KSRP specifică diferențierea monocitară și granulocitară prin reglarea biogenezei miR-129 și a expresiei RUNX1

diferențierea monocitară și granulocitară a liniilor celulare

linia celulară monocitară umană THP-1, iar linia celulară promielocitară NB4 și HL-60 au fost achiziționate ATCC (Manassas, SUA) și menținut în rpmi1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Gibco, Carlsbad, CA). Celulele au fost analizate prin PCR pentru autentificare și prin teste de imunofluorescență pentru eliberarea de contaminarea cu micoplasme. Diferențierea monocitară a celulelor THP-1 și HL-60 a fost indusă prin tratarea celulelor cu PMA de 50 nM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania) pentru 0, 24, 48 și 72 h. diferențierea granulocitară a celulelor NB4 și HL-60 a fost indusă prin tratarea celulelor cu ATRA de 1 hectom (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania). Nu s-au găsit linii celulare utilizate în acest studiu în baza de date a liniilor celulare frecvent identificate greșit, care este menținută de ICLAC și NCBI Biosample. Liniile celulare au fost testate pentru contaminarea cu mycoplasma, dar nu au fost Re-autentificate.

sortarea CD34+ HPCs

sângele din cordonul ombilical uman (UCB) a fost obținut din livrările normale la termen la Spitalul Uniunii din Beijing, iar măduva osoasă (BM) de la donatorii normali a fost obținută de la cel de-al 307-lea spital al Armatei Populare Chineze de eliberare. A fost obținut consimțământul informat și aprobarea Comitetului de etică a cercetării. Fracțiile de celule mononucleare (MNC) au fost izolate din UCB și BM folosind un gradient de densitate Percoll (d = 1.077; Amersham Biotech, Germania). Celulele CD34 + au fost îmbogățite din MNC utilizând selecția imunomagnetică pozitivă (CD34+ Multisort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Germania).

diferențierea monocitară a HPC

celulele progenitoare hematopoietice CD34+ îmbogățite (HPC) au fost cultivate în imdm cu glucoză mare suplimentat cu 30% ser fetal bovin (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 mmc2-ME, 2 ng/mL recombinant uman IL-3, 100 ng/mL recombinant uman SCF, 50 ng/mL recombinant uman m-CSF, 100 ng/ml FLT3 uman recombinant, 1 ng/ml IL-6 uman recombinant, 60 mg/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicină pentru inducerea diferențierii monocitelor. Citokinele au fost achiziționate de la Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celulele au fost recoltate la fiecare 3-5 zile. Pentru analize morfologice, celulele au fost imprastiate pe lamele de sticla, fixate in metanol 10 min, colorate cu may-gr Inquxnwald/Giemsa, si analizate la marire de 400x la microscop (Nikon Te2000, Japonia) echipate cu o camera digitala.

diferențierea granulocitară a HPC

celulele progenitoare hematopoietice CD34+ îmbogățite (HPC) au fost cultivate în imdm ridicat de glucoză suplimentat cu 30% ser fetal bovin (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 mmc2-ME, 2 ng/mL recombinant uman IL-3, 100 ng/mL recombinant uman SCF, 20 ng/mL recombinant uman SCF, 20 ng/mL recombinant uman G-CSF, 10 ng/ml recombinant uman IL-6, 60 mg/ml penicilină și 100 mg / ml streptomicină pentru a induce diferențierea granulocitelor. Citokinele au fost achiziționate de la Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celulele au fost recoltate la fiecare 3-5 zile. Analizele morfologice au fost efectuate în același mod ca diferențierea monocitară.

oligonucleotide și constructe

mimice miR-129 (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), inhibitori miARN (anti-129) și molecule de control negative (NC) au fost obținute de la Dharmacon (Austin, TX) și celulele au fost transfectate cu o concentrație finală a acestor construcții de 100 nM folosind DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNAs (în special pentru KSRP și RUNX1) și sirnas de control (Si-Con) au fost sintetizate de Dharmacon, iar celulele au fost transfectate cu siRNAs de 100 nM folosind DharmFECT1.

