KSRP määrittää monosyyttisen ja granulosyyttisen erilaistumisen säätelemällä miR-129: n biogeneesiä ja RUNX1: n ilmentymistä

monosyyttisen ja granulosyyttisen solulinjojen erilaistumisen

ihmisen monosyyttisen solulinjan THP-1 ja promyelosyyttisen solulinjan NB4 ja HL-60 hankittiin ATCC: stä (Manassas, USA) ja ylläpidetään rpmi1640: ssä täydennettynä 10%: lla sikiön naudan seerumista (gibco, Carlsbad, CA). Solut seulottiin PCR: llä todennusta varten ja immunofluoresenssitesteillä mykoplasma-kontaminaatiosta vapaudeksi. THP-1-ja HL-60-solujen monosyyttinen erilaistuminen indusoitiin käsittelemällä soluja 50 nM: n PMA: lla (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Saksa) 0, 24, 48 ja 72 tunnin osalta. NB4-ja HL-60-solujen Granulosyyttinen erilaistuminen indusoitiin käsittelemällä soluja 1 µM ATRALLA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Saksa). Tässä tutkimuksessa käytettyjä solulinjoja ei löytynyt ICLAC: n ja NCBI Biosamplen ylläpitämästä yleisesti väärin tunnistettujen solulinjojen tietokannasta. Solulinjoja testattiin mykoplasma-kontaminaation varalta, mutta niitä ei ole pystytty todentamaan uudelleen.

Lajittelu CD34+ HPC

ihmisen napanuoraverta (UCB) saatiin normaaleista täysiaikaisista synnytyksistä Pekingin Union Hospitalissa, ja normaaleilta luovuttajilta saatiin luuydintä (BM) Kiinan kansan vapautusarmeijan 307.sairaalasta. Tutkimuseettisen komitean tietoon perustuva suostumus ja hyväksyntä saatiin. Mononukleaarisolufraktiot (MNC) eristettiin UCB: stä ja BM: stä käyttäen Percoll-tiheysgradienttia (d = 1.077; Amersham Biotech, Saksa). CD34+-solut rikastettiin MNCs: stä positiivisen immunomagneettisen valinnan avulla (CD34 + MultiSort Kit, MILTENYI Biotec, Bergisch-Glad-bach, Saksa).

HPC: n monosyyttinen erilaistuminen

rikastetut CD34+-hematopoieettiset progenitorisolut (HPC) viljeltiin korkean glukoosin IMDM: llä täydennettynä 30%: lla sikiön naudan seerumista (Hyclone, Logan, Utah), 1%: lla BSA: ta, 100 µM 2-ME: tä, 2 ng/mL rekombinanttia ihmisen IL-3, 100 ng/mL rekombinanttia ihmisen SCF: ää, 50 ng/mL rekombinanttia ihmisen M-CSF: ää, 100 ng/ml rekombinantti ihmisen flt3, 1 ng/ml rekombinantti ihmisen IL-6, 60 mg/ml penisilliiniä ja 100 mg/ml streptomysiiniä monosyyttien erilaistumisen indusoimiseksi. Sytokiinit ostettiin Peprotechilta (Rocky Hill, NJ). Soluja kerättiin 3-5 päivän välein. Morfologisia analyysejä varten solut tuhrittiin lasilevyihin, kiinnitettiin metanoliin 10 min, värjättiin May-Grünwald/Giemsa: lla ja analysoitiin 400x suurennoksella digitaalikameralla varustetulla mikroskoopilla (Nikon TE2000, Japani).

HPC: n Granulosyyttinen erilaistuminen

rikastetut CD34+ hematopoieettiset progenitorisolut (HPC) viljeltiin korkean glukoosin IMDM: llä täydennettynä 30%: lla sikiön naudan seerumista (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA: lla, 100 µM 2-ME: llä, 2 ng/mL rekombinantilla ihmisen IL-3: lla, 100 ng/mL rekombinantilla ihmisen SCF: llä, 20 ng/mL rekombinantilla ihmisen G-CSF: llä, 10 ng/ml rekombinantti ihmisen IL-6, 60 mg/ml penisilliiniä ja 100 mg/ml streptomysiiniä granulosyyttien erilaistumisen indusoimiseksi. Sytokiinit ostettiin Peprotechilta (Rocky Hill, NJ). Soluja kerättiin 3-5 päivän välein. Morfologiset analyysit tehtiin samalla tavalla kuin monosyyttinen erottelu.

