KSRP specificerar monocytisk och granulocytisk differentiering genom reglering av miR-129-biogenes och RUNX1-uttryck

monocytisk och granulocytisk differentiering av cellinjer

den humana monocytiska cellinjen THP-1 och den promyelocytiska cellinjen NB4 och HL-60 var köpt från ATCC (Manassas, USA) och underhålls i rpmi1640 kompletterat med 10% fetalt bovint Serum (gibco, Carlsbad, CA). Celler screenades genom PCR för autentisering och genom immunofluorescenstest för frihet från mykoplasmakontaminering. Monocytisk differentiering av THP-1-och HL-60-celler inducerades genom att behandla cellerna med 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland) för 0, 24, 48 och 72 h. granulocytisk differentiering av NB4-och HL-60-celler inducerades genom att behandla cellerna med 1 kg ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Inga cellinjer som användes i denna studie hittades i databasen med vanligt felidentifierade cellinjer som upprätthålls av ICLAC och NCBI Biosample. Cellinjer testades för mykoplasmakontaminering men har inte verifierats på nytt.

sortering CD34 + HPC

humant navelsträngsblod (UCB) erhölls från normala heltids leveranser vid Peking Union Hospital, och benmärg (BM) från normala givare erhölls från 307th Hospital of Chinese People ’ s Liberation Army. Informerat samtycke och godkännande av forskningsetiska Utskottet erhölls. Mononukleära cellfraktioner (MNC) isolerades från UCB och BM med användning av en perkolldensitetsgradient (d = 1.077; Amersham Biotech, Tyskland). CD34 + – celler berikades från MNC med positivt immunomagnetiskt urval (CD34+ MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Tyskland).

monocytisk differentiering av HPC

de berikade CD34+ hematopoietiska progenitorcellerna (HPC) odlades i IMDM med hög glukos kompletterat med 30% fetalt bovint serum (Hyklon, Logan, Utah), 1% BSA, 100 kcal 2-ME, 2 ng/mL rekombinant humant IL-3, 100 ng/mL rekombinant humant SCF, 50 ng/mL rekombinant humant M-3 CSF, 100 ng/ml rekombinant humant FLT3, 1 ng/ml rekombinant humant IL-6, 60 mg/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin för att inducera monocytdifferentiering. Cytokiner köptes från Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celler skördades var 3-5 dagar. För morfologiska analyser smordes celler på glasskivor, fixerades i metanol 10 min, färgades med maj-gr Askornwald/Giemsa och analyserades vid 400x förstoring under ett mikroskop (Nikon TE2000, Japan) utrustad med en digitalkamera.

granulocytisk differentiering av HPC

de berikade CD34+ hematopoietiska progenitorcellerna (HPC) odlades i IMDM med hög glukos kompletterat med 30% fetalt bovint serum (Hyklon, Logan, Utah), 1% BSA, 100 kcal 2-ME, 2 ng/mL rekombinant humant IL-3, 100 ng/mL rekombinant humant SCF, 20 ng/mL rekombinant humant g-3 CSF, 10 ng/ml rekombinant humant IL-6, 60 mg/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin för att inducera granulocytdifferentiering. Cytokiner köptes från Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celler skördades var 3-5 dagar. Morfologiska analyser utfördes på samma sätt som monocytisk differentiering.

oligonukleotider och konstruktioner

miR-129 mimics (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), miRNA-hämmare (anti-129) och negativa kontrollmolekyler (NC) erhölls från Dharmacon (Austin, TX) och celler transfekterades med en slutlig koncentration av dessa konstruktioner av 100 nM med användning av DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNAs (specifikt för KSRP och RUNX1) och kontroll siRNAs (Si-Con) syntetiserades av Dharmacon och celler transfekterades med 100 nM siRNAs med DharmFECT1.