pentru supraexprimarea KSRP, clona umană KSRP (NM_003685.2) ADNc ORF (pEGFP-KSRP) a fost achiziționată de la Addgene (Addgene, MA). Pentru KSRP knockdown, KSRP SH-ARN a fost clonat în vectorul pSIH-H1 în aval de promotorul H1 (lenti-sh_KSRP) sau achiziționat direct sub formă de constructe lentivirale (TL311984, Origene, Rockville, MD). Pentru supraexpresia pri-129-1, o construcție de tip sălbatic de 700 bp a fost clonată în vectorul pCMV6 (129_wt) sau în plasmida pMIRNA1 (lenti-129). Siturile mutante de legare KSRP în pri-129-1 (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 și 129_mutf) au fost, de asemenea, create în vectori pCMV6. Pentru mir-129 knockdown, miRZIP-129 și miRZIP-control au fost achiziționate de la System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Pentru supraexprimarea RUNX1, RUNX1 ORF a fost clonat în vectorul pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

pentru testul genei reporter al țintelor miR-129, secvența complementară inversă a miR-129 a fost inserată în pMIR-reporter în aval de gena licurici luciferază pentru a genera construcția pozitivă a reporterului (129_positive). 3 ‘ – UTR al ARNm RUNX1 uman a fost amplificat și clonat în același reporter pMIR în aval de licurici luciferază genă pentru a forma reporter de tip sălbatic (RUNX1_WT). Mutațiile situsurilor de legare miR-129 din 3’-UTR ale secvențelor ARNm RUNX1 umane au fost create folosind kitul de mutageneză direcționat pe site-ul QuickChange (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 și RUNX1_Mut3). Celulele au fost transfectate cu aceste construcții folosind fie Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pentru celulele 293TN, fie LIPOFECTAMINA LTX&PLUS pentru celulele THP-1 și celulele NB4, conform protocoalelor producătorului. Toți primerii sunt enumerați în datele suplimentare 7.

producție Lentivirus

kitul de ambalare lentivirus corespunzător a fost achiziționat de la System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) și utilizat în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Particulele virale recoltate (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 și lenti-GFP) au fost adăugate la celulele CD34+ HPCs, THP-1 sau NB4, iar celulele au fost apoi spălate cu IMDM după 24 de ore și placate pentru experimente ulterioare.

secvențierea profundă a miARN

celulele THP-1 au fost electroporate cu pEGFP-KSRP sau pEGFP folosind sistemul de transfecție Neon și apoi sortate după FACS pentru a colecta celulele GFP pozitive. ARN-urile mici au fost izolate din ARN-ul total cu kitul de izolare mirVana miRNA (Ambion, Austin, TX), conform instrucțiunilor producătorului. Bibliotecile mici de ARN și secvențierea miARN au fost efectuate de Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, China) folosind un Illumina HiSeq2000 (Illumina, SUA). Datele de secvențiere au fost filtrate, profilurile de Expresie au fost construite și citirile dimerului adaptorului au fost separate de citirile miARN care au fost deja identificate în miRbase 17.0. Datele ARN-seq au fost analizate de Genergy Bio și o listă de miARN a căror expresie a fost crescută la supraexprimarea KSRP este prezentată în datele suplimentare 5, 6.

secvențierea profundă a ARN-ului îmbogățit cu Poli(a)

ARN-ul Total a fost extras folosind reactivul Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), conform instrucțiunilor producătorului, pentru a pregăti biblioteca ARN-seq îmbogățită cu Poli(a). Bibliotecile ARN îmbogățite cu Poli(A) și ARN-ul profund-seq au fost adaptate la Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) și au fost efectuate de Genergy Bio. O listă completă a mirn-urilor primare a căror expresie a scăzut la supraexprimarea KSRP este listată în datele suplimentare 5, 6.