Oligonukleotidit ja konstruktiot

miR-129-Mimiikka (5′-CUUUUGCGGUCUGGCUUGC-3′), miRNA-inhibiittorit (anti-129) ja negatiiviset kontrollimolekyylit (NC) saatiin Dharmaconista (Austin, TX) ja solut transfektoitiin siten, että näiden konstruktioiden lopullinen pitoisuus oli 100 nM käyttäen dharmfect1: tä (Dharmacon, Austin, TX). sirnat (erityisesti KSRP: lle ja RUNX1: lle) ja kontrolli-sirnat (Si-Con) syntetisoitiin dharmaconilla ja solut transfektoitiin 100 nM sirnoilla dharmfect1: llä.

KSRP: n yli-ilmentymän osalta ihmisen KSRP (NM_003685.2) cDNA ORF-klooni (pEGFP-KSRP) ostettiin Addgenelta (Addgene, MA). KSRP: n knockdownissa KSRP sh-RNA kloonattiin pSIH-H1-vektoriksi H1-promoottorin alajuoksulla (lenti-sh_KSRP) tai ostettiin suoraan lentiviraalisina konstruktioina (Tl311984, Origene, Rockville, MD). Pri-129-1-yliekspressiota varten kloonattiin 700 bp: n villityyppinen konstruktio pCMV6-vektoriin (129_wt) tai pmirna1-plasmidiin (lenti-129). Mutanttien KSRP-sidontapaikat pri-129-1: ssä (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 ja 129_mutf) luotiin myös pCMV6-vektoreissa. MiR-129 knockdowniin hankittiin Mirzip-129 ja miRZIP-control System Biosciencesiltä (SBI, Palo Alto, CA). RUNX1-yliekspressiota varten runx1 ORF kloonattiin pMIRNA1-vektoriksi (Lenti-RUNX1).

mir-129-kohteiden reporter-geenimäärityksessä mir-129: n käänteinen komplementaarisekvenssi lisättiin pmir-reportteriin firefly-luciferaasi-geenin jälkeen positiivisen reporter-Konstruktion (129_positiivinen) aikaansaamiseksi. Ihmisen RUNX1 mRNA: n 3 ’ -UTR monistettiin ja kloonattiin samaksi pmir-reportteriksi firefly luciferase-geenin alajuoksulla muodostaen villin tyypin reportterin (RUNX1_WT). Mir-129: n sitoutumiskohtien mutaatiot ihmisen RUNX1 mRNA-sekvenssien 3’-UTR: ssä luotiin käyttämällä QuickChange Site-directed Mutagenesis kitiä (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 ja RUNX1_Mut3). Solut transfektoitiin näillä rakenteilla joko Lipofektamiini 2000: lla (Invitrogen, Carlsbad, CA) 293tn-soluille tai Lipofektamiini LTX&PLUS THP-1-soluille ja NB4-soluille valmistajan protokollien mukaan. Kaikki alukkeet on lueteltu lisätiedoissa 7.

Lentivirus production

sopiva lentivirus-pakkauspakkaus ostettiin System Biosciencesiltä (SBI, Palo Alto, CA) ja sitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Korjatut viruspartikkelit (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 ja lenti-GFP) lisättiin CD34+ HPCs -, THP-1-tai NB4-soluihin, ja solut pestiin IMDM: llä 24 tunnin kuluttua ja pinnoitettiin myöhempiä kokeita varten.

miRNA deep sequencing

THP-1-solut sähköistettiin pEGFP-KSRP: llä tai pEGFP: llä Neonsiirtojärjestelmää käyttäen, minkä jälkeen FACS lajitteli GFP-positiiviset solut talteen. Pienet RNA: t eristettiin kokonais-RNA: sta mirVana miRNA-Eristyspakkauksella (Ambion, Austin, TX) valmistajan ohjeiden mukaan. Pienet RNA-kirjastot ja miRNA-sekvensoinnin suoritti Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, Kiina) käyttäen Illumina HiSeq2000 (Illumina, Yhdysvallat). Sekvensointidata suodatettiin, lausekeprofiilit rakennettiin ja sovittimen dimeerilukemat erotettiin Mirna-lukuista, jotka oli jo tunnistettu miRbase 17.0: ssa. GENERGY Bio analysoi RNA-seq-tiedot, ja lisätiedoissa 5, 6 esitetään luettelo mirnoista, joiden ekspressio lisääntyi KSRP: n yli-ekspression seurauksena.

Poly(A)-rikasteisen RNA: n syväsekvenssointi

kokonais-RNA uutettiin Trizolireagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaan Poly(a)-rikasteisen RNA-seq-kirjaston valmistamiseksi. Poly (a)-rikasteiset RNA-kirjastot ja syvä RNA-seq sovitettiin Hiseq2000: een (Illumina, San Diego, CA) ja niistä vastasi Genergy Bio. Täydellinen luettelo primaarisista mirnoista, joiden ilmentyminen väheni KSRP: n yli-ekspression seurauksena, on lueteltu lisätiedoissa 5 ja 6.

ROTUANALYYSI

primaaristen-129-1, 5′ ja 3′-rotujen täyden pituuden tunnistamiseksi reaktiot THP-1-solujen kokonais-RNA: lla suoritettiin 5′ – Full RACE Kit ja 3′ – Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Kiina) valmistajan käsikirjan mukaan. ROTUKOKEESSA käytetyt alukkeet on lueteltu lisätiedoissa 7.

Luciferase reporter assay

miR-129-1: n funktionaalisia mekanistisia analyysejä varten ennustimme useita miR-129-1-kohteita bioinformatiikkaohjelmistolla Targetscan ja Miranda ja validoimme ehdokkaat luciferase reporter assaylla. 293tn: n solut transfektoitiin 0,4 µg: lla reporter-konstruktiota, 0,015 µg: lla pRL-TK-kontrollivektoria ja 5 pmol: lla mir-129: ää jäljittelevää tai negatiivista kontrollimimulaatiota. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin ja määritettiin Dual Luciferase Assay Kit-Testisarjalla (Promega, Madison, WI) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki transfektiomääritykset tehtiin kolmena kappaleena.

in vitro-prosessointimääritys

käsittelymääritys tehtiin käyttäen HeLa-solua NE 10 mg/mL. KSRP: n heikkenemisen vuoksi 1 mg: aan HeLa-solua NE lisättiin kymmenen mikrolitraa KSRP-vasta-ainetta ja kontrollina lisättiin IgG-vasta-aine. KSRP: n proteiini-ja vasta-ainekompleksi immunopresipitoitiin 30 min 4 °C: ssa tapahtuneen inkubaation jälkeen A-proteiinihelmillä (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatantti on KSRP-köyhdytetty ydinuute (ΔKSRP-NE). Isotooppimerkityt 700-NT: n villityyppiset pri-129-1 (129_wt) ja pri-129-1, jotka sisältävät kaikki neljä KSRP: n sitoutumiskohdan mutanttia (129_mut), valmistettiin standardilla in vitro transkriptiolla T7-RNA polymeraasilla-UTP: n läsnä ollessa käyttäen 129_wt-ja 129_mut-konstruktioita. 129_WT ja 129_mut inkuboitiin HeLa-kennoilla (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) 30 min 37 °C: ssa KSRP: n läsnä ollessa (0, 1 (1×), 2 (2×), ja 4 pmol (4×)). Reaktioseoksille tehtiin fenoli: kloroformi-uutto, saostus ja denaturointigeelielektroforeesi, jota seurasi autoradiografia.

suoritettiin rescue processing-määritys. Lyhyesti 20 µL ΔKSRP-NE: tä inkuboitiin 1 pmol: lla-UTP-merkittyä primääristä miR-129: ää ja eri määriä KSRP: tä (0, 5 µg) eri aikoina (15, 40 ja 60 min) 37 °C: ssa. reaktioseoksia käsiteltiin proteinaasi K: lla 30 minuutin ajan 37 °C: ssa ja altistettiin sitten fenolille:kloroformin uuttaminen, saostaminen ja denaturointi geelielektroforeesilla, jota seuraa autoradiografia. Kaikki muokkaamattomat RNA-geelit löytyvät täydentävästä viikunasta. 12.

Northern blot

yhteensä 40 µg RNA-näytteitä ladattiin ja ne käytettiin denaturoimalla (urea) 12-prosenttisia polyakryyliamidigeelejä ja siirrettiin sitten Hybond-kalvoille (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybridisaatio suoritettiin digoksigeniini (DIG)-merkityllä pri-miR-129: llä, γ-32P – merkityllä esi-tai kypsällä miR-129-5p-luotaimella yön yli 42 °C: ssa. U6 snRNA: ta ja rRNA: ta käytettiin esikypsennetyn mirnan tai primaarisen mirnan lastausohjaimina. Lauseketaso mitattiin normalisoimalla lauseke U6 snRNA tai rRNA. Oligonukleotidiluotainjaksot on lueteltu lisätiedoissa 7. Mirnan ilmaisun kvantifioi Image J software. Kaikki muokkaamaton Pohjoinen täplä löytyy täydentävästä viikunasta. 12.

RNA-immunoprecipitaatiomääritys

yhtä paljon THP-1-tai NB4-soluja kerättiin jääkylmästä PBS: stä. Seuraavaksi solupelletit suspendoitiin uudelleen 1 mL: aan lysis-puskuria B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0, 05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotiniini, 1 mM leupeptin ja 2 mM vanadyyliribonukleosidikompleksit (VRC)) ja lempeä sonikaatio. Kun lysaatit sentrifugoitiin nopeudella 12 000 rpm 15 minuutin ajan, supernatantit esikuorittiin dynabeadeilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) lysis-puskurissa B 10 µg hiivatrna: lla (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Saksa). Tämän jälkeen PREKLEAARISIA lysaatteja käytettiin RIP:n kontrollina 4 tunnin ajan 4 °C:ssa, kun kontrollina oli joko anti-KSRP-vasta-aine (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1: 500) tai kanin isotyyppi IgG (12-370, Merck Millipore, Saksa; 1: 500). Helmet pestiin kolme kertaa lysis-puskurilla B, viimeisessä pesussa oli lisäksi 0, 5% natriumdeoksikolaattia, minkä jälkeen ne uutettiin puskurilla C (100 mM Tris, pH 6, 8, 4% SDS, 12% β-merkaptoetanoli ja 20% glyserolia) huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Immunopresipitoitu RNA uutettiin Trizolilla ja fenolikloroformilla. RT-PCR: n osalta jokainen RNA-näyte käsiteltiin DNase I: llä (Ambion, DNA-free TM kit). Sitten yhtä suuret määrät käännettiin suuren kapasiteetin cDNA: n Käänteiskopioijapaketilla (Invitrogen, Carlsbad, CA). KSRP: n RNAS-kertainen rikastus mitattiin qPCR-ja agaroosigeelielektroforeesilla. RIP-PCR-kokeissa käytetyt alukkeet luetellaan lisätiedoissa 7.

proteiini-RNA-kompleksien

maltoosia sitovan proteiinin (MBP) affiniteettipuhdistusta käytettiin primaarisiin mirnoihin liittyvien proteiinien tunnistamiseen. MS2-MBP-lauseke plasmid oli lahja tohtori Lingling Cheniltä (Kiinan tiedeakatemia) ja MS2-MBP ilmaistiin ja puhdistettiin kolibakteerista käyttäen protokollaa Steizen laboratoriosta (Yalen yliopisto). Pri-129-1-geenisekvenssin tai pri-129-1 KSRP-sitoutumiskohdan mutanttisekvenssien alajuoksulle lisättiin kolme MS2 coat-proteiiniin sitoutumiskohtaa (5′-cgtacaccaccagggtacg-3′). 293TN-soluille tehtiin transfektio MS2: ta sisältävillä rakenteilla primaarisiin mirnoihin liittyvien proteiinien saamiseksi, ja jokaista immunoprecipitaatiomääritystä varten käytettiin 10 miljoonaa solua. Solut kerättiin talteen 48 tuntia transfektion jälkeen ja niille tehtiin RNA: n pull-down-analyysi. Lyhyesti sanottuna solut huuhdeltiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ennen sadonkorjuuta 10 mL jääkylmällä PBS: llä kaapimalla. Sitten solupelletit suspendoitiin uudelleen 1 