KSRP especifica diferenciación monocítica y granulocítica a través de la regulación de la biogénesis de miR-129 y la expresión de RUNX1

Diferenciación monocítica y granulocítica de líneas celulares

La línea celular monocítica humana THP-1, y la línea celular promielocítica NB4 y HL-60 se compraron en ATCC (Manassas, EE.UU.) y se mantuvieron en RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, Carlsbad, CA). Las células se seleccionaron mediante PCR para su autenticación y mediante pruebas de inmunofluorescencia para evitar la contaminación por micoplasma. La diferenciación monocítica de las células THP-1 y HL-60 se indujo mediante el tratamiento de las células con 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania) para 0, 24, 48 y 72 h. La diferenciación granulocítica de las células NB4 y HL-60 se indujo mediante el tratamiento de las células con 1 µM ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania). No se encontraron líneas celulares utilizadas en este estudio en la base de datos de líneas celulares comúnmente identificadas erróneamente que mantiene ICLAC y NCBI Biosample. Las líneas celulares se analizaron para detectar contaminación por micoplasma, pero no se han vuelto a autenticar.

Clasificación de CD34 + HPCs

Se obtuvo sangre de cordón umbilical humano (UCB) de partos normales a término en el Hospital de la Unión de Pekín, y médula ósea (BM) de donantes normales se obtuvo del Hospital 307 del Ejército Popular de Liberación de China. Se obtuvo el consentimiento Informado y la aprobación del Comité de Ética en Investigación. Las fracciones de células mononucleares (MNC) se aislaron de UCB y BM utilizando un gradiente de densidad de Percoll (d = 1,077; Amersham Biotech, Alemania). Las células CD34 + se enriquecieron a partir de células MNC mediante selección inmunomagnética positiva (CD34 + MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Alemania).Diferenciación monocítica de CPH

Diferenciación monocítica de CPH

Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ enriquecidas (CPH) se cultivaron en DMIM de glucosa elevada suplementado con suero fetal bovino al 30% (Hyclone, Logan, Utah), ASC al 1%, 2-ME de 100 µM, IL-3 humano recombinante de 2 ng/ml, SCF humano recombinante de 100 ng/ml, M-CSF humano recombinante de 50 ng/mL, 100 ng/ml de FLT3 humano recombinante, 1 ng/ml de IL-6 humano recombinante, 60 mg/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina para inducir la diferenciación de monocitos. Las citoquinas se compraron a Peprotech (Rocky Hill, Nueva Jersey). Las células se recolectaron cada 3-5 días. Para los análisis morfológicos, las células se untaron en portaobjetos de vidrio, se fijaron en metanol 10 min, se teñieron con May-Grünwald / Giemsa y se analizaron a 400 aumentos bajo un microscopio (Nikon TE2000, Japón) equipado con una cámara digital.

Diferenciación granulocítica de CPH

Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ enriquecidas (CPH) se cultivaron en DMIM de alta glucosa suplementado con suero fetal bovino al 30% (Hyclone, Logan, Utah), ASC al 1%, 2-ME de 100 µM, IL-3 humano recombinante de 2 ng/mL, SCF humano recombinante de 100 ng/ml, G-CSF humano recombinante de 20 ng/mL, 10 ng/ml de IL-6 humana recombinante, 60 mg/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina para inducir la diferenciación de granulocitos. Las citoquinas se compraron a Peprotech (Rocky Hill, Nueva Jersey). Las células se recolectaron cada 3-5 días. Los análisis morfológicos se realizaron de la misma manera que la diferenciación monocítica.

Se obtuvieron oligonucleótidos y constructos

MIR-129 (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), inhibidores de miARN (anti-129) y moléculas de control negativo (NC) a partir de Dharmacon (Austin, TX) y se transfectaron células con una concentración final de estos constructos de 100 nM utilizando DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNAs (específicamente para KSRP y RUNX1) y siRNAs de control (Si-Con) fueron sintetizados por Dharmacon y las células fueron transfectadas con siRNAs de 100 nM usando DharmFECT1.

Para la sobreexpresión de KSRP, el clon ORF de cDNA humano KSRP (NM_003685.2) (pEGFP-KSRP) se compró a Addgene (Addgene, MA). Para el derribo de KSRP, el ARN sh de KSRP se clonó en el vector pSIH-H1 aguas abajo del promotor H1 (lenti-sh_KSRP) o se compró directamente en forma de construcciones lentivirales (TL311984, Origen, Rockville, MD). Para la sobreexpresión de pri-129-1, se clonó una construcción de tipo salvaje de 700 bp en el vector pCMV6 (129_WT) o en el plásmido pMIRNA1 (lenti-129). Los sitios de unión mutantes de KSRP en pri-129-1 (129_MUT1, 129_MUT2, 129_MUT3, 129_MUT4 y 129_MUTF) también se crearon en vectores pCMV6. Para el derribo del miR-129, el miRZIP-129 y el miRZIP-control se compraron a System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Para la sobreexpresión de RUNX1, el ORF de RUNX1 se clonó en el vector pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

Para el ensayo del gen reportero de objetivos miR-129, la secuencia complementaria inversa al miR-129 se insertó en el pMIR-reportero aguas abajo del gen luciferasa de luciérnaga para generar la construcción positiva del reportero (129_positivo). El 3′-UTR del ARNm RUNX1 humano fue amplificado y clonado en el mismo reportero pMIR aguas abajo del gen luciferasa de luciérnaga para formar el reportero de tipo salvaje (RUNX1_WT). Las mutaciones de los sitios de unión miR-129 en el 3′-UTR de secuencias humanas de ARNm RUNX1 se crearon utilizando el kit de Mutagénesis dirigida al sitio de cambio rápido (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 y RUNX1_Mut3). Las células se transfectaron con estos constructos utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para células 293TN o Lipofectamina LTX&PLUS para células THP-1 y células NB4, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Todos los cebadores se enumeran en los Datos complementarios 7.

Producción de Lentivirus

El kit de embalaje de lentivirus apropiado se compró en System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) y se utilizó de acuerdo con las directrices del fabricante. Las partículas virales recolectadas (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 y lenti-GFP) se agregaron a células CD34+ HPCs, THP-1 o NB4, y las células se lavaron con IMDM después de 24 horas y se platearon para experimentos posteriores.

Secuenciación profunda de miARN

Las células THP-1 se electroporaron con pEGFP-KSRP o pEGFP utilizando el sistema de transfección de neón y luego se clasificaron por FACS para recolectar las células positivas a GFP. Se aislaron ARN pequeños del ARN total con el Kit de Aislamiento de Mirvana miRNA (Ambion, Austin, TX), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, China) utilizando un Illumina HiSeq2000 (Illumina, EE.UU.). Se filtraron los datos de secuenciación, se construyeron los perfiles de expresión y se separaron las lecturas de dímeros adaptadores de las lecturas de miARN que ya se habían identificado en miRBase 17.0. Los datos de ARN-seq fueron analizados por Genergy Bio y una lista de miRNAs cuya expresión aumentó tras la sobreexpresión de KSRP se muestra en Datos Suplementarios 5, 6.

Secuenciación profunda de ARN enriquecido con poli(A)

El ARN total se extrajo utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para preparar la biblioteca seq de ARN enriquecido con poli(A). Las bibliotecas de ARN enriquecido con poli(A) y ARN profundo-seq se adaptaron a Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) y fueron realizadas por Genergy Bio. Una lista completa de miRNAs primarios cuya expresión disminuyó tras la sobreexpresión de KSRP se muestra en los Datos complementarios 5, 6.

Análisis de carrera

Para identificar la longitud completa de la CARRERA primaria-129-1, 5′ y 3′, se realizaron reacciones en el ARN total de las células THP-1 utilizando el Kit de CARRERA completo de 5’y el Kit de CARRERA Completo de 3′(TaKaRa, Dalian, China) de acuerdo con el manual del fabricante. Los cebadores utilizados para el experimento de CARRERA se enumeran en los Datos complementarios 7.

Ensayo de reportero de Luciferasa

Para los análisis mecanicistas funcionales de miR-129-1, predijimos varios objetivos de MIR-129-1 utilizando el software bioinformático Targetscan y Miranda y validamos los candidatos con el ensayo de reportero de luciferasa. Se transfectaron 293 células TN con 0,4 µg del constructo reportero, 0,015 µg del vector de control pRL-TK y 5 pmol del mimético MIR-129 o mimético de control negativo. Después de 48 h, las células se recolectaron y analizaron con el Kit de Prueba de Luciferasa Dual (Promega, Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los ensayos de transfección se realizaron por triplicado.

Ensayo de procesamiento in vitro

El ensayo de procesamiento se realizó utilizando una NE de células HeLa de 10 mg/ml. Para la depleción de KSRP, se añadieron diez microlitros de anticuerpo KSRP a 1 mg de NE de células HeLa y se añadió un anticuerpo IgG como control. Después de una incubación de 30 minutos a 4 °C, el complejo de proteínas y anticuerpos KSRP se inmunoprecipitó con perlas de proteína A (Thermo Fisher Scientific, San José, CA). El sobrenadante es el extracto nuclear agotado por KSRP (ΔKSRP-NE). El pri-129-1 (129_WT) y el pri-129-1 de tipo salvaje marcado con isótopos 700-nt que contienen los cuatro mutantes del sitio de unión a KSRP (129_Mut) se prepararon mediante transcripción in vitro estándar con ARN polimerasa T7 en presencia de-UTP utilizando las construcciones 129_WT y 129_Mut. 129_WT y 129_Mut fueron incubados con células HeLa NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) durante 30 minutos a 37 ° C en presencia de KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), y 4 pmol (4×)). Las mezclas de reacción se sometieron a fenol: extracción de cloroformo, precipitación y electroforesis en gel desnaturalizante, seguidas de autorradiografía.

Se realizó el ensayo de procesamiento de rescate. Brevemente, se incubaron 20 µL de ΔKSRP-NE con 1 pmol de MIR-129 primario marcado con UTP y diferentes cantidades de KSRP (0,5 µg) durante diferentes tiempos (15, 40 y 60 min) a 37 ° C. Las mezclas de reacción se trataron con proteinasa K durante 30 min a 37 ° C, y luego se sometieron a fenol:electroforesis en gel de extracción, precipitación y desnaturalización de cloroformo, seguida de autorradiografía. Todos los geles de ARN sin recortar se pueden encontrar en el suplemento Fig. 12.

Northern blot

Un total de muestras de ARN de 40 µg se cargaron y se ejecutaron con geles de poliacrilamida al 12% de desnaturalización (urea) y luego se transfirieron a membranas Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La hibridación se realizó con sonda pri-miR-129 marcada con digoxigenina (DIG), mir-129-5p pre-o madura marcada con γ – 32P durante la noche a 42 °C. El ARNsn U6 y el ARNRR sirvieron como controles de carga para el miARN pre, maduro o primario, respectivamente. El nivel de expresión se midió por normalización a la expresión de ARNN o ARNR U6. Las secuencias de sonda de oligonucleótidos se enumeran en Datos complementarios 7. La expresión de miARN fue cuantificada por el software Image J. Todas las manchas boreales no cultivadas se pueden encontrar en la Fig. 12.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN

Se recolectaron cantidades iguales de células THP-1 o NB4 en PBS helado. A continuación, se resuspendieron los gránulos celulares en 1 ml de tampón de lisis B (50 mm Tris, pH 7.4, NaCl de 150 mM, Igepal de 0,05%, PMSF de 1 mM, aprotinina de 1 mM, leupeptina de 1 mM y complejos ribonucleósidos de vanadilo de 2 mM (VRC)) y sonicación suave. Después de centrifugar los lisados a 12.000 rpm durante 15 min, los sobrenadantes se preclararon con Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) en tampón de lisis B con 10 µg de ARNt de levadura (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania). Luego, los lisados precleados se utilizaron para RIP con un anticuerpo anti-KSRP (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) o un isotipo IgG de conejo (12-370, Merck Millipore, Alemania; 1: 500) como control durante 4 h a 4 °C. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis B, y el último lavado contenía un desoxicolato de sodio adicional al 0,5%, seguido de extracción con tampón C (100 mm Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-mercaptoetanol y 20% glicerol) a temperatura ambiente durante 10 min. El ARN inmunoprecipitado se extrajo con trizol y fenol-cloroformo. Para RT-PCR, cada muestra de ARN se trató con DNasa I (Ambion, kit TM libre de ADN). Luego, se transcribieron cantidades iguales con el Kit de Transcripción Inversa de ADNc de Alta Capacidad (Invitrogen, Carlsbad, CA). El enriquecimiento del pliegue de los ARN por KSRP se midió mediante qPCR y electroforesis en gel de agarosa. Los cebadores utilizados para los experimentos RIP-PCR se enumeran en los Datos complementarios 7.