analiza cursei

pentru a identifica lungimea completă a cursei primare-129-1, 5′ și 3′, s-au efectuat reacții asupra ARN-ului total al celulelor THP-1 folosind kitul de cursă complet 5’și kitul de cursă complet 3′(TaKaRa, Dalian, China) conform manualului producătorului. Primerii utilizați pentru experimentul de cursă sunt enumerați în datele suplimentare 7.

luciferase reporter assay

pentru analizele mecaniciste funcționale ale miR-129-1, Am prezis mai multe ținte miR-129-1 folosind software-ul bioinformatic Targetscan și Miranda și am validat candidații cu testul luciferase reporter. 293tn celule au fost co-transfectate cu 0,4% din constructul reporter, 0,015% din vectorul de control pRL-TK și 5% din mimica mir-129 sau mimica de control negativ. După 48 de ore, celulele au fost recoltate și testate cu trusa de testare cu dublă luciferază (Promega, Madison, WI), conform instrucțiunilor producătorului. Toate testele de transfecție au fost efectuate în trei exemplare.

test de procesare in vitro

testul de procesare a fost efectuat utilizând o celulă HeLa ne de 10 mg/mL. Pentru epuizarea KSRP, zece microlitri de anticorp KSRP au fost adăugați la 1 mg de hela cell NE și un anticorp IgG a fost adăugat ca martor. După o incubare de 30 de minute la 4 C, complexul de proteine și anticorpi KSRP a fost imunoprecipitat cu margele de proteine a (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatantul este extractul nuclear sărăcit de KSRP (INKTIKSRP-NE). Pri-129-1 de tip sălbatic marcat cu izotopi 700-nt (129_wt) și pri-129-1 conținând toți cei patru mutanți ai sitului de legare KSRP (129_mut) au fost preparați prin transcriere in vitro standard cu ARN polimerază T7 în prezența-UTP folosind construcțiile 129_wt și 129_mut. 129_WT și 129_mut au fost incubate cu celule HeLa NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) timp de 30 de minute la 37 de centi C în prezența KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), și 4 pmol (4 la sută)). Amestecurile de reacție au fost supuse fenolului: extracția cloroformului, precipitarea și denaturarea electroforezei în gel, urmată de autoradiografie.

S-a efectuat testul de procesare a salvării. Pe scurt, 20 de centicli de CENTICRP-NE au fost incubați cu 1 pmol de mir-129 primar marcat cu UTP și diferite cantități de KSRP (0,5 centicrp) pentru perioade diferite (15, 40 și 60 min) la 37 centicrp C. amestecurile de reacție au fost tratate cu proteinază K timp de 30 min la 37 centicrp C și apoi supuse fenolului:extracția cloroformului, precipitarea și denaturarea electroforezei în gel, urmată de autoradiografie. Toate gelurile ARN neacoperite pot fi găsite în Fig suplimentar. 12.

Northern blot

un număr total de probe de ARN de 40-hectogg au fost încărcate și rulate pe geluri de poliacrilamidă denaturate (uree) 12% și apoi transferate pe membrane Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hibridizarea s-a efectuat cu sonda pri-miR-129 marcată cu digoxigenină (DIG), pre-sau matură mir-129 – 5P marcată cu 32P, peste noapte, la 42 C. U6 snRNA și rRNA au fost servite ca controale de încărcare pentru miARN pre-, matur sau Primar, respectiv. Nivelul de expresie a fost măsurat prin normalizare la expresia U6 snRNA sau rRNA. Secvențele sondei oligonucleotidice sunt enumerate în datele suplimentare 7. Expresia miARN a fost cuantificată de Image J software. Toate blotul nordic neacoperit pot fi găsite în Fig suplimentar. 12.