för KSRP-överuttryck köptes den mänskliga KSRP (NM_003685.2) cDNA ORF-klonen (pEGFP-KSRP) från Addgene (Addgene, MA). För ksrp knockdown klonades KSRP sh-RNA i psih-H1-vektorn nedströms om H1-promotorn (lenti-sh_KSRP) eller köptes direkt i form av lentivirala konstruktioner (TL311984, Origene, Rockville, MD). För pri-129-1 överuttryck klonades en 700-BP vildtypskonstruktion i pCMV6-vektorn (129_wt) eller in i pmirna1-plasmid (lenti-129). De mutanta ksrp-bindningsställena i pri-129-1 (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 och 129_mutf) skapades också i pCMV6-vektorer. För mir-129 knockdown köptes miRZIP-129 och miRZIP-control från System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). För RUNX1-överuttryck klonades RUNX1 ORF i pmirna1-vektorn (Lenti-RUNX1).

för reportergenanalysen av miR-129-mål infördes den omvända komplementära sekvensen till miR-129 i pMIR-reportern nedströms firefly luciferase-genen för att generera den positiva reporterkonstruktionen (129_positive). 3 ’ – UTR av human RUNX1 mRNA förstärktes och klonades till samma pMIR-reporter nedströms firefly luciferase-genen för att bilda wild-type reporter (RUNX1_WT). Mutationer av Mir-129-bindningsställena i 3’ – UTR av humana RUNX1 mRNA-sekvenser skapades med hjälp av QuickChange Site-directed Mutagenesis kit (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 och RUNX1_Mut3). Celler transfekterades med dessa konstruktioner med antingen Lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) för 293tn-celler eller Lipofektamin LTX&PLUS för THP-1-celler och NB4-celler, enligt tillverkarens protokoll. Alla primers listas i kompletterande Data 7.

lentivirus production

lämplig förpackningssats för lentivirus köptes från System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) och användes enligt tillverkarens riktlinjer. De skördade virala partiklarna (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 och lenti-GFP) tillsattes till CD34+ HPC, THP-1 eller NB4-celler, och cellerna tvättades sedan med IMDM efter 24 timmar och pläterades för efterföljande experiment.

miRNA deep sequencing

THP-1-celler elektroporerades med pEGFP-KSRP eller pEGFP med hjälp av Neontransfektionssystemet och sorterades sedan efter FACS för att samla in de GFP-positiva cellerna. Små RNA isolerades från det totala RNA med mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX), enligt tillverkarens instruktioner. Små RNA-bibliotek och miRNA-sekvensering utfördes av Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, Kina) med hjälp av en Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA). Sekvenseringsdata filtrerades, uttrycksprofilerna konstruerades och adapterdimerläsningarna separerades från miRNA-läsningarna som redan hade identifierats i miRbase 17.0. RNA-seq-data analyserades med Genergy Bio och en lista över Mirna vars uttryck ökades vid KSRP-överuttryck visas i kompletterande Data 5, 6.

Poly(a)-berikat RNA djup sekvensering

totalt RNA extraherades med användning av Trizolreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), enligt tillverkarens instruktioner, för att förbereda det poly(a)-berikade RNA-Seq-biblioteket. Poly (a)-berikade RNA-bibliotek och djup RNA-seq anpassades till Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) och utfördes av Genergy Bio. En fullständig lista över primära Mirna vars uttryck minskade vid KSRP-överuttryck listas i kompletterande Data 5, 6.

RASANALYS

för att identifiera Full längd av primär-129-1, 5′ och 3′ ras utfördes reaktioner på totalt RNA av THP-1-celler med användning av 5′-Full RACE Kit och 3′-Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Kina) enligt tillverkarens manual. Primrarna som används för TÄVLINGSEXPERIMENTET listas i tilläggsdata 7.

Luciferase reporter assay

för funktionella mekanistiska analyser av miR-129-1 förutspådde vi flera mir-129-1-mål med hjälp av bioinformatikprogramvaran Targetscan och Miranda och validerade kandidaterna med luciferase reporter assay. 293tn-celler var samtransfekterade med 0.4 occurg av reporterkonstruktionen, 0.015 occurg av PRL-TK-kontrollvektorn och 5 pmol av miR-129 mimic eller negativ kontrollmimic. Efter 48 h skördades cellerna och analyserades med Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI), enligt tillverkarens instruktioner. Alla transfektionsanalyser utfördes i tre exemplar.

