KSRP specifica monocitica e granulocitica differenziazione attraverso la regolazione miR-129 biogenesi e RUNX1 espressione

Monocitica e granulocitica differenziazione di linee di cellule

umano monocitica linea di cellule THP-1, e la promielocitica linea cellulare CB4 e HL-60 sono stati acquistati da ATCC (Manassas, stati UNITI) e mantenuto in RPMI1640 supplementato con 10% di siero bovino fetale (Gibco, Carlsbad, CA). Le cellule sono state sottoposte a screening mediante PCR per l’autenticazione e mediante test di immunofluorescenza per la libertà dalla contaminazione da micoplasma. La differenziazione monocitica delle cellule THP-1 e HL-60 è stata indotta trattando le cellule con PMA 50 nM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania) per 0, 24, 48 e 72 h. La differenziazione granulocitica delle cellule NB4 e HL-60 è stata indotta trattando le cellule con ATRA 1 µM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania). Nessuna linea cellulare utilizzata in questo studio è stata trovata nel database di linee cellulari comunemente erroneamente identificate che è mantenuto da ICLAC e NCBI Biosample. Le linee cellulari sono state testate per la contaminazione da micoplasma ma non sono state ri-autenticate.

L’ordinamento CD34+ HPC

Il sangue del cordone ombelicale umano (UCB) è stato ottenuto da normali consegne a termine presso l’Ospedale dell’Unione di Pechino e il midollo osseo (BM) da donatori normali è stato ottenuto dal 307 ° ospedale dell’Esercito di liberazione popolare cinese. È stato ottenuto il consenso informato e l’approvazione del Comitato etico di ricerca. Le frazioni di cellule mononucleate (MNC) sono state isolate da UCB e BM utilizzando un gradiente di densità Percoll (d = 1.077; Amersham Biotech, Germania). Le cellule CD34 + sono state arricchite da MNC utilizzando una selezione immunomagnetica positiva (CD34 + MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Germania).

Monocitica differenziazione di Hpc

arricchito CD34+ cellule progenitrici ematopoietiche (Hpc) sono state coltivate in alto glucosio IMDM integrato con il 30% di siero bovino fetale (Hyclone, Logan, Utah, usa), 1% BSA, 100 µM 2-MI, 2 ng/mL ricombinante umano, IL-3, 100 ng/mL ricombinante umano SCF, 50 ng/mL ricombinante umana M-CSF, 100 ng/mL ricombinante umano FLT3, 1 ng/mL ricombinante umano, IL-6, 60 mg/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina per indurre la differenziazione dei monociti. Le citochine sono state acquistate da Peprotech (Rocky Hill, NJ). Le cellule sono state raccolte ogni 3-5 giorni. Per le analisi morfologiche, le cellule sono state spalmate su vetrini, fissate in metanolo 10 min, macchiate con May-Grünwald / Giemsa e analizzate a ingrandimento 400x al microscopio (Nikon TE2000, Giappone) dotato di una fotocamera digitale.

Granulocitica differenziazione di Hpc

arricchito CD34+ cellule progenitrici ematopoietiche (Hpc) sono state coltivate in alto glucosio IMDM integrato con il 30% di siero bovino fetale (Hyclone, Logan, Utah, usa), 1% BSA, 100 µM 2-MI, 2 ng/mL ricombinante umano, IL-3, 100 ng/mL ricombinante umano SCF, 20 ng/mL umana ricombinante G-CSF, 10 ng/mL ricombinante umano, IL-6, 60 mg/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina per indurre la differenziazione granulocitaria. Le citochine sono state acquistate da Peprotech (Rocky Hill, NJ). Le cellule sono state raccolte ogni 3-5 giorni. Le analisi morfologiche sono state eseguite allo stesso modo della differenziazione monocitica.