testul de imunoprecipitare ARN

cantități egale de celule THP-1 sau NB4 au fost recoltate în PBS rece ca gheața. Apoi, peletele celulare au fost omogenizate în 1 mL tampon de liză B (50 mm Tris, pH 7.4, 150 mm Naci, 0,05% Igepal, 1 mm PMSF, 1 mm aprotinină, 1 mM leupeptină și 2 mm complexe ribonucleozidice vanadil (VRC)) și Sonicare blândă. După ce lizatele au fost centrifugate la 12.000 rpm Timp de 15 minute, supernatanții au fost pre-curățați cu Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) în tamponul de liză B cu 10 hectolitri de Tarn de drojdie (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania). Apoi, lizatele precleared au fost utilizate pentru RIP fie cu un anticorp anti-KSRP (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500), fie cu un izotip de iepure IgG (12-370, Merck Millipore, Germania; 1:500) ca control pentru 4 h la 4 ct. Bilele au fost spălate de trei ori cu tampon de liză B, ultima spălare conținând un deoxicolat de sodiu suplimentar de 0,5%, urmată de extracție cu tampon C (100 mm Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12%-mercaptoetanol și 20% glicerol) la temperatura camerei timp de 10 min. ARN-ul imunoprecipitat a fost extras cu Trizol și fenol-cloroform. Pentru RT-PCR, fiecare probă de ARN a fost tratată cu Dnază I (Ambion, kit TM fără ADN). Apoi, cantități egale au fost transcrise invers cu kitul de transcriere inversă a ADNc de mare capacitate (Invitrogen, Carlsbad, CA). Îmbogățirea pliată a ARN-urilor prin KSRP a fost măsurată prin electroforeza în gel qPCR și agaroză. Primerii utilizați pentru experimentele RIP-PCR sunt enumerați în datele suplimentare 7.

Imunoprecipitarea complexelor proteine-ARN

purificarea prin afinitate a proteinei de legare a maltozei (MBP) a fost utilizată pentru identificarea proteinelor asociate cu miARN primare. Expresia MS2-MBP plasmida a fost un cadou de la Dr. Lingling Chen (Academia Chineză de științe) și MS2-MBP a fost exprimată și purificată din E. coli folosind un protocol de la Steize lab (Universitatea Yale). Trei straturi MS2 situsuri de legare a proteinelor (5′-cgtacaccatcagggtacggctagcccatggcgtacaccacagggtacgactagtagatctcgtacaccacagggtacg-3′) au fost inserate în aval de secvența genei pri-129-1 sau de secvențele mutante ale sitului de legare pri-129-1 KSRP. Celulele 293TN au fost transfectate cu construcții care conțin MS2 pentru a obține proteine asociate cu miARN primare și 10 milioane de celule au fost utilizate pentru fiecare test de imunoprecipitare. Celulele au fost recoltate 48 h post-transfecție și supuse analizei ARN pull-down. Pe scurt, celulele au fost clătite de două ori cu PBS rece ca gheața înainte de recoltare în 10 mL PBS rece ca gheața prin răzuire. Apoi, peletele celulare au fost resuspendate în 1 ml tampon IP (50 mm Tris, pH 7,4, 150 mm NaCl, 0,05% Igepal, 1 mm PMSF, cocktail inhibitor de proteinază) și supuse la 2 runde de Sonicare blândă și centrifugate pentru a obține extracte celulare. Supernatantul a fost mai întâi incubat cu MS2-MBP timp de 1 oră și apoi margele de rășină de amiloză (NEB) pentru încă 1 oră la 4 C. mărgelele au fost spălate de cinci ori cu tampon IP cu rocă blândă și o ultimă spălare cu tampon IP furnizat cu NaCl suplimentar de 150 mM. Componentele proteice au fost în cele din urmă eluate din margele cu tampon IP suplimentat cu maltoză de 12 mM și au fost verificate de WB cu următorii anticorpi primari: rabbit anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), rabbit anti-Dgcr8 (ab191875, Abcam; 1:1000), rabbit anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) și mouse anti-GAPDH (60004-1-IG, proteintech; 1:1.000.000).