in vitro-bearbetningsanalys

bearbetningsanalysen utfördes med användning av en 10 mg/mL HeLa-cell NE. För utarmning av KSRP tillsattes tio mikroliter KSRP-antikropp till 1 mg HeLa-cell NE och en IgG-antikropp tillsattes som kontroll. Efter en 30-min inkubation vid 4 C i C immunoprecipiterades ksrp-proteinet och antikroppskomplexet med protein A-pärlor (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatanten är det KSRP-utarmade kärnkraftextraktet (AUKSIKSRP-NE). 700-nt, isotopmärkt vildtyp pri-129-1 (129_wt) och pri-129-1 innehållande alla fyra ksrp-bindningsstället mutanter (129_mut) framställdes genom standard in vitro transkription med T7 RNA-polymeras i närvaro av-UTP med användning av 129_wt-och 129_mut-konstruktionerna. 129_WT och 129_mut inkuberades med HeLa cell NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) för 30 min vid 37 CCB i närvaro av KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), och 4 pmol (4 msk)). Reaktionsblandningarna utsattes för fenol: kloroformextraktion, utfällning och denaturering av gelelektrofores, följt av autoradiografi.

räddningsbehandlingsanalysen utfördes. I korthet inkuberades 20 occull av OCCULKSRP-NE med 1 pmol av-UTP-märkt primär miR – 129 och olika mängder KSRP (0,5 occulg) för olika tider (15, 40 och 60 min) vid 37 occulg C. reaktionsblandningarna behandlades med proteinas K i 30 min vid 37 occulg C och utsattes sedan för fenol:kloroform extraktion, utfällning och denaturering av gelelektrofores, följt av autoradiografi. Alla okroppade RNA-geler finns i kompletterande Fig. 12.

Northern blot

en summa av 40-occurg RNA-prover laddades och kördes på denaturering (urea) 12% polyakrylamidgeler och överfördes sedan till Hybond membran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybridisering utfördes med digoxigenin (DIG)-märkt pri-miR-129, 22P-märkt för-eller mogen mir – 129-5P-sond över natten vid 42 C. U6 snRNA och rRNA serverades som lastningskontroller för pre -, mogna respektive primära miRNA. Uttrycksnivå mättes genom normalisering till uttrycket av U6 snRNA eller rRNA. Oligonukleotidsondsekvenserna listas i kompletterande Data 7. Uttrycket av miRNA kvantifierades av bild J-programvara. Alla uncropped Northern blot finns i kompletterande Fig. 12.

RNA-immunutfällningsanalys

lika stora mängder THP-1-eller NB4-celler skördades i iskall PBS. Därefter resuspenderades cellpelletsna i 1 mL lysbuffert B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0, 05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotinin, 1 mM leupeptin och 2 mM vanadylribonukleosidkomplex (VRC)) och mild ultraljudsbehandling. Efter att lysaterna centrifugerades vid 12 000 rpm i 15 min, precleared supernatanterna med Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) i lysbuffert B med 10 accug jäst tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Sedan användes de precleared lysaterna för RIP med antingen en anti-KSRP-antikropp (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) eller en kaninisotyp IGG (12-370, Merck Millipore, Tyskland; 1:500) som kontroll för 4 h vid 4 msk C. Pärlorna tvättades tre gånger med lysbuffert B, med den sista tvätten innehållande ytterligare 0,5% natriumdeoxikolat, följt av extraktion med Buffert C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% Xiaomi-merkaptoetanol och 20% glycerol) vid rumstemperatur under 10 min. Det immunoprecipiterade RNA extraherades med Trizol och fenolkloroform. För RT-PCR behandlades varje RNA-prov med DNase I (Ambion, DNA-free TM kit). Därefter transkriberades lika stora mängder med cDNA-omvänd Transkriptionssats med hög kapacitet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vikberikningen av rna med KSRP mättes med qPCR och agarosgelelektrofores. Primrarna som används för RIP-PCR-experimenten listas i kompletterande Data 7.