Oligonucleotidi e costrutti

miR-129 imita (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), miRNA (inibitori anti-129) e il controllo negativo molecole (NC) sono stati ottenuti da Dharmacon (Austin, TX) e le cellule sono state trasfettate con una concentrazione finale di questi costrutti di 100 nM utilizzando DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNA (specificamente per KSRP e RUNX1) e siRNA di controllo (Si-Con) sono stati sintetizzati da Dharmacon e le cellule sono state trasfettate con siRNA 100 nM utilizzando DharmFECT1.

Per la sovraespressione di KSRP, il clone umano di KSRP (NM_003685.2) cDNA ORF (pEGFP-KSRP) è stato acquistato da Addgene (Addgene, MA). Per KSRP knockdown, KSRP sh-RNA è stato clonato nel vettore pSIH-H1 a valle del promotore H1 (lenti-sh_KSRP) o direttamente acquistato sotto forma di costrutti lentivirali (TL311984, Origene, Rockville, MD). Per la sovraespressione di pri-129-1, un costrutto wild-type di 700 bp è stato clonato nel vettore pCMV6 (129_WT) o nel plasmide pMIRNA1 (lenti-129). I siti mutanti di legame KSRP in pri-129-1 (129_MUT1, 129_MUT2, 129_MUT3, 129_MUT4 e 129_MUTF) sono stati creati anche nei vettori pCMV6. Per MIR-129 knockdown, miRZIP-129 e miRZIP-control sono stati acquistati da System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Per la sovraespressione RUNX1, RUNX1 ORF è stato clonato nel vettore pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

Per il test del gene reporter di bersagli MIR-129, la sequenza complementare inversa a miR-129 è stata inserita nel pMIR-reporter a valle del gene lucciola luciferasi per generare il costrutto reporter positivo (129_positive). Il 3 ‘ – UTR dell’mRNA umano RUNX1 è stato amplificato e clonato nello stesso pMIR-reporter a valle del gene lucciola luciferasi per formare il reporter wild-type (RUNX1_WT). Le mutazioni dei siti di legame miR-129 nel 3’-UTR delle sequenze umane di mRNA RUNX1 sono state create utilizzando il kit di mutagenesi diretto al sito QuickChange (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 e RUNX1_Mut3). Le cellule sono state trasfettate con questi costrutti usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) per cellule 293TN o Lipofectamine LTX&PLUS per cellule THP-1 e cellule NB4, secondo i protocolli del produttore. Tutti i primer sono elencati in Dati supplementari 7.

Produzione Lentivirus

Il kit di imballaggio lentivirus appropriato è stato acquistato da System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) e utilizzato secondo le linee guida del produttore. Le particelle virali raccolte (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 e lenti-GFP) sono state aggiunte alle cellule CD34+ HPC, THP-1 o NB4 e le cellule sono state poi lavate con IMDM dopo 24 ore e placcate per esperimenti successivi.

miRNA deep sequencing

Le cellule THP-1 sono state elettroporate con pEGFP-KSRP o pEGFP utilizzando il sistema di trasfezione al neon e quindi ordinate per FACS per raccogliere le cellule GFP-positive. Piccoli RNA sono stati isolati dall’RNA totale con il mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX), secondo le istruzioni del produttore. Piccole librerie di RNA e miRNA sequenziamento sono stati eseguiti da Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, Cina) utilizzando un Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA). I dati di sequenziamento sono stati filtrati, i profili di espressione sono stati costruiti e le letture del dimero dell’adattatore sono state separate dalle letture miRNA che erano già state identificate in miRbase 17.0. I dati RNA-seq sono stati analizzati da Genergy Bio e un elenco di miRNA la cui espressione è stata aumentata dopo la sovraespressione di KSRP è mostrato nei dati supplementari 5, 6.

Sequenziamento profondo di RNA arricchito con poli(A)

L’RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente Trizolo (Invitrogen, Carlsbad, CA), secondo le istruzioni del produttore, per preparare la libreria di RNA arricchito con poli(A)-seq. Le librerie di RNA arricchite di poli (A) e deep RNA-seq sono state adattate a Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) e sono state eseguite da Genergy Bio. Un elenco completo dei MIRNA primari la cui espressione è diminuita dopo la sovraespressione di KSRP è elencato nei dati supplementari 5, 6.