test de protecție a Rnazei H

S-a efectuat o reacție standard de protecție a Rnazei H într-un volum total de 25 ilql conținând 1 pmol de proteină KSRP, 1 pmol de ARN marcat cu UTP, 20 oligonucleotide ADN-ul/ml, HEPES 12 mM (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U de RNasin (40 U/), și 1 u de E. coli RNase H. pentru control, a fost preparată și incubată o reacție cu cantitatea corespunzătoare de ARN marcat cu deproteinizat-UTP și aceleași condiții ionice ca extractul la 25 C C timp de 15 min. Reacția s-a încheiat prin adăugarea a 75 de unqql de H2O distilat, 100 de unqql de 2 unqq buc tampon și 4 unqq de proteinază K (10 mg/mL), iar ARN-ul a fost preparat conform descrierii din ‘qPCR’ pentru a analiza fragmentele de ARN. ARN-ul a fost resuspendat în 25 uqql de tampon de încărcare a gelului de uree (5 mm EDTA, 10% (v/v) glicerol, 0,05% (g/v) xilen Cianol FF, 0,05% (g/v) Bromofenol albastru și 50% formamidă deionizată) și separat pe geluri de denaturare a ureei, urmat de autoradiografie.

qPCR

ARN-ul Total a fost extras din celule și țesuturi folosind reactivul Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) urmat de digestia Dnazei I, conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul a fost cuantificat prin măsurarea absorbanței la 260 nm și transcris invers. PCR cantitativ în timp real (qPCR) a fost realizat folosind sistemul PCR în timp real Bio-Rad IQ5 conform instrucțiunilor producătorului. Primerii utilizați pentru transcrierea inversă și qPCR au fost prezentați în datele suplimentare 7. Datele au fost normalizate folosind ARNm endogen gapdh și snRNA U6. Pentru analiza datelor PCR s-a utilizat Metoda 2-CENTICTCT.

citometrie în flux

celulele au fost recoltate la punctele de timp indicate și spălate de două ori cu PBS/0, 5% BSA la 4 CTC pentru a bloca receptorii Fc. CPC-urile CD34+ transduse au fost colorate cu anticorpi anti-CD14 conjugați APC (clonă: 61d3) sau anti-CD11b (clonă: ICRF44) (eBioscience, San Diego, CA). Celulele BM de șoarece au fost colorate cu un anticorp anti-CD33 conjugat PE (clonă: HIM3-4 eBioscience, ca, SUA). Citometria în flux a fost efectuată pe un Citometru de flux C6 (bd Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Datele au fost analizate folosind software-ul FlowJo (versiunea 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

șoareci și teste de transplant

toate experimentele pe animale au fost efectuate cu aprobarea Comitetului de etică a Cercetării al Colegiului Medical al Uniunii Peking. Zece milioane de HPCs CD34 + infectate cu lenti-SH-KSRP, lenti-129 sau lenti-GFP au fost spălate și resuspendate în PBS și apoi injectate în vena laterală a cozii de la șoareci receptori de la 4 săptămâni la 6 săptămâni, iradiați cu raze X la o doză de 250 cGy. La patru săptămâni după transplantul CD34+ HPCs, șoarecii au fost sacrificați, iar BM și splinele au fost colectate și prelucrate în suspensii cu o singură celulă pentru experimentele ulterioare. Rezultatele au fost obținute de la 4 șoareci pe grup.

Western blot

lizele de celule întregi au fost supuse analizei Western blot. Anticorp anti-KSRP policlonal de iepure (6994-1; 1: 1000) și anticorp anti-RUNX1 (ab35962; 1: 1000) din Epitomics (Abcam, Cambridge, MA) sau un anticorp GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) au fost utilizați ca anticorpi primari și incubați în 1 TBC de la un hectar de 5% BSA timp de 2 ore la temperatura camerei (RT) cu agitare continuă. După spălări cu 1 tbst de la 15 la 15 la RT, membranele au fost incubate cu un AB secundar anti-iepure conjugat cu HRP (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) timp de 1 h la RT. după o etapă finală de spălare cu 1 tbst de la 15 la RT, benzile imunoreactive au fost vizualizate prin chemiluminescență îmbunătățită (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) la timpul de expunere indicat („timpul de expunere pentru Western blot”). Toate bloturile occidentale neacoperite pot fi găsite în Fig suplimentar. 11.