La inmunoprecipitación de los complejos proteína-ARN

La purificación de afinidad de la proteína de unión a maltosa (MBP) se utilizó para identificar proteínas asociadas con miRNAs primarios. El plásmido de expresión MS2-MBP fue un regalo del Dr. Lingling Chen (Academia China de Ciencias) y el MS2-MBP se expresó y purificó a partir de E. coli utilizando un protocolo del laboratorio Steize (Universidad de Yale). Se insertaron tres sitios de unión a proteínas de capa MS2 (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagcccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3′) aguas abajo de la secuencia génica pri-129-1 o de las secuencias mutantes del sitio de unión pri-129-1 de KSRP. Se transfectaron 293 células con estructuras que contenían MS2 para obtener proteínas asociadas con miRNAs primarios, y se utilizaron 10 millones de células para cada ensayo de inmunoprecipitación. Las células se recolectaron 48 h después de la transfección y se sometieron al análisis de extracción de ARN. En resumen, las células se enjuagaron dos veces con PBS helados antes de cosecharlas en PBS helados de 10 ml mediante raspado. Luego, los pellets de células se resuspendieron en un tampón IP de 1 mL (Tris de 50 mM, pH 7,4, NaCl de 150 mM, Igepal al 0,05%, PMSF de 1 mM, cóctel inhibidor de proteinasa), y se sometieron a 2 rondas de sonicación suave y se centrifugaron para obtener extractos celulares. El sobrenadante se incubó primero con MS2-MBP durante 1 hora y luego perlas de resina de amilosa (NEB) durante otra 1 hora a 4 ° C. Las perlas se lavaron cinco veces con tampón IP con roca suave y un último lavado con tampón IP suministrado con NaCl adicional de 150 mm. Los componentes de la proteína fueron finalmente eluidos a partir de perlas con tampón IP suplementado con Maltosa de 12 mm, y fueron comprobados por WB con los siguientes anticuerpos primarios: anti-Drosha de conejo (ab12286, Abcam; 1:1000), anti-DGCR8 de conejo (ab191875, Abcam; 1:1000), anti-KSRP de conejo (6994-1, Epítomicos; 1:1000) y anti-GAPDH de ratón (60004-1-Ig, Proteintech; 1:1.000.000).

Ensayo de protección de la RNasa H

Se realizó una reacción estándar de protección de la RNasa H en un volumen total de 25 µL que contenía 1 pmol de proteína KSRP, 1 pmol de ARN marcado con UTP, 20 µg/mL de oligonucleótidos de ADN, 12 mm HEPES (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM TDT, 20 U de rnasina (40 U/µL, Promega, Madison, WI), y 1 U de E. coli RNasa H. Para el control, se preparó e incubó a 25 °C durante 15 min una reacción con la cantidad correspondiente de ARN marcado con UTP desproteinizado y las mismas condiciones iónicas que el extracto. La reacción se terminó añadiendo 75 µL de H2O destilado, 100 µL de tampón PK de 2 × y 4 µL de proteinasa K (10 mg/ml), y el ARN se preparó como se describe en el qPCR para analizar los fragmentos de ARN. El ARN se resuspendió en 25 µL de tampón de carga de gel de urea (EDTA de 5 mM, glicerol al 10% (v/v), cianol de Xileno al 0,05% (p/v), azul de Bromofenol al 0,05% (p/v) y formamida desionizada al 50%) y se separó en geles desnaturalizantes de urea, seguidos de autorradiografía.

qPCR

El ARN total se extrajo de las células y tejidos utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguido de digestión de DNasa I, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm y transcripción reversa. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad IQ5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para la transcripción inversa y el qPCR se mostraron en Datos complementarios 7. Los datos se normalizaron utilizando ARNm endógeno GAPDH y ARNsn U6. Se utilizó el método 2-ΔΔCT para analizar los datos de PCR.

Citometría de flujo

Las células se recolectaron en los puntos de tiempo indicados y se lavaron dos veces con PBS / 0,5% ASC a 4 °C para bloquear los receptores Fc. Los CPH CD34 + transducidos se teñieron con anticuerpos anti-CD14 (clon: 61D3) o anti-CD11b (clon: ICRF44) conjugados con APC (eBioscience, San Diego, CA). Las células MB de ratón se teñieron con un anticuerpo anti-CD33 conjugado con PE (clon: HIM3-4 eBioscience, CA, EE.UU.). La citometría de flujo se realizó en un Citómetro de Flujo C6 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Los datos se analizaron con el software FlowJo (Versión 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

Ratones y ensayos de trasplante

Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética en Investigación del Colegio Médico de la Unión de Pekín. Diez millones de CPH CD34 + infectados con lenti-sh-KSRP, lenti-129 o control lenti-GFP se lavaron y resuspendieron en PBS y luego se inyectaron en la vena lateral de la cola de ratones hembra de 4 a 6 semanas de edad que recibieron NOD/SCID irradiados con rayos X a una dosis de 250 cGy. Cuatro semanas después del trasplante de los CPH CD34+, los ratones fueron sacrificados, y el bazo y el bazo fueron recolectados y procesados en suspensiones unicelulares para los experimentos posteriores. Los resultados se obtuvieron de 4 ratones por grupo.

Western blot

Los lisados de células enteras se sometieron al análisis de Western blot. Anticuerpo policlonal anti-KSRP de conejo (6994-1; 1:1000) y anticuerpo anti-RUNX1 (ab35962; 1:1000) que proviene de Epitomics (Abcam, Cambridge, MA) o un anticuerpo GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) se utilizaron como anticuerpos primarios y se incubaron en 1 × TBST con 5% de ASC durante 2 h a temperatura ambiente (RT) con agitación continua. Después de los lavados con 1× TBST durante 15 min en la RT, las membranas se incubaron con un Ab secundario conjugado con HRP (Thermo Fisher Scientific, San José, CA) para 1 h en la RT. Después de un lavado final con 1× TBST durante 15 min en la RT, las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) al tiempo de exposición indicado («Tiempo de exposición para Western blot»). Todos los western blots sin recortar se pueden encontrar en la Fig. 11.

Ensayo de procesamiento in vivo en peces cebra

Se recolectaron embriones de una colonia de cría de laboratorio de peces cebra de Tubinga alojados a 28 ° C en un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h y criados en condiciones estándar (Centro de Recursos de Peces Cebra de China). ARNm de KSRP y ARNm mutantes en el sitio de unión de GFP-Pri-129 WT o KSRP se sintetizaron in vitro a partir de plásmidos linealizados correspondientes utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE (Thermo Fisher Scientific, San José, CA). El ARNm KSRP y el ARNm GFP-Pri-129_WT (o ARNm GFP-Pri-129_Mut) se inyectaron conjuntamente en embriones de pez cebra de una sola célula. Los embriones se estadificaron a 28 ° C de acuerdo con los criterios h. p. f. y morfológicos52. Las imágenes de embriones en etapas de 4 y 24 horas se obtuvieron con un Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania).

Ensayo de procesamiento in vivo en células de 293TN

Las células de 293TN se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 h hasta que alcanzaron la confluencia ≈70-80%. Las células se transfectaron con plásmidos Pri-129_WT de fusión EGFP o plásmidos Pri-129 mutantes, pcDNA4-RFP y plásmido pCMV-KSRP utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Veinticuatro horas más tarde, las células se analizaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss a 400× de aumento (Carl Zeiss Microscopy GmbH). El ARN también se extrajo para un análisis qPCR de la eficiencia de procesamiento mediante la detección del miR-129 primario frente al MIR-129 maduro. La intensidad de fluorescencia se cuantificó utilizando el software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

Ensayo de ligadura de proximidad in situ

Los PLA in situ se realizaron siguiendo el protocolo de fabricación (Sigma-Aldrich). Los anticuerpos primarios anti-Drosha de conejo (ab12286, Abcam; 1 : 50) y anti-DGCR8 de conejo (ab191875, Abcam; 1:50) se emparejaron con anticuerpos policlonales IgG de conejo normal (12-370, Merck Millipore, Alemania; 1:50) anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canadá; 1:50). Anticuerpo policlonal IgG de conejo normal y anti-KSRP como control negativo. Antes del bloqueo, se cultivaron células 293T o HeLa en portaobjetos con cámara (Sigma), fijadas en formaldehído al 10%, permeabilizadas con Tritón X-100-PBS al 0,25%. Las células se analizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal Zeiss LSM780 (Zeiss, Alemania), seguida de deconvolución con Huygens Essential versión 16.05 (Scientific Volume Imaging, Países Bajos, http://svi.nl). Los puntos de PLA por célula se cuantificaron con el software de análisis de imágenes BlobFinder V3.2 (Universidad de Uppsala, Estocolmo, Suecia) y el número medio de puntos de PLA por célula se calculó analizando un mínimo de 100 células.

Análisis bioinformático

Todas las lecturas de extremos emparejados se recortaron para la secuencia del adaptador utilizando Trim Galore (Versión 0.3.7) con parámetros «-q 25 string stringency 5 length length 50 paired pared ph phred33» y se filtraron para la secuencia de baja calidad. El genoma de referencia hg38 (GRCh38) y el archivo de anotación de genes (formato GTF)se descargaron de GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53. TopHat54, 55 (Versión 2.1.0) se utilizó para alinear las lecturas filtradas con el genoma de referencia del genoma hg38 con ajustes predeterminados, y se obtuvieron FPKM (Fragmentos por transcriptoma de Kilobase por millón de lecturas) utilizando Cufflinks54 (Versión 2.2.1) con parámetros predeterminados. Los niveles de expresión se estimaron utilizando recuentos de características56 (Versión 1.5.0) con parámetros «-T 7 primary primario», los recuentos brutos a nivel de genes se derivaron de la suma de los valores correspondientes para todas las isoformas de un gen.Se utilizaron

EBSeq-HMM18 para analizar las diferencias en la expresión génica entre tres etapas de diferenciación de monocitos y granulocitos, respectivamente. Hay dos pasos principales para que EBSeq-HMM obtenga genes (DE) expresados diferencialmente:

1. 1)

   Detección de genes DE que mostraron cambios significativos entre dos etapas cualesquiera bajo una tasa de descubrimiento falso objetivo (FDR) de 0,05.

2. 2)

   Agrupamiento de genes en rutas de expresión con una probabilidad posterior máxima (PP) superior a 0,5.

Mediante el uso de EBSeq-HMM, obtuvimos genes DE y sus vías de expresión correspondientes (es decir, «Arriba-Abajo») en los días 5, 10 y 15 de la diferenciación de monocitos (o granulocitos) (Datos suplementarios 1). La ruta de expresión «Arriba-Abajo» representa que un gen se reguló al alza en el día 10 en comparación con el día 5, mientras que se reguló a la baja en el día 15 en comparación con el día 10. Se eligieron genes monótonamente aumentados («Up-Up») o disminuidos («Down-Down») durante la diferenciación de monocitos (o granulocitos) para un análisis posterior.

Los niveles de expresión génica se estimaron utilizando el FPKM, y todos los genes con el FPKM ≥ 1 como genes expresados se utilizaron para un análisis posterior. La información sobre las prácticas comerciales restrictivas se descargó de las bases de datos RBPDB19 y ATtRACT20. Desarrollamos un script R (Datos Suplementarios 8) para clasificar genes DE con rutas de expresión «Arriba-Arriba» o «Abajo-Abajo» (Datos Suplementarios 2, 3) en diferentes patrones de expresión.

Los mapas de calor se dibujaron usando la función ‘mapa de calor’ de los paquetes R ‘ mapa de calor ‘y el venndiagrama se dibujó usando la función’ dibujar.par en par.venn ‘de paquete R ‘VennDiagram’. El clustering de K-means se realizó con la salida de la función ‘ pheatmap ‘y los clusters se obtuvieron con la función’ cutree ‘ utilizando R.

electrotransfecciones de plásmidos

Se utilizó el Sistema de Transfección de Neón según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) para mejorar la eficiencia de transfección de plásmidos en células THP-1 para el análisis de ARN-seq. Las células se electrotransfectaron con plásmidos (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP o pSIH-H1-sh-KSRP). Los parámetros de electroporación para celdas de 1 × 107 THP-1 o NB4 fueron un pulso de 1350 V, un ancho de pulso de 10 ms y 4 pulsos utilizando una punta de 10 µL. Cuarenta y ocho horas más tarde, la eficiencia de la electrotransfección se detectó mediante Western blot o qPCR.

Ensayos de rescate

Para validar que KSRP promueve el procesamiento de pri-miR-129 para regular la diferenciación de linaje mieloide, las células THP-1 se transfectaron con pEGFP-KSRP utilizando Lipofectamina 2000, y 24 h más tarde, las células se transfectaron con un inhibidor de miR-129. Las células NB4 se transfectaron con si-KSRP a una concentración final de 100 nM utilizando DharmFECT1, y 24 h más tarde las células se transfectaron con un mímico miR-129. Para validar que el MIR-129 se dirigiera a RUNX1 para regular la diferenciación de linaje mieloide, las células THP-1 y NB4 se transfectaron con si-RUNX1 y un inhibidor de miR-129 o sus controles mediante el sistema de transfección de Neón. Las células se estimularon con PMA o ATRA durante 48 horas adicionales antes de ser recolectadas para análisis posteriores. La expresión de CD14 en células THP-1 sometidas a diferenciación monocítica y la expresión de CD11b en células NB4 sometidas a diferenciación granulocítica se analizaron mediante citometría de flujo.

Tiempo de exposición para Western blot

La mayor parte de Western blot fue desarrollada por el sistema de análisis de imágenes de gel digital automático Tanon 5200 (Tanon, Shanghai, China), y el tiempo de exposición de GAPDH es de 150-350 ms. En la Fig. 2a, el tiempo de exposición de las muestras a lo largo de la diferenciación monocítica es de 20 s para KSRP; el tiempo de exposición de las muestras a lo largo de la diferenciación granulocítica es de 200 ms para KSRP. En la Fig. 2b, el tiempo de exposición es de 20 s para KSRP. En la Fig. 4f-h, el tiempo de exposición es de 60 s para KSRP. En la Fig. 5b, el tiempo de exposición es de 60 s para Drosha, DGCR8 y KSRP. En la Fig. 6j, k, el tiempo de exposición es de 90 s para RUNX1. En la Fig. 7g, el tiempo de exposición es de 90 s para RUNX1 y KSRP. En la Fig. 7h, el tiempo de exposición es de 30 s para RUNX1 y KSRP. En el Suplemento Fig. 2a, el tiempo de exposición de las muestras a lo largo de la diferenciación monocítica es de 3 s para KSRP; el tiempo de exposición de las muestras a lo largo de la diferenciación granulocítica es de 300 ms para KSRP. En el Suplemento Fig. 4a, e, f, el tiempo de exposición es de 60 s para KSRP. En el Suplemento Fig. 7m, el tiempo de exposición es de 10 s y 90 s para RUNX1 en THP-1 y NB4, respectivamente. En el Suplemento Fig. 8a, el tiempo de exposición es de 60 s para RUNX1.

Para otras imágenes que muestran el resultado de la exposición manual (Fig. 2d, i; Suplemento Fig. 7n), el tiempo de exposición para GAPDH se estima en 1 s. En la Fig. 2d, el tiempo de exposición es de 30 s para KSRP en muestras inducidas por PMA y de 10 s para KSRP en muestras inducidas por ATRA. En la Fig. 2i, el tiempo de exposición es de 60 s para KSRP. En el Suplemento Fig. 7n, el tiempo de exposición es de 90 s para RUNX1.

Aislamiento de monocitos y neutrófilos de sangre periférica

Se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con el Comité de Revisión Institucional de la Academia China de Ciencias Médicas. Se aislaron monocitos y neutrófilos humanos de la sangre periférica de donantes sanos en dextrano al 3% y se aislaron mediante centrifugación de gradiente de percoll seguida de purificación por microesferas CD14 (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Alemania) o Kit de Enriquecimiento de neutrófilos Humanos EasySep (#19257, Stemcell Technologies, Canadá). Después de clasificar por microesferas CD14, las células CD14 positivas obtenidas se platearon en matraces T-25 y se cultivaron durante 4-6 h a 37 °C hasta que los monocitos adherentes se recogieron mediante raspado.

Análisis estadístico

Para todos los estudios, n por grupo es como se indica en la leyenda de la figura. Todos los datos se analizaron con el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., USA) y se presentan como medias ± SD. Las diferencias entre los grupos experimentales y los grupos de control se analizaron utilizando la prueba t de Student de dos colas. Se aceptó la significancia estadística con P < 0,05. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Todos los experimentos se llevaron a cabo con al menos tres réplicas biológicas. Elegimos las pruebas adecuadas de acuerdo con las distribuciones de datos. Los experimentos no fueron aleatorios y no excluimos ninguna muestra. Los investigadores no estaban ciegos a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Disponibilidad de datos

Los datos de secuenciación de miARN y pri-miR-ARN se han depositado en la base de datos GEO con el código de acceso GSE87318. Los datos para la secuenciación del ARNm también se han depositado en la base de datos GEO con el código de adhesión GSE87088. Datos de origen de la Fig. 1c-e se han proporcionado como Datos complementarios 1 a 4. Datos de origen de la Fig. 2b, c se han proporcionado como Datos complementarios 5, 6. Todos los demás datos que respaldan las conclusiones de este estudio están disponibles a petición del autor para correspondencia.