Analisi della GARA

Per identificare l’intera lunghezza della GARA primaria-129-1, 5′ e 3′, sono state eseguite reazioni sull’RNA totale delle cellule THP-1 utilizzando il kit da gara completo da 5’e il kit da GARA completo da 3′(TaKaRa, Dalian, Cina) secondo il manuale del produttore. I primer utilizzati per l’esperimento RACE sono elencati in Dati supplementari 7.

Luciferase reporter assay

Per le analisi meccanicistiche funzionali di miR-129-1, abbiamo previsto diversi obiettivi miR-129-1 utilizzando il software bioinformatico Targetscan e Miranda e convalidato i candidati con il test luciferase reporter. Le cellule 293TN sono state co-trasfettate con 0,4 µg del costrutto reporter, 0,015 µg del vettore di controllo pRL-TK e 5 pmol del mimico MIR-129 o del mimico di controllo negativo. Dopo 48 h, le cellule sono state raccolte e dosate con il kit di analisi Dual Luciferase (Promega, Madison, WI), secondo le istruzioni del produttore. Tutti i test di trasfezione sono stati eseguiti in triplice copia.

Test di trattamento in vitro

Il test di trattamento è stato eseguito utilizzando una cellula HeLa NE da 10 mg/ml. Per l’esaurimento di KSRP, dieci microlitri dell’anticorpo di KSRP sono stati aggiunti a 1 mg di NE della cellula di HeLa ed un anticorpo di IgG è stato aggiunto come controllo. Dopo un’incubazione di 30 minuti a 4 °C, il complesso proteico e anticorpale KSRP è stato immunoprecipitato con perle proteiche A (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Il surnatante è l’estratto nucleare impoverito da KSRP (ΔKSRP-NE). I 700-nt, marcati con isotopi wild-type pri-129-1 (129_WT) e pri-129-1 contenenti tutti e quattro i mutanti del sito di legame KSRP (129_Mut) sono stati preparati mediante trascrizione standard in vitro con T7 RNA polimerasi in presenza di-UTP utilizzando i costrutti 129_WT e 129_Mut. 129_WT e 129_Mut sono stati incubati con HeLa cell NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) per 30 min a 37 °C in presenza di KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), e 4 pmol (4×)). Le miscele di reazione sono state sottoposte a fenolo: estrazione del cloroformio, precipitazione e elettroforesi su gel denaturante, seguita da autoradiografia.

È stato eseguito il test di elaborazione del salvataggio. In breve, 20 µL di ΔKSRP-NE sono stati incubati con 1 pmol di MIR-129 primario marcato con UTP e diverse quantità di KSRP (0,5 µg) per tempi diversi (15, 40 e 60 min) a 37 °C. Le miscele di reazione sono state trattate con proteinasi K per 30 min a 37 °C e quindi sottoposte a fenolo:estrazione del cloroformio, precipitazione e denaturazione elettroforesi su gel, seguita da autoradiografia. Tutti i gel di RNA non tagliati possono essere trovati in Fig supplementare. 12.

Northern blot

Un totale di campioni di RNA da 40 µg sono stati caricati ed eseguiti su gel denaturanti (urea) al 12% di poliacrilammide e poi trasferiti su membrane Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Ibridazione è stata eseguita con digoxigenin (DIG)-marcato pri-miR-129, γ-32P – marcato pre-o maturo mir-129-5p sonda durante la notte a 42 °C. U6 snRNA e rRNA sono stati serviti come controlli di carico per miRNA pre-, maturo o primario, rispettivamente. Il livello di espressione è stato misurato dalla normalizzazione all’espressione di U6 snRNA o rRNA. Le sequenze della sonda oligonucleotide sono elencate nei dati supplementari 7. L’espressione di miRNA è stata quantificata dal software Image J. Tutti i Northern blot non tagliati possono essere trovati in Fig supplementare. 12.

Test di immunoprecipitazione dell’RNA

Quantità uguali di cellule THP-1 o NB4 sono state raccolte in PBS ghiacciato. Successivamente, i pellet cellulari sono stati risospesi in 1 mL di tampone di lisi B (50 mm Tris, pH 7.4, 150 mm NaCl, 0,05% Igepal, 1 mm PMSF, 1 mM aprotinina, 1 mM leupeptin e 2 mm vanadyl ribonucleoside complessi (VRC)) e sonicazione delicata. Dopo che i lisati sono stati centrifugati a 12.000 giri / min per 15 min, i supernatanti sono stati preclarati con Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) in tampone di lisi B con 10 µg di lievito tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania). Quindi, i lisati precleared sono stati utilizzati per RIP con un anticorpo anti-KSRP (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) o un coniglio isotipo IgG (12-370, Merck Millipore, Germania; 1:500) come controllo per 4 h a 4 °C. Le perle sono state lavate tre volte con tampone di lisi B, con l’ultimo lavaggio contenente un ulteriore desossicolato di sodio allo 0,5%, seguito dall’estrazione con tampone C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-mercaptoetanolo e 20% glicerolo) a temperatura ambiente per 10 min. L’RNA immunoprecipitato è stato estratto con Trizolo e fenolo-cloroformio. Per la RT-PCR, ciascun campione di RNA è stato trattato con DNasi I (Ambion, DNA-free TM kit). Quindi, quantità uguali sono state trascritte inverse con il kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità (Invitrogen, Carlsbad, CA). L’arricchimento della piega degli RNA da parte di KSRP è stato misurato mediante qPCR e elettroforesi su gel di agarosio. I primer utilizzati per gli esperimenti RIP-PCR sono elencati nei dati supplementari 7.

Immunoprecipitazione dei complessi proteina-RNA

Maltosio-binding protein (MBP)-affinity purification è stata utilizzata per identificare le proteine associate ai miRNA primari. Il plasmide di espressione MS2-MBP è stato un dono del Dr. Lingling Chen (Accademia Cinese delle Scienze) e MS2-MBP è stato espresso e purificato da E. coli utilizzando un protocollo dello Steize lab (Yale University). Tre siti di legame alle proteine MS2 coat (5 ‘- cgtacaccatcagggtacggtagctagcccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3’) sono stati inseriti a valle della sequenza genica pri-129-1 o delle sequenze mutanti del sito di legame pri-129-1 KSRP. Le cellule 293TN sono state trasfettate con costrutti contenenti MS2 per ottenere proteine associate ai MIRNA primari e 10 milioni di cellule sono state utilizzate per ciascun test di immunoprecipitazione. Le cellule sono state raccolte 48 h post-trasfezione e sottoposte ad analisi pull-down di RNA. In breve, le cellule sono state risciacquate due volte con PBS ghiacciato prima della raccolta in 10 ml di PBS ghiacciato raschiando. Quindi i pellet cellulari sono stati risospesi in tampone IP da 1 mL (50 mm Tris, pH 7,4, 150 mm NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, cocktail inibitore della proteinasi) e sottoposti a 2 cicli di sonicazione delicata e centrifugati per ottenere estratti cellulari. Il surnatante è stato prima incubato con MS2-MBP per 1 ora e poi perle di resina amilosio (NEB) per un altro 1 ora a 4 C. Le perle sono state lavate cinque volte con tampone IP con roccia delicata e un ultimo lavaggio con tampone IP fornito con NaCl aggiuntivo di 150 mm. I componenti delle proteine infine sono stati eluiti dalla perline con IP buffer integrato con 12 mM di Maltosio, e sono stati controllati da WB con i seguenti anticorpi primari: rabbit anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), di coniglio anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), di coniglio anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) e mouse anti-GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech; di 1:1.000.000).

Rnasi H protezione dosaggio

standard Rnasi H protezione reazione è stata eseguita in un volume totale di 25 µL contenente 1 pmol di KSRP di proteine, 1 pmol di -UTP-etichetta di RNA, 20 µg/mL di DNA oligonucleotidi, 12 mM HEPES (pH 8.0), 60 mM di MgCl2, 1 mM DTT, 20 U di RNasin (40 U/µL, Promega, Madison, WI), e 1 U di E. coli Rnasi H. Per il controllo, una reazione con la corrispondente quantità di deproteinizzato -UTP-etichetta RNA e le stesse condizioni ioniche come l’estratto è stato preparato e incubate a 25 °C per 15 min. La reazione è stata terminata aggiungendo 75 µL di H2O distillato, 100 µL di tampone 2 × PK e 4 µL di proteinasi K (10 mg/mL) e l’RNA è stato preparato come descritto nel ‘qPCR’ per analizzare i frammenti di RNA. L’RNA è stato risospeso in 25 µL di tampone di caricamento del gel di urea (5 mm EDTA, 10% (v/v) di glicerolo, 0,05% (p/v) di xilene cianolo FF, 0,05% (p/v) di bromofenolo blu e 50% di formammide deionizzata) e separato su gel di denaturazione dell’urea, seguito da autoradiografia.

qPCR

L’RNA totale è stato estratto dalle cellule e dai tessuti utilizzando il reagente Trizolo (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguito dalla digestione della DNasi I, secondo le istruzioni del produttore. L’RNA è stato quantificato misurando l’assorbanza a 260 nm e trascritto in senso inverso. La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) è stata eseguita utilizzando il sistema di PCR in tempo reale Bio-Rad IQ5 secondo le istruzioni del produttore. Primer utilizzati per la trascrizione inversa e qPCR sono stati mostrati in Dati supplementari 7. I dati sono stati normalizzati utilizzando mRNA GAPDH endogeno e snRNA U6. Il metodo 2-ΔΔCT è stato utilizzato per analizzare i dati della PCR.

Citometria a flusso

Le cellule sono state raccolte nei punti temporali indicati e lavate due volte con PBS/0,5% BSA a 4 °C per bloccare i recettori Fc. I CD34 + HPC trasdotti sono stati colorati con anticorpi anti-CD14 (clone: 61D3) o anti-CD11b (clone: ICRF44) coniugati con APC (eBioscience, San Diego, CA). Le cellule di topo BM sono state macchiate con un anticorpo anti-CD33 coniugato con PE (clone: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). La citometria a flusso è stata eseguita su un citometro a flusso C6 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). I dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (versione 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

Topi e test di trapianto

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con l’approvazione del Comitato etico di ricerca del Peking Union Medical College. Dieci milioni di HPC CD34 + infettati con controllo lenti-sh-KSRP, lenti-129 o lenti-GFP sono stati lavati e risospesi in PBS e quindi iniettati nella vena laterale della coda di topi riceventi NOD/SCID da 4 settimane a 6 settimane irradiati con raggi X alla dose di 250 cGy. Quattro settimane dopo il trapianto degli HPC CD34+, i topi sono stati sacrificati e il BM e lo spleen sono stati raccolti e trasformati in sospensioni monocellulari per i successivi esperimenti. I risultati sono stati ottenuti da 4 topi per gruppo.

Western blot

I lisati a cellule intere sono stati sottoposti all’analisi Western blot. Coniglio policlonale anti-KSRP anticorpo (6994-1; 1:1000) e anti-RUNX1 anticorpo (ab35962; 1:1000) che da Epitomics (Abcam, Cambridge, MA), o un anticorpo GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) sono stati utilizzati come anticorpi primari e incubati in 1× TBST contenente il 5% di BSA per 2 ore a temperatura ambiente (RT) con agitazione continua. Dopo lavaggi con 1× TBST per 15 min a RT, le membrane sono state incubate con un HRP-coniugato di capra anti-coniglio secondaria Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) per 1 h a RT. Dopo un ultimo lavaggio con 1× TBST per 15 min a RT, le bande immunoreattive sono stati visualizzati da una maggiore chemiluminescenza (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a tempi di esposizione indicati (“tempo di Esposizione per Western blot”). Tutte le western blots non tagliate possono essere trovate in Fig supplementare. 11.

Analisi di elaborazione in vivo in zebrafish

Gli embrioni sono stati raccolti da una colonia di allevamento di zebrafish di Tuebingen ospitata a 28 °C in un ciclo chiaro/scuro di 14:10 h e allevati in condizioni standard (China Zebrafish Resource Center). mRNA KSRP e GFP-Pri-129 WT o MRNA mutanti del sito di legame KSRP sono stati sintetizzati in vitro da plasmidi linearizzati corrispondenti utilizzando il kit mMESSAGE mMACHINE (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). L’mRNA KSRP e l’mRNA GFP-Pri-129_WT (o mRNA GFP-Pri-129_Mut) sono stati co-iniettati in embrioni di zebrafish a una cellula. Gli embrioni sono stati messi in scena a 28 °C secondo i criteri h.p.f. e morfologici52. Immagini di embrioni messi in scena a 4 h.p.f. e 24 h.p.f. sono state acquisite utilizzando uno Zeiss Stereo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopia GmbH, Jena, Germania).

Analisi di elaborazione in vivo in cellule 293TN

Le cellule 293TN sono state coltivate in piastre a 6 pozzetti per 24 ore fino a raggiungere la confluenza ≈70-80%. Le cellule sono state co-trasfettate con la fusione EGFP Pri-129_WT o plasmidi mutanti Pri-129, pcDNA4-RFP e il plasmide pCMV-KSRP utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ventiquattro ore dopo, le cellule sono state analizzate con un microscopio a fluorescenza Zeiss a ingrandimento 400× (Carl Zeiss Microscopia GmbH). L’RNA è stato anche estratto per un’analisi qPCR dell’efficienza di elaborazione rilevando il MIR-129 primario rispetto al MIR-129 maturo. L’intensità della fluorescenza è stata quantificata utilizzando il software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

In situ proximity ligation assay

In situ PLAs sono stati fatti seguendo il protocollo di fabbricazione (Sigma-Aldrich). Coniglio anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:50) e coniglio anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) è stato accoppiato con anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canada; 1:50), o normale coniglio IgG policlonale anticorpo (12-370, Merck Millipore, Germania; 1: 50) per gli anticorpi primari. Anti-KSRP e anticorpo policlonale normale di IgG del coniglio come controllo negativo. Prima del blocco, le cellule 293T o HeLa sono state coltivate su vetrini camerati (Sigma), fissati al 10% di formaldeide, permeabilizzati con 0,25% Triton X-100-PBS. Le cellule sono state analizzate mediante microscopia confocale a immunofluorescenza Zeiss LSM780 (Zeiss, Germania) seguita da deconvoluzione con Huygens Essential versione 16.05 (Scientific Volume Imaging, Paesi Bassi, http://svi.nl). I punti PLA per cella sono stati quantificati con il software di analisi delle immagini BlobFinder V3.2 (Università di Uppsala, Stoccolma, Svezia) e il numero medio di punti PLA per cella è stato calcolato analizzando un minimo di 100 celle.

Analisi bioinformatica

Tutte le letture accoppiate sono state tagliate per la sequenza dell’adattatore usando Trim Galore (Versione 0.3.7) con i parametri “-q 25 str stringency 5 length length 50 paired paired ph phred33” e filtrate per la sequenza di bassa qualità. Il genoma di riferimento hg38 (GRCh38) e il file di annotazione genica (formato GTF)sono stati scaricati da GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53. TopHat54, 55 (Versione 2.1.0) è stato utilizzato per allineare le letture filtrate al genoma hg38 genoma di riferimento con le impostazioni predefinite, e FPKMs (Frammenti per Kilobase trascrittoma per milione di letture) sono stati ottenuti utilizzando Cufflinks54 (Versione 2.2.1) con i parametri di default. I livelli di espressione sono stati stimati utilizzando i conteggi delle Feature56 (versione 1.5.0) con i parametri “-T 7 primary primary”, i conteggi grezzi a livello genico sono stati derivati dalla somma dei valori corrispondenti per tutte le isoforme di un gene.

EBSeq-HMM18 sono stati utilizzati per analizzare le differenze nell’espressione genica tra tre stadi di differenziazione dei monociti e dei granulociti, rispettivamente. Ci sono due passaggi principali per EBSeq-HMM per ottenere geni espressi in modo differenziale (DE) :

1. 1)

   Rilevamento di geni DE che hanno mostrato cambiamenti significativi tra due stadi qualsiasi sotto un tasso di falsa scoperta target (FDR) di 0,05.

2. 2)

   Clustering DE geni in percorsi di espressione con la massima probabilità posteriore (PP) maggiore di 0,5.

Utilizzando EBSeq-HMM, abbiamo ottenuto i geni DE e i relativi percorsi di espressione corrispondenti (cioè “Up-Down”) ai giorni 5, 10 e 15 della differenziazione dei monociti (o granulociti) (Dati supplementari 1). Il percorso di espressione “Up-Down” rappresenta che un gene è stato up-regolato al giorno 10 rispetto al giorno 5 mentre downregulated al giorno 15 rispetto al giorno 10. I geni monotonicamente aumentati (“Up-Up”) o diminuiti (“Down-Down”), durante la differenziazione dei monociti (o dei granulociti) sono stati scelti per ulteriori analisi.

I livelli di espressione genica sono stati stimati utilizzando l’FPKM e tutti i geni con l’FPKM ≥ 1 come geni espressi sono stati utilizzati per ulteriori analisi. Le informazioni di RBP sono state scaricate dai database RBPDB19 e ATtRACT20. Abbiamo sviluppato uno script R (Dati supplementari 8) per classificare i geni DE con percorsi di espressione “Up-Up” o “Down-Down” (Dati supplementari 2, 3) in diversi modelli di espressione.

Le mappe di calore sono state disegnate usando la funzione ‘pheatmap’ dei pacchetti R ‘pheatmap’ e il VennDiagram sono stati disegnati usando la funzione ‘draw.a coppie.venn ‘di R pacchetto ‘VennDiagram’. K-means clustering è stata eseguita con l’output della funzione ‘pheatmap’ e i cluster sono stati ottenuti con la funzione ‘cutree’ utilizzando R.

Plasmide electrotransfections

Abbiamo usato il Neon Transfezione di Sistema secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen, Carlsbad, CA) per migliorare il plasmide efficienza di trasfezione in cellule THP-1 per l’RNA-seq analisi. Le cellule sono state elettrotrasfettate con plasmidi (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP o pSIH-H1-sh-KSRP). I parametri di elettroporazione per celle 1 × 107 THP-1 o NB4 erano un impulso 1350-V, larghezza di impulso 10-ms e 4 impulsi utilizzando una punta 10-µL. Quarantotto ore dopo, l’efficienza dell’elettrotrasfezione è stata rilevata da Western blotting o qPCR.

Saggi di salvataggio

Per convalidare che KSRP promuove l’elaborazione pri-miR-129 per regolare la differenziazione del lignaggio mieloide, le cellule THP-1 sono state trasfettate con pEGFP-KSRP usando Lipofectamine 2000 e 24 h più tardi, le cellule sono state trasfettate con un inibitore miR-129. Le cellule NB4 sono state trasfettate con si-KSRP ad una concentrazione finale di 100 nM usando DharmFECT1, e 24 h più tardi le cellule sono state trasfettate con una mimica miR-129. Per convalidare che MIR-129 target RUNX1 per regolare la differenziazione del lignaggio mieloide, le cellule THP-1 e NB4 sono state trasfettate con si-RUNX1 e un inibitore miR-129 o i loro controlli dal sistema di trasfezione al neon. Le cellule sono state quindi stimolate con PMA o ATRA per ulteriori 48 ore prima di essere raccolte per le analisi successive. L’espressione di CD14 nelle cellule THP-1 sottoposte a differenziazione monocitica e l’espressione di CD11b nelle cellule NB4 sottoposte a differenziazione granulocitica sono state analizzate mediante citometria a flusso.

Tempo di esposizione per Western blot

La maggior parte del Western blot è stato sviluppato da Tanon 5200 automatic digital gel image analysis system (Tanon, Shanghai, Cina), e il tempo di esposizione di GAPDH è 150-350 ms. In Fig. 2a, il tempo di esposizione dei campioni lungo la differenziazione monocitica è di 20 s per KSRP; il tempo di esposizione dei campioni lungo la differenziazione granulocitica è di 200 ms per KSRP. In Fig. 2b, tempo di esposizione è 20 s per KSRP. In Fig. 4f-h, tempo di esposizione è 60 s per KSRP. In Fig. 5b, tempo di esposizione è 60 s per Drosha, DGCR8 e KSRP. In Fig. 6j, k, tempo di esposizione è 90 s per RUNX1. In Fig. 7g, tempo di esposizione è di 90 s per RUNX1 e KSRP. In Fig. 7h, il tempo di esposizione è 30 s per RUNX1 e KSRP. In Fig. supplementare. 2a, il tempo di esposizione dei campioni lungo la differenziazione monocitica è di 3 s per KSRP; il tempo di esposizione dei campioni lungo la differenziazione granulocitica è di 300 ms per KSRP. In Fig. supplementare. 4a, e, f, tempo di esposizione è di 60 s per KSRP. In Fig. supplementare. 7 m, tempo di esposizione è 10 s e 90 s per RUNX1 in THP-1 e NB4, respevtively. In Fig. supplementare. 8a, il tempo di esposizione è 60 s per RUNX1.

Per altre immagini che mostrano il risultato dell’esposizione manuale (Fig. 2d, i; Fig. supplementare 7n), il tempo di esposizione per GAPDH è stimato per 1 s.In Fig. 2d, il tempo di esposizione è 30 s per KSRP nei campioni indotti da PMA e 10 s per KSRP nei campioni indotti da ATRA. In Fig. 2i, tempo di esposizione è 60 s per KSRP. In Fig. supplementare. 7n, tempo di esposizione è di 90 s per RUNX1.

Isolamento di monociti e neutrofili dal sangue periferico

Il consenso informato è stato ottenuto in conformità con l’Institutional Review Board dell’Accademia cinese delle scienze mediche. Monociti e neutrofili umani sono stati isolati dal sangue periferico di donatori sani in 3% di destrano e sono stati isolati mediante centrifugazione a gradiente percoll seguita da purificazione da microsfere CD14 (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Germania) o EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit (#19257, Stemcell Technologies, Canada). Dopo essere stati ordinati per microsfere CD14, le cellule positive CD14 ottenute sono state placcate in flaconi T-25 e coltivate per 4-6 h a 37 °C fino a quando i monociti aderenti sono stati raccolti raschiando.

Analisi statistica

Per tutti gli studi, n per gruppo è come indicato nella legenda figura. Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., USA) e presentato come means ± SD. Le differenze tra gruppi sperimentali e gruppi di controllo sono state analizzate utilizzando il t-test dello studente a due code. La significatività statistica è stata accettata a P < 0,05. Non sono stati utilizzati metodi statistici per predeterminare la dimensione del campione. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con almeno tre repliche biologiche. Abbiamo scelto i test appropriati in base alle distribuzioni di dati. Gli esperimenti non sono stati randomizzati e non abbiamo escluso alcun campione. Gli investigatori non sono stati accecati all’allocazione durante gli esperimenti e la valutazione dei risultati.

Disponibilità dei dati

I dati di sequenziamento miRNA e pri-miR-RNA sono stati depositati nel database GEO con il codice di adesione GSE87318. Anche i dati per il sequenziamento dell’mRNA sono stati depositati nel database GEO con il codice di adesione GSE87088. Dati di origine per Fig. 1c-e sono stati forniti come dati supplementari 1-4. Dati di origine per Fig. 2b, c sono stati forniti come dati supplementari 5, 6. Tutti gli altri dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.