test de procesare in vivo pe pește zebră

embrionii au fost colectați dintr-o colonie de reproducție de laborator de pește zebră Tuebingen adăpostită la 28 C la un ciclu de lumină/întuneric 14:10 h și crescuți în condiții standard (Centrul de resurse pentru pește zebră din China). ARNm KSRP și GFP-Pri-129 WT sau ARNm mutante ale sitului de legare KSRP au fost sintetizate in vitro din plasmide liniarizate corespunzătoare folosind kitul mMESSAGE mMACHINE (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). ARNm KSRP și ARNm GFP-Pri-129_wt (sau ARNm GFP-Pri-129_mut) au fost injectate concomitent în embrioni de pește zebră cu o singură celulă. Embrionii au fost incadrati la 28 CTC conform criteriilor h.p. f.si morfologice52. Imaginile embrionilor la 4 H. p. f.și 24 h.p. f.au fost achiziționate folosind un stereo Zeiss Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania).

test de procesare in vivo în celule 293tn

celulele 293tn au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri timp de 24 de ore până când au atins confluența 70-80%. Celulele au fost co-transfectate cu plasmidele egfp fusion Pri-129_wt sau mutante pri-129, pcDNA4-RFP și plasmida pCMV-KSRP folosind Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Douăzeci și patru de ore mai târziu, celulele au fost analizate sub un microscop de fluorescență Zeiss la o mărire de 400 de milimetri (Carl Zeiss Microscopy GmbH). ARN-ul a fost, de asemenea, extras pentru o analiză qPCR a eficienței procesării prin detectarea mir-129 primar vs.mir-129 Matur. Intensitatea fluorescenței a fost cuantificată cu ajutorul software-ului Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ test de ligare de proximitate

in situ Pla s-au făcut în urma Protocolului de fabricație (Sigma-Aldrich). Rabbit anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) și rabbit anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) a fost asociat cu anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canada; 1:50) sau anticorpi policlonali IgG normali de iepure (12-370, Merck Millipore, Germania; 1:50) pentru anticorpii primari. Anticorp policlonal Anti-KSRP și iepure normal IgG ca un control negativ. Înainte de blocare, celulele 293T sau HeLa au fost cultivate pe diapozitive camerate (Sigma), fixate în 10% formaldehidă, permeabilizate cu 0,25% Triton X-100-PBS. Celulele au fost analizate prin microscopie de imunofluorescență confocală Zeiss Lsm780 (Zeiss, Germania) urmată de deconvoluție cu Huygens Essential version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Olanda, http://svi.nl). Punctele PLA pe celulă au fost cuantificate cu ajutorul software-ului de analiză a imaginii BlobFinder V3.2 (Universitatea Uppsala, Stockholm, Suedia), iar numărul mediu de puncte PLA pe celulă a fost calculat prin analizarea a minimum 100 de celule.

analiza bioinformatică

toate citirile împerecheate au fost tăiate pentru secvența adaptorului folosind Trim Galore (versiunea 0.3.7) cu parametrii „-q 25 –stringency 5 –length 50 –paired –phred33” și filtrate pentru secvența de calitate scăzută. Genomul de referință hg38 (GRCh38) și fișierul de adnotare a genelor (format GTF) au fost descărcate din GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/)53. TopHat54, 55 (Versiunea 2.1.0) a fost utilizat pentru a alinia citirile filtrate la genomul de referință al genomului hg38 cu setările implicite, iar Fpkms (fragmente pe kilobază transcriptom pe milion de citiri) au fost obținute folosind butoni 54 (versiunea 2.2.1) cu parametrii impliciți. Nivelurile de Expresie au fost estimate folosind numărul de caracteristici56 (versiunea 1.5.0) cu parametrii „-T 7 –primar”, numărul brut la nivel de genă a fost derivat din suma valorilor corespunzătoare pentru toate izoformele unei gene.

EBSeq-HMM18 au fost utilizate pentru a analiza diferențele de expresie a genelor între cele trei etape ale diferențierii monocitelor și, respectiv, granulocitelor. Există doi pași principali pentru ca EBSeq-HMM să obțină gene (de) exprimate diferențiat:

1. 1)

   detectarea genelor DE care au arătat schimbări semnificative între oricare două etape sub o rată țintă de descoperire falsă (FDR) de 0,05.

2. 2)

   gruparea genelor de în căi de Expresie cu probabilitatea posterioară maximă (PP) mai mare de 0,5.

folosind EBSeq-HMM, am obținut genele DE și căile sale de expresie corespunzătoare (adică „Sus-Jos”) în ziua 5, 10 și 15 de diferențiere a monocitelor (sau granulocitelor) (date suplimentare 1). Calea de Expresie „Sus-Jos” reprezintă faptul că o genă a fost reglată în sus în ziua 10 comparativ cu ziua 5, în timp ce este reglată în jos în ziua 15 comparativ cu ziua 10. Genele crescute monoton („Sus-Sus”) sau scăzute („jos-jos”), în timpul diferențierii monocitelor (sau granulocitelor) au fost alese pentru analize ulterioare.

nivelurile de expresie a genelor au fost estimate folosind FPKM, iar toate genele cu fpkm 1 ca gene exprimate au fost utilizate pentru analize suplimentare. Informațiile despre RBP au fost descărcate din bazele de date RBPDB19 și ATtRACT20. Am dezvoltat un script R (date suplimentare 8) pentru a clasifica genele DE cu căi de Expresie „Up-Up” sau „Down-Down” (date suplimentare 2, 3) în diferite modele de Expresie.

hărțile de căldură au fost desenate folosind funcția ‘pheatmap’ a pachetelor R ‘pheatmap’ și Venndiagrama au fost desenate folosind funcția ‘draw.pereche.venn ‘de R pachet ‘VennDiagram’. Gruparea k-means a fost realizată cu rezultatul funcției ‘ pheatmap ‘și clusterele au fost obținute cu funcția’ cutree ‘ utilizând R.

electrotransfecții Plasmidice

am utilizat sistemul de transfecție Neon conform instrucțiunilor producătorului (Invitrogen, Carlsbad, CA) pentru a îmbunătăți eficiența transfecției plasmidice în celulele THP-1 pentru analiza ARN-seq. Celulele au fost electrotransfectate cu plasmide (pEGFP, pSIH-H1-SH-luc, pEGFP-KSRP sau pSIH-H1-SH-KSRP). Parametrii de electroporație pentru celulele de 1 hectolitru 107 THP-1 sau NB4 au fost un impuls de 1350 v, lățimea impulsului de 10 ms și 4 impulsuri utilizând un vârf de 10-il. Patruzeci și opt de ore mai târziu, eficiența electrotransfecției a fost detectată prin Western blotting sau qPCR.

teste de salvare

pentru a valida faptul că KSRP promovează procesarea pri-miR-129 pentru a regla diferențierea liniei mieloide, celulele THP-1 au fost transfectate cu pEGFP-KSRP folosind Lipofectamina 2000, iar 24 h mai târziu, celulele au fost transfectate cu un inhibitor miR-129. Celulele NB4 au fost transfectate cu si-KSRP la o concentrație finală de 100 nM folosind DharmFECT1, iar 24 h mai târziu celulele au fost transfectate cu o mimică miR-129. Pentru a valida că mir-129 țintă RUNX1 pentru a regla diferențierea liniei mieloide, celulele THP-1 și NB4 au fost transfectate cu si-RUNX1 și un inhibitor miR-129 sau controalele lor de către sistemul de transfecție Neon. Celulele au fost apoi stimulate cu PMA sau ATRA pentru încă 48 de ore înainte de a fi recoltate pentru analize ulterioare. Expresia CD14 în celulele THP-1 supuse diferențierii monocitare și expresia CD11b în celulele NB4 supuse diferențierii granulocitare au fost analizate prin citometrie în flux.

timp de expunere pentru Western blot

cea mai mare parte a Western blot a fost dezvoltată de sistemul automat de analiză a imaginii cu gel Digital Tanon 5200 (Tanon, Shanghai, China), iar timpul de expunere al GAPDH este de 150-350 ms. în Fig. 2a, timpul de expunere al probelor de-a lungul diferențierii monocitare este de 20 s pentru KSRP; timpul de expunere al probelor de-a lungul diferențierii granulocitare este de 200 ms pentru KSRP. În Fig. 2b, timpul de expunere este de 20 s pentru KSRP. În Fig. 4f-h, timpul de expunere este de 60 s pentru KSRP. În Fig. 5b, timpul de expunere este de 60 s pentru Drosha, DGCR8 și KSRP. În Fig. 6J, k, timpul de expunere este de 90 s pentru RUNX1. În Fig. 7g, timpul de expunere este de 90 s pentru RUNX1 și KSRP. În Fig. 7h, timpul de expunere este de 30 s pentru RUNX1 și KSRP. În Fig Suplimentar. 2a, timpul de expunere al probelor de-a lungul diferențierii monocitare este de 3 s pentru KSRP; timpul de expunere al probelor de-a lungul diferențierii granulocitare este de 300 ms pentru KSRP. În Fig Suplimentar. 4A, e, f, timpul de expunere este de 60 s pentru KSRP. În Fig Suplimentar. 7m, timpul de expunere este de 10 s și 90 s pentru RUNX1 în THP-1 și NB4, respevtively. În Fig Suplimentar. 8a, timpul de expunere este de 60 s pentru RUNX1.

pentru alte imagini care prezintă rezultatul expunerii manuale (Fig. 2D, i; suplimentar Fig. 7n), timpul de expunere pentru GAPDH este estimat la 1 s. în Fig. 2d, timpul de expunere este de 30 s pentru KSRP în probele induse de PMA și 10 s pentru KSRP în probele induse de ATRA. În Fig. 2i, timpul de expunere este de 60 s pentru KSRP. În Fig Suplimentar. 7n, timpul de expunere este de 90 s pentru RUNX1.

izolarea monocitelor și neutrofilelor din sângele periferic

consimțământul informat a fost obținut în conformitate cu Consiliul de revizuire Instituțională al Academiei Chineze de științe Medicale. Monocitele și neutrofilele umane au fost izolate din sângele periferic al donatorilor sănătoși în 3% dextran și au fost izolate prin centrifugarea gradientului percoll urmată de purificarea cu microbile CD14 (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Germania) sau EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit (#19257, Stemcell Technologies, Canada). După sortarea după microbele CD14, celulele CD14 pozitive obținute au fost placate în baloane T-25 și cultivate timp de 4-6 ore la 37 centicc până când monocitele aderente au fost colectate prin răzuire.

analiza statistică

pentru toate studiile, n pe grup este așa cum este indicat în legenda figurii. Toate datele au fost analizate folosind software-ul GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., SUA)și prezentat ca mijloc de SD. Diferențele dintre grupurile experimentale și grupurile de control au fost analizate folosind testul T al elevului cu două cozi. Semnificația statistică a fost acceptată la P < 0,05. Nu au fost utilizate metode statistice pentru a predetermina dimensiunea eșantionului. Toate experimentele au fost efectuate cu cel puțin trei replici biologice. Am ales testele corespunzătoare în funcție de distribuțiile de date. Experimentele nu au fost randomizate și nu am exclus nicio probă. Anchetatorii nu au fost orbiți de alocare în timpul experimentelor și evaluării rezultatelor.

disponibilitatea datelor

datele de secvențiere miARN și pri-miR-ARN au fost depuse în baza de date GEO sub codul de aderare GSE87318. Datele pentru secvențierea ARNm au fost, de asemenea, depuse în baza de date GEO sub codul de aderare GSE87088. Date sursă pentru Fig. 1c-e au fost furnizate ca date suplimentare 1-4. Date sursă pentru Fig. 2b, c au fost furnizate ca date suplimentare 5, 6. Toate celelalte date care susțin rezultatele acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere.