseret af Genergy Bio, og en liste over miRNA ‘ er, hvis ekspression blev øget ved KSRP-overekspression, vises i supplerende Data 5, 6.

poly(A)-beriget RNA dyb sekventering

Total RNA blev ekstraheret ved hjælp af Trisol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens anvisninger til fremstilling af det Poly(a)-berigede RNA-sekv-bibliotek. Poly (A)-berigede RNA-biblioteker og dyb RNA-sek blev tilpasset Hisek2000 (Illumina, San Diego, CA) og blev udført af Genergy Bio. En komplet liste over primære miRNA ‘ er, hvis udtryk faldt ved KSRP-overekspression, er anført i supplerende Data 5, 6.

RACEANALYSE

for at identificere den fulde længde af primær-129-1, 5′ og 3′ RACE blev der udført reaktioner på total RNA af THP-1-celler ved hjælp af 5′-Full RACE Kit og 3′-Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Kina) i henhold til producentens manual. De primere, der blev brugt til RACE-eksperimentet, er anført i supplerende Data 7.

Luciferase reporter assay

til funktionelle mekanistiske analyser af miR-129-1 forudsagde vi flere mir-129-1 mål ved hjælp af bioinformatikprogrammet Targetscan og Miranda og validerede kandidaterne med luciferase reporter assay. 293tn-celler blev co-transfekteret med 0,4 liter af reporterkonstruktionen, 0,015 liter af PRL-TK-kontrolvektoren og 5 pmol af Mir-129 efterligning eller negativ kontrol efterligning. Efter 48 timer blev cellerne høstet og analyseret med Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, vi) i henhold til producentens anvisninger. Alle transfektionsanalyser blev udført i tre eksemplarer.

in vitro-behandlingsassay

behandlingsassayet blev udført under anvendelse af en 10 mg/mL HeLa-celle NE. Til udtømning af KSRP blev ti mikroliter KSRP-antistof tilsat til 1 mg HeLa-celle NE, og et IgG-antistof blev tilsat som kontrol. Efter en inkubation på 30 minutter ved 4 liter C blev ksrp-protein-og antistofkomplekset immunopræcipiteret med Protein A-perler (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatanten er det ksrp-udtømte nukleare ekstrakt (RRKSRP-NE). 700-nt, isotopmærket vildtype pri-129-1 (129_vt) og pri-129-1 indeholdende alle fire ksrp-bindingsstedsmutanter (129_mut) blev fremstillet ved standard in vitro-transkription med T7 RNA-polymerase i nærvær af-UTP ved anvendelse af 129_vt-og 129_mut-konstruktionerne. 129 og 129 blev inkuberet med hela cell NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) i 30 minutter ved 37 liter C i nærværelse af KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), og 4 pmol (4 liter)). Reaktionsblandingerne blev udsat for phenol: chloroformekstraktion, udfældning og denaturerende gelelektroforese efterfulgt af autoradiografi.

rescue processing assay blev udført. Kort fortalt blev 20 liter af LÆRKSRP-NE inkuberet med 1 pmol af-UTP-mærket primær mir – 129 og forskellige mængder KSRP (0,5 liter) til forskellige tidspunkter (15, 40 og 60 minutter) ved 37 liter C. reaktionsblandingerne blev behandlet med proteinase K i 30 minutter ved 37 liter C og derefter udsat for phenol:chloroformekstraktion, udfældning og denaturering af gelelektroforese efterfulgt af autoradiografi. Alle ikke-beskårne RNA-geler findes i supplerende Fig. 12.

Northern blot

i alt blev 40-liters RNA-prøver indlæst og kørt på denaturering (urinstof) 12% polyacrylamidgeler og derefter overført til Hybondmembraner (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatve, NJ). Hybridisering blev udført med digoksigenin (DIG)-mærket pri-miR-129, pri-32P-mærket præ – eller moden mir-129-5p-sonde natten over ved 42 kur C. U6 snRNA og rRNA blev serveret som belastningskontroller for henholdsvis præ-, moden eller primær miRNA. Ekspressionsniveau blev målt ved normalisering til ekspressionen af U6 snRNA eller rRNA. Oligonukleotidprobe-sekvenserne er anført i supplerende Data 7. Ekspression af miRNA blev kvantificeret ved hjælp af billede J-programmer. Alle uncropped Northern blot kan findes i supplerende Fig. 12.

RNA-immunopræcipitationsassay

lige store mængder THP-1-eller NB4-celler blev høstet i iskold PBS. Dernæst blev cellepellets resuspenderet i 1 mL lysisbuffer B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotinin, 1 mM leupeptin og 2 mM vanadyl ribonukleosid komplekser (VRC)) og blid sonikering. Efter at lysaterne blev centrifugeret ved 12.000 omdr. / min. i 15 minutter, blev supernatanterne præcleared med Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) i lysis buffer B med 10 liter gærtrna (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Derefter blev de præcleared lysater anvendt til RIP med enten et anti-KSRP-antistof (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) eller en kaninisotype IgG (12-370, Merck Millipore, Tyskland; 1:500) som kontrol for 4 timer ved 4 kur C. Perlerne blev vasket tre gange med lysisbuffer B, hvor den sidste vask indeholdt yderligere 0,5% natriumdeoksicholat, efterfulgt af ekstraktion med buffer C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% ren-mercaptoethanol og 20% glycerol) ved stuetemperatur i 10 min. Det immunopræcipiterede RNA blev ekstraheret med Trisol og phenolchloroform. For RT-PCR blev hver RNA-prøve behandlet med DNase i (Ambion, DNA-fri TM kit). Derefter blev lige store mængder omvendt transkriberet med cDNA-revers Transkriptionssæt med høj kapacitet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ved hjælp af denne metode er det muligt at foretage en grundig undersøgelse af, om der er behov for yderligere behandling. De primere, der anvendes til RIP-PCR-forsøgene, er anført i supplerende Data 7.

Immunudfældning af protein-RNA-komplekserne

Maltosebindende protein (MBP)-affinitetsrensning blev anvendt til at identificere proteiner associeret med primære miRNA ‘ er. MS2-MBP-ekspressionsplasmidet var en gave fra Dr. Lingling Chen (Chinese Academy of Sciences), og MS2-MBP blev udtrykt og oprenset fra E. coli ved hjælp af en protokol fra Steise lab (Yale University). Tre MS2 coat proteinbindingssteder (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagcccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3’) blev indsat nedstrøms for pri-129-1-gensekvensen eller pri-129-1 ksrp-bindingssted mutante sekvenser. 293tn-celler blev transficeret med MS2-holdige konstruktioner for at opnå proteiner associeret med primære miRNA ‘ er, og 10 millioner celler blev anvendt til hvert immunopræcipitationsassay. Cellerne blev høstet 48 timer efter transfektion og underkastet RNA-nedtrækningsanalyse. Kort sagt blev cellerne skyllet to gange med iskold PBS inden høst i 10 mL iskold PBS ved skrabning. Derefter blev cellepellets resuspenderet i 1 mL IP-buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, proteinasehæmmercocktail) og underkastet 2 runder blid sonikering og centrifugeret for at opnå celleekstrakter. Supernatanten blev først inkuberet med MS2-MBP i 1 time og derefter amyloseharpiksperler (NEB) i yderligere 1 time ved 4 C. perlerne blev vasket fem gange med IP-buffer med blid sten og en sidste vask med IP-buffer forsynet med yderligere 150 mM NaCl. Proteinkomponenterne blev endelig elueret fra perler med IP-buffer suppleret med 12 mM Maltose og blev kontrolleret af VB med følgende primære antistoffer: kanin anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), kanin anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), kanin anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000,) og mus anti-GAPDH (60004-1-ig, proteintech; 1:1.000.000).

RNase h-beskyttelsesassay

der blev udført en standard RNase h-beskyttelsesreaktion i et samlet volumen på 25 RNase h-beskyttelsesreaktion indeholdende 1 pmol KSRP-protein, 1 pmol af-UTP-mærket RNA, 20 RPG/mL DNA-oligonukleotider, 12 mM HEPES (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U RNasin (40 U/lutl, Promega, Madison, 1 u af E. coli RNase H. til kontrol blev en reaktion med den tilsvarende mængde deproteiniseret-UTP-mærket RNA og de samme Ioniske betingelser som ekstraktet fremstillet og inkuberet ved 25 liter C i 15 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 75 liter destilleret H2O, 100 liter 2 liter PK-buffer og 4 liter proteinase K (10 mg/mL), og RNA blev fremstillet som beskrevet i ‘kpcr’ til analyse af RNA-fragmenterne. RNA blev resuspenderet i 25 liter urinstof gel-loading buffer (5 mM EDTA, 10% (v/v) glycerol, 0,05% (vægt/v) Bromphenolblåt og 50% deioniseret formamid) og adskilt på urinstof denaturerende geler efterfulgt af autoradiografi.

kpcr

Total RNA blev ekstraheret fra cellerne og vævene ved hjælp af Trisol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) efterfulgt af DNase i-fordøjelse i henhold til producentens anvisninger. RNA ‘ et blev kvantificeret ved at måle absorbansen ved 260 nm og revers transkriberet. Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved hjælp af Bio-Rad IK5 realtids-PCR-systemet i henhold til producentens anvisninger. Primere anvendt til revers transkription og kpcr blev vist i supplerende Data 7. Dataene blev normaliseret ved hjælp af endogent GAPDH mRNA og U6 snRNA. 2-KRISTCT-metoden blev brugt til at analysere PCR-data.

Strømningscytometri

cellerne blev høstet på de angivne tidspunkter og vasket to gange med PBS/0,5% BSA ved 4 liter C for at blokere Fc-receptorerne. De transducerede CD34 + HPC ‘ er blev farvet med APC-konjugeret anti-CD14 (klon: 61D3) eller anti-CD11b (klon: ICRF44) antistoffer (eBioscience, San Diego, CA). Mus BM-celler blev farvet med et PE-konjugeret anti-CD33-antistof (klon: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Strømningscytometri blev udført på et C6-Strømningscytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Dataene blev analyseret ved hjælp af programmet (Version 7.6, TreeStar, Ashland, or).

Mus og transplantationsassays

alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af Forskningsetikudvalget for Peking Union Medical College. Ti millioner CD34 + HPC ‘ er inficeret med lenti-sh-KSRP, lenti-129 eller lenti-GFP-kontrol blev vasket og resuspenderet i PBS og derefter injiceret i den laterale halevene på 4 uger til 6 uger gamle kvindelige NOD/SCID-modtagermus bestrålet med røntgenstråler i en dosis på 250 cGy. Fire uger efter transplantationen af CD34+ HPC ‘ erne blev musene ofret, og BM og Milter blev opsamlet og behandlet til enkeltcellesuspensioner til de efterfølgende eksperimenter. Resultaterne blev opnået fra 4 mus pr.

vestlig blot

helcellelysater blev underkastet vestlig blot-analyse. Kanin polyklonalt anti-KSRP antistof (6994-1; 1: 1000) og anti-RUNKS1 antistof (ab35962; 1:1000) det fra Epitomics (Abcam, Cambridge, MA) eller et GAPDH antistof (60004-1-ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) blev anvendt som de primære antistoffer og inkuberet i 1 liter TBST indeholdende 5% BSA i 2 timer ved stuetemperatur (RT) med kontinuerlig omrystning. Efter vask med 1 liter TBST i 15 minutter ved RT blev membranerne inkuberet med en HRP-konjugeret ged anti-kanin sekundær Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) i 1 time ved RT. efter et sidste vasketrin med 1 liter TBST i 15 minutter ved RT blev de immunreaktive bånd visualiseret ved forbedret kemiluminescens (ECL) (Amersham Biosciences, Piscatve, NJ) ved angivet eksponeringstid (“eksponeringstid for vestlig plet”). Alle ikke-beskårne vestlige blots findes i supplerende Fig. 11.

in vivo-behandlingsassay i sebrafisk

embryoner blev opsamlet fra en laboratorie avlskoloni af Tuebingen-sebrafisk, der var anbragt ved 28 liter C på en 14:10 h lys/mørk cyklus og opdrættet under standardbetingelser (China Sebrafish Resource Center). Ksrp mRNA og GFP-Pri-129 vægt-eller ksrp-bindingssted mutante mRNA ‘ er blev syntetiseret in vitro fra tilsvarende lineariserede plasmider under anvendelse af mMESSAGE mMACHINE Kit (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). KSRP-mRNA ‘et og GFP-Pri-129_vt-mRNA’ et (eller GFP-Pri-129_mut-mRNA ‘ et) blev samtidig injiceret i et-celletrinssebrafiskembryoner. Embryonerne blev iscenesat ved 28 kr. C i henhold til h.p.F. og morfologiske kriterier52. Billeder af embryoner iscenesat ved 4 h. p.F.og 24 h. p.F. blev erhvervet ved hjælp af en Ceiss SteReo Lumar V12 (Carl Ceiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland).

in vivo-behandlingsassay i 293tn-celler

293tn-celler blev dyrket i 6-brøndsplader i 24 timer, indtil de nåede hen 70-80% sammenløb. Cellerne blev co-transfekteret med egfp fusion Pri-129 eller mutante Pri-129 plasmider, pcDNA4-RFP og pCMV-KSRP plasmidet ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fireogtyve timer senere blev cellerne analyseret under et fluorescensmikroskop ved 400 liter forstørrelse (Carl Eiss Microscopy GmbH). RNA blev også ekstraheret til en kpcr-analyse af behandlingseffektivitet ved at detektere den primære miR-129 vs. den modne mir-129. Fluorescensintensiteten blev kvantificeret ved hjælp af Image-Pro Plus 6.0-programmer (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ nærhedsligationsassay

in situ PLAs blev udført efter manufactures protokol (Sigma-Aldrich). Kanin anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) og kanin anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) blev parret med anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canada; 1:50) eller normal kanin IgG polyklonalt antistof (12-370, Merck Millipore, Tyskland; 1:50) for de primære antistoffer. Anti-KSRP og normal kanin IgG polyklonalt antistof som en negativ kontrol. Før blokering blev 293t-eller HeLa-celler dyrket på kammerede dias (Sigma), fastgjort i 10% formaldehyd, permeabiliseret med 0,25% Triton HS-100-PBS. Lsm780 konfokal immunofluorescensmikroskopi efterfulgt af dekonvolution med Huygens Essential version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Holland, http://svi.nl). PLA-prikker pr. celle blev kvantificeret med BlobFinder V3.2 billedanalyseprogram (Uppsala Universitet, Stockholm, Sverige), og det gennemsnitlige antal PLA-prikker pr. celle blev beregnet ved at analysere mindst 100 celler.

Bioinformatikanalyse

alle parrede slutlæsninger blev trimmet til adaptersekvens ved hjælp af Trim i massevis (Version 0.3.7) med parametre “-25.kvartal-strenghed 5-længde 50-parret-phred33” og filtreret til sekvens af lav kvalitet. Hg38-referencegenomet (GRCh38) og genanmærkningsfilen (GTF-format)blev hentet fra gencode Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53. TopHat54, 55 (Version 2.1.0) blev brugt til at justere de filtrerede aflæsninger til hg38 genomreferencegenomet med standardindstillinger, og FPKMs (fragmenter pr.Kilobase transkriptom pr. million læser) blev opnået ved hjælp af manchetknapper 54 (Version 2.2.1) med standardparametre. Ekspressionsniveauer blev estimeret ved hjælp af funktionstællinger56 (Version 1.5.0) med parametre “-T 7 –primær”, gen-niveau råtællinger blev afledt af summen af de tilsvarende værdier for alle isoformer af et gen.

Ebsekv-HMM18 blev anvendt til at analysere forskellene i genekspression mellem henholdsvis tre stadier af monocyt-og granulocytdifferentiering. Der er to hovedtrin for at få differentielt udtrykte (de) gener:

1. 1)

   påvisning af de-gener, der viste signifikant ændring mellem to trin under en målfalsk opdagelsesrate (FDR) på 0,05.

2. 2)

   klyngedannelse af gener i ekspressionsstier med den maksimale posterior Sandsynlighed (PP) større end 0,5.

“op-ned”) på dag 5, 10 og 15 af monocyt (eller granulocyt) differentiering (supplerende Data 1). Ekspressionsstien” op-ned ” repræsenterer, at et gen blev opreguleret på dag 10 sammenlignet med dag 5, mens det blev nedreguleret på dag 15 sammenlignet med dag 10. Monotont forøgede (“Up-Up”) eller nedsatte (“ned-ned”) gener under monocyt (eller granulocyt) differentiering blev valgt til yderligere analyse.

Genekspressionsniveauer blev estimeret ved hjælp af FPKM, og alle generne med FPKM-kursen 1 som de udtrykte gener blev anvendt til yderligere analyse. Oplysninger om RBP blev hentet fra rbpdb19 og ATtRACT20 databaser. Vi udviklede et r-script (supplerende Data 8) til klassificerede de-gener med “op-op” eller “ned-ned” ekspressionsstier (supplerende Data 2, 3) i forskellige ekspressionsmønstre.

varmekortene blev tegnet ved hjælp af funktionen ‘pheatmap’ af R-pakker ‘pheatmap’, og Venndiagrammet blev tegnet ved hjælp af funktionen ‘tegning.parvis.venn ‘af R pakke ‘VennDiagram’. K-betyder clustering blev udført med output af funktionen ‘pheatmap’, og klynger blev opnået med funktionen’ cutree ‘ ved hjælp af R.

Plasmidelektrotransfektioner

vi brugte Neon Transfektionssystemet i henhold til producentens anvisninger (Invitrogen, Carlsbad, CA) for at forbedre plasmid transfektionseffektiviteten i THP-1-celler til RNA-sekv-analysen. Celler blev elektrotransmitteret med plasmider (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP eller pSIH-H1-sh-KSRP). Elektroporationsparametrene for 1 liter 107 THP-1 eller NB4 celler var en 1350-v puls, 10-ms pulsbredde og 4 pulser ved hjælp af en 10-liter spids. Otteogfyrre timer senere blev elektrooverføringseffektiviteten detekteret ved vestlig blotting eller kpcr.

Redningsanalyser

for at validere, at KSRP fremmer pri-mir-129-behandling til regulering af myeloid afstamningsdifferentiering, blev THP-1-celler transficeret med pEGFP-KSRP ved hjælp af Lipofectamine 2000, og 24 timer senere blev cellerne transficeret med en mir-129-hæmmer. NB4-celler blev transficeret med si-KSRP ved en endelig koncentration på 100 nM under anvendelse af DharmFECT1, og 24 timer senere blev cellerne transficeret med en mir-129-efterligning. For at validere, at mir-129 mål RUNKS1 at regulere myeloid afstamning differentiering, THP-1 og NB4 celler blev transficeret med si-RUNKS1 og en mir-129 inhibitor eller deres kontrol af Neon transfektionssystem. Celler blev derefter stimuleret med PMA eller atra i yderligere 48 timer, før de blev høstet til efterfølgende analyser. CD14-ekspression i THP-1-celler, der gennemgår monocytisk differentiering og CD11b-ekspression i NB4-celler, der gennemgår granulocytisk differentiering, blev analyseret ved strømningscytometri.

eksponeringstid for vestlig plet

det meste af den vestlige plet blev udviklet af Tanon 5200 automatic digital gel image analysis system (Tanon, Shanghai, Kina), og eksponeringstiden for GAPDH er 150-350 ms. i Fig. 2A, eksponeringstid for prøver langs monocytisk differentiering er 20 s for KSRP; eksponeringstid for prøver langs granulocytisk differentiering er 200 ms for KSRP. I Fig. 2B, eksponeringstid er 20 s for KSRP. I Fig. 4F-h, eksponeringstiden er 60 s for KSRP. I Fig. 5B, eksponeringstiden er 60 s for Drosha, DGCR8 og KSRP. I Fig. 6J, k, eksponeringstid er 90 s for RUNK1. I Fig. 7G, eksponeringstiden er 90 s for KSRP og KSRP. I Fig. 7H, eksponeringstiden er 30 s for RUNK1 og KSRP. I Supplerende Fig. 2A, eksponeringstid for prøver langs monocytisk differentiering er 3 s for KSRP; eksponeringstid for prøver langs granulocytisk differentiering er 300 ms for KSRP. I Supplerende Fig. 4A, e, f, eksponeringstid er 60 s for KSRP. I Supplerende Fig. 7m, eksponeringstiden er 10 s og 90 s for RUNK1 i THP-1 og NB4, respevtively. I Supplerende Fig. 8A, eksponeringstid er 60 s for RUNK1.

for andre billeder, der viser resultatet af manuel eksponering (Fig. 2d, i; supplerende Fig. 7N), eksponeringstid for GAPDH er estimeret 1 s. i Fig. 2D, eksponeringstid er 30 s for KSRP i PMA-inducerede prøver og 10 s for KSRP i atra-inducerede prøver. I Fig. 2i, eksponeringstid er 60 s for KSRP. I Supplerende Fig. 7N, eksponeringstid er 90 s for RUNK1.

isolering af monocytter og neutrofiler fra perifert blod

informeret samtykke blev opnået i overensstemmelse med det institutionelle Gennemgangsudvalg for det kinesiske akademi for Medicinsk Videnskab. Humane monocytter og neutrofiler blev isoleret fra det perifere blod fra raske donorer i 3% dekstran og blev isoleret ved percoll-gradientcentrifugering efterfulgt af oprensning af CD14-mikroperler (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Tyskland) eller EasySep Human neutrofile Berigelsessæt (#19257, Stemcell Technologies, Canada). Efter sorteret efter CD14 mikroperler blev de opnåede CD14-positive celler belagt i T-25 kolber og dyrket i 4-6 timer ved 37 liter C, indtil de klæbende monocytter blev opsamlet ved skrabning.

statistisk analyse

for alle undersøgelser er n pr.gruppe som angivet i figurlegenden. Alle data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 5.0-programmet (GraphPad, Inc. I USA) og præsenteret som et middel ± SD. Forskelle mellem eksperimentelle grupper og kontrolgrupper blev analyseret ved hjælp af den to-halede studerendes t-test. Statistisk signifikans blev accepteret ved P < 0,05. Ingen statistiske metoder blev anvendt til at forudbestemme stikprøvestørrelsen. Alle eksperimenter blev udført med mindst tre biologiske replikater. Vi valgte de relevante tests i henhold til datafordelingerne. Eksperimenterne blev ikke randomiseret, og vi udelukkede ikke nogen prøver. Efterforskerne blev ikke blindet for tildeling under eksperimenter og resultatvurdering.

datatilgængelighed

miRNA-og pri-mir-RNA-sekventeringsdata er blevet deponeret i GEO-databasen under tiltrædelseskode GSE87318. Dataene for mRNA-sekventering er også blevet deponeret i GEO-databasen under tiltrædelseskode GSE87088. Kildedata for Fig. 1C-e er leveret som supplerende Data 1-4. Kildedata for Fig. 2b, c er fremlagt som supplerende Data 5, 6. Alle andre data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter på anmodning.