Immunutfällning av protein-RNA-komplexen

maltosbindande protein (MBP)-affinitetsrening användes för att identifiera proteiner associerade med primära Mirna. MS2-MBP-uttrycket plasmid var en gåva från Dr.Lingling Chen (Chinese Academy of Sciences) och MS2-MBP uttrycktes och renades från E. coli med hjälp av ett protokoll från Steize lab (Yale University). Tre MS2-beläggningsproteinbindningsställen (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagcccatggcgtacaccagggtactagatctcgtacaccatcagggtacg-3′) infördes nedströms om pri-129-1-gensekvensen eller pri-129-1 KSRP-bindningsstället mutantsekvenser. 293tn-celler transfekterades med MS2-innehållande konstruktioner för att erhålla proteiner associerade med primära Mirna, och 10 miljoner celler användes för varje immunutfällningsanalys. Cellerna skördades 48 timmar efter transfektion och utsattes för RNA-neddragningsanalys. I korthet sköljdes celler två gånger med iskall PBS före skörd i 10 mL iskall PBS genom skrapning. Därefter cell pellets resuspended i 1 mL IP buffert (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, proteinashämmare cocktail), och utsattes för 2 rundor av mild ultraljudsbehandling och centrifugerades för att erhålla cell extrakt. Supernatanten inkuberades först med MS2-MBP i 1 timme och sedan amyloshartspärlor (NEB) i ytterligare 1 timme vid 4 C. pärlorna tvättades fem gånger med IP-buffert med mild sten och en sista tvätt med IP-buffert försedd med ytterligare 150 mM NaCl. Proteinkomponenterna eluerades slutligen från pärlor med IP-buffert kompletterad med 12 mM maltos och kontrollerades av WB med följande primära antikroppar: kanin anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), kanin anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), kanin anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) och mus Anti-GAPDH (60004-1-ig, proteintech; 1:1.000.000).

RNase h-skyddsanalys

en standard RNase H-skyddsreaktion utfördes i en total volym av 25 oktyl innehållande 1 pmol KSRP-protein, 1 pmol av-UTP-märkt RNA, 20 oktyl/mL DNA-oligonukleotider, 12 mm HEPES (pH 8.0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U RNasin (40 U/oktyl, Promega, Madison, WI) och 1 U av E. coli rnas H. För kontrollen framställdes en reaktion med motsvarande mängd avproteiniserat-UTP-märkt RNA och samma Joniska betingelser som extraktet och inkuberades vid 25 kcal C under 15 min. Reaktionen avslutades genom tillsats av 75 oc destillerad H2o, 100 oc 2 oc PK-buffert och 4 oc proteinas K (10 mg/mL), och RNA framställdes såsom beskrivits i ’qPCR’ för att analysera RNA-fragmenten. RNA resuspenderades i 25 oC-l av ureagelbelastningsbuffert (5 mm EDTA, 10% (v/v) glycerol, 0,05% (w/v) Xylencyanol FF, 0,05% (w/v) Bromofenolblått och 50% Avjoniserad formamid) och separerades på ureadenatureringsgeler, följt av autoradiografi.

qPCR

totalt RNA extraherades från cellerna och vävnaderna med användning av Trizolreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) följt av DNase I-digestion, enligt tillverkarens instruktioner. RNA kvantifierades genom att mäta absorbansen vid 260 nm och omvänt transkriberas. Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) utfördes med användning av Bio-Rad IQ5 realtids-PCR-system enligt tillverkarens instruktioner. Primers som används för omvänd transkription och qPCR visades i kompletterande Data 7. Data normaliserades med användning av endogen GAPDH mRNA och U6 snRNA. 2-OCCSCT-metoden användes för att analysera PCR-data.

flödescytometri

cellerna skördades vid de angivna tidspunkterna och tvättades två gånger med PBS/0,5% BSA vid 4 kcal C för att blockera Fc-receptorerna. De transducerade CD34 + HPC: erna färgades med APC-konjugerade Anti-CD14 (klon: 61d3) eller anti-CD11b (klon: ICRF44) antikroppar (eBioscience, San Diego, CA). Mus BM-celler färgades med en PE-konjugerad Anti-CD33-antikropp (klon: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Flödescytometri utfördes på en C6-flödescytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Data analyserades med hjälp av FlowJo-programvara (Version 7.6, TreeStar, Ashland eller).

Möss och transplantationsanalyser

alla djurförsök utfördes med godkännande av Research Ethics Committee of Peking Union Medical College. Tio miljoner CD34 + HPC infekterade med lenti-sh-KSRP, lenti-129 eller lenti-GFP kontroll tvättades och resuspenderades i PBS och injicerades sedan i den laterala svansvenen på 4 veckor till 6 veckor gamla kvinnliga NOD/SCID-mottagarmöss bestrålade med röntgenstrålar i en dos av 250 cGy. Fyra veckor efter transplantationen av CD34+ HPC: erna offrades mössen och BM och mjälten samlades in och bearbetades till encelliga suspensioner för de efterföljande experimenten. Resultaten erhölls från 4 möss per grupp.

Western blot

helcellslysater utsattes för Western blot-analys. Kanin polyklonal anti-KSRP antikropp (6994-1; 1: 1000) och anti-RUNX1 antikropp (ab35962; 1: 1000) som från Epitomics (Abcam, Cambridge, MA), eller en GAPDH antikropp (60004-1 – Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100,000) användes som de primära antikropparna och inkuberades i 1 msk tbst innehållande 5% BSA i 2 timmar vid rumstemperatur (RT) med kontinuerlig skakning. Efter tvättar med 1 kg TBST för 15 min vid RT inkuberades membranen med en HRP-konjugerad get anti-kanin sekundär Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) för 1 h vid RT. efter ett sista tvättsteg med 1 kg TBST för 15 min vid RT visualiserades de immunoreaktiva banden genom förbättrad kemiluminescens (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) vid angiven exponeringstid (”exponeringstid för Western blot”). Alla uncropped western blots finns i kompletterande Fig. 11.

in vivo-bearbetningsanalys i zebrafisk

embryon samlades in från en laboratorieavelskoloni av Tuebingen-zebrafisk inrymd vid 28 kcal C på en 14:10 h ljus/mörk cykel och höjdes under standardförhållanden (China Zebrafish Resource Center). KSRP mRNA och GFP-Pri-129 WT eller ksrp-bindande plats mutant mRNA syntetiserades in vitro från motsvarande linjäriserade plasmider med användning av Mmessage mMACHINE Kit (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). KSRP mRNA och GFP-Pri-129_wt mRNA (eller GFP-Pri-129_mut mRNA) injicerades samtidigt i zebrafiskembryon med en cell. Embryona var iscensatt vid 28 CCB enligt HPF och morfologiska kriterier52. Bilder av embryon iscensatta vid 4 h. p.F.och 24 h. p.f. förvärvades med hjälp av en Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland).

in vivo-bearbetningsanalys i 293tn-celler

293tn-celler odlades i 6-brunnsplattor under 24 timmar tills de nådde 70-80% sammanflöde av 293tn-celler. Cellerna samtransfekterades med EGFP-fusionen Pri-129_wt eller mutanta pri-129-plasmider, pcDNA4-RFP och pCMV-KSRP-plasmid med Lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tjugofyra timmar senare analyserades cellerna under ett Zeiss-fluorescensmikroskop vid förstoring av 400 kg (Carl Zeiss Microscopy GmbH). RNA extraherades också för en qPCR-analys av bearbetningseffektivitet genom att detektera den primära miR-129 VS den mogna miR-129. Fluorescensintensiteten kvantifierades med hjälp av Image-Pro Plus 6.0-programvara (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ närhet ligering analys

in situ PLAs gjordes efter tillverkning protokoll (Sigma-Aldrich). Kanin anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) och kanin anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) parades med anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Kanada; 1:50) eller normal kanin IGG polyklonal antikropp (12-370, Merck Millipore, Tyskland; 1:50) för de primära antikropparna. Anti-KSRP och normal kanin IGG polyklonal antikropp som en negativ kontroll. Före blockering odlades 293t-eller HeLa-celler på kammarglas (Sigma), fixerade i 10% formaldehyd, permeabiliserad med 0,25% Triton X-100-PBS. Celler analyserades av Zeiss LSM780 konfokal immunofluorescensmikroskopi (Zeiss, Tyskland) följt av deconvolution med Huygens Essential version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Nederländerna, http://svi.nl). PLA-punkter per cell kvantifierades med BlobFinder V3.2 bildanalysprogramvara (Uppsala universitet, Stockholm, Sverige) och det genomsnittliga antalet PLA-punkter per cell beräknades genom att analysera minst 100 celler.

bioinformatikanalys

alla parade slutläsningar trimmades för adaptersekvens med Trim Galore (Version 0.3.7) med parametrar ”-q 25 –stringency 5 –length 50 –paired –phred33” och filtrerades för lågkvalitativ sekvens. Hg38-referensgenomet (GRCh38) och genanteckningsfilen (GTF-format)hämtades från GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53. TopHat54, 55 (Version 2.1.0) användes för att anpassa de filtrerade avläsningarna till hg38-genomreferensgenomet med standardinställningar och FPKMs (fragment per Kilobase-transkriptom per miljon läser) erhölls med användning av Manschettknappar54 (Version 2.2.1) med standardparametrar. Expressionsnivåer uppskattades med hjälp av feature Counts56 (Version 1.5.0) med parametrar ”-T 7-primär”, gennivå råa räkningar härleddes från summan av motsvarande värden för alla isoformer av en gen.

EBSeq-HMM18 användes för att analysera skillnaderna i genuttryck mellan tre stadier av monocyt-respektive granulocytdifferentiering. Det finns två huvudsteg för EBSeq-HMM för att få differentiellt uttryckta (de) gener:

1. 1)

   detektera de-gener som visade signifikant förändring mellan två steg under en mål falsk upptäcktshastighet (FDR) på 0,05.

2. 2)

   kluster de gener i uttrycksvägar med maximal posterior Sannolikhet (PP) större än 0,5.

genom att använda EBSeq-HMM erhöll vi de gener och dess motsvarande uttrycksvägar (dvs ”upp-ner”) vid Dag 5, 10 och 15 av monocyt (eller granulocyt) differentiering (kompletterande Data 1). Uttrycksvägen” upp-ner ” representerar att en gen uppreglerades vid dag 10 jämfört med DAG 5 medan den nedreglerades vid dag 15 jämfört med dag 10. Monotont ökade (”Up-Up”) eller minskade (”Down-Down”) gener, under monocyt (eller granulocyt) differentiering valdes för vidare analys.

Genuttrycksnivåer uppskattades med hjälp av FPKM, och alla gener med fpkm XXL 1 som de uttryckta generna användes för vidare analys. Information om RBP hämtades från rbpdb19 och ATtRACT20 databaser. Vi utvecklade ett r-skript (kompletterande Data 8) till klassificerade de-gener med ”Up-Up” eller ”Down-Down” – uttrycksvägar (kompletterande Data 2, 3) i olika uttrycksmönster.

värmekartorna ritades med funktionen ’pheatmap’ för R-paket ’pheatmap’ och Venndiagrammet ritades med funktionen ’draw.parvis.venn ’av r paketet ’VennDiagram’. K-means clustering utfördes med utgången av funktionen ’pheatmap’ och kluster erhölls med funktionen ’cutree’ med användning av R.

Plasmidelektrotransfektioner

vi använde Neontransfektionssystemet enligt tillverkarens instruktioner (Invitrogen, Carlsbad, CA) för att förbättra plasmidtransfektionseffektiviteten i THP-1-celler för RNA-seq-analysen. Celler elektrotransfekterades med plasmider (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP eller pSIH-H1-sh-KSRP). Elektroporationsparametrarna för 1 107 107 THP-1 eller NB4-celler var en 1350 – v puls, 10-ms pulsbredd och 4 pulser med användning av en 10-occylspets. Fyrtioåtta timmar senare detekterades elektrotransfektionseffektiviteten genom Western blotting eller qPCR.

Räddningsanalyser

för att validera att KSRP främjar pri-miR-129-bearbetning för att reglera myeloid härstamningsdifferentiering transfekterades THP-1-celler med pEGFP-KSRP med Lipofektamin 2000 och 24 timmar senare transfekterades cellerna med en mir-129-hämmare. NB4-celler transfekterades med si-KSRP vid en slutlig koncentration av 100 nM med användning av DharmFECT1, och 24 timmar senare transfekterades cellerna med en mir-129-mimik. För att validera det miR-129 mål RUNX1 för att reglera myeloid härstamning differentiering, THP-1 och NB4 celler transfekterades med si-RUNX1 och en miR-129-hämmare eller deras kontroller av Neontransfektionssystemet. Celler stimulerades sedan med PMA eller ATRA för ytterligare 48 timmar innan de skördades för efterföljande analyser. CD14-uttryck i THP-1-celler som genomgår monocytisk differentiering och CD11b-uttryck i NB4-celler som genomgår granulocytisk differentiering analyserades med flödescytometri.

exponeringstid för Western blot

det mesta av Western blot utvecklades av Tanon 5200 automatic digital gel image analysis system (Tanon, Shanghai, Kina) och exponeringstiden för GAPDH är 150-350 ms. i Fig. 2A, exponeringstid för prover längs monocytisk differentiering är 20 s för KSRP; exponeringstid för prover längs granulocytisk differentiering är 200 ms för KSRP. I Fig. 2B, exponeringstiden är 20 s för KSRP. I Fig. 4F-h, exponeringstiden är 60 s för KSRP. I Fig. 5B, exponeringstiden är 60 s för Drosha, DGCR8 och KSRP. I Fig. 6J, k, exponeringstiden är 90 s för RUNX1. I Fig. 7g, exponeringstiden är 90 s för RUNX1 och KSRP. I Fig. 7H, exponeringstiden är 30 s för RUNX1 och KSRP. I Kompletterande Fig. 2A, exponeringstid för prover längs monocytisk differentiering är 3 s för KSRP; exponeringstid för prover längs granulocytisk differentiering är 300 ms för KSRP. I Kompletterande Fig. 4A, e, f, exponeringstiden är 60 s för KSRP. I Kompletterande Fig. 7m, exponeringstiden är 10 s och 90 s för RUNX1 i THP-1 och NB4, respektivt. I Kompletterande Fig. 8A, exponeringstiden är 60 s för RUNX1.

för andra bilder som visar resultatet av manuell exponering (Fig. 2D, i; kompletterande Fig. 7N), exponeringstiden för GAPDH är för beräknad 1 s. i Fig. 2D, exponeringstiden är 30 s för KSRP i PMA-inducerade prover och 10 s för KSRP i ATRA-inducerade prover. I Fig. 2i, exponeringstiden är 60 s för KSRP. I Kompletterande Fig. 7N, exponeringstiden är 90 s för RUNX1.

isolering av monocyter och neutrofiler från perifert blod

informerat samtycke erhölls i enlighet med Institutional Review Board of the Chinese Academy of Medical Science. Humana monocyter och neutrofiler isolerades från perifert blod från friska givare i 3% dextran och isolerades genom percoll-gradientcentrifugering följt av rening med CD14-mikrokulor (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Tyskland) eller EasySep Human neutrofil anrikning Kit (#19257, Stemcell Technologies, Kanada). Efter sortering av CD14-mikrokulor pläterades de erhållna CD14-positiva cellerna i T-25-kolvar och odlades i 4-6 h vid 37 cgbg tills de vidhäftande monocyterna uppsamlades genom skrapning.

statistisk analys

för alla studier är n per grupp som anges i figurförklaringen. Alla data analyserades med hjälp av GraphPad Prism 5.0-programvara (GraphPad Software, Inc., USA) och presenteras som medel för SD. Skillnader mellan experimentella grupper och kontrollgrupper analyserades med hjälp av den två-tailed Studentens t-test. Statistisk signifikans accepterades vid P < 0,05. Inga statistiska metoder användes för att förutbestämma provstorleken. Alla experiment utfördes med minst tre biologiska replikat. Vi valde lämpliga tester enligt datafördelningarna. Experimenten randomiserades inte och vi utesluter inte några prover. Utredarna var inte blinda för tilldelning under experiment och resultatbedömning.

datatillgänglighet

miRNA-och pri-mir-RNA-sekvenseringsdata har deponerats i GEO-databasen under anslutningskoden GSE87318. Uppgifterna för mRNA-sekvensering har också deponerats i GEO-databasen under anslutningskod GSE87088. Källdata för Fig. 1C-e har tillhandahållits som tilläggsdata 1-4. Källdata för Fig. 2b, c har tillhandahållits som kompletterande uppgifter 5, 6. Alla andra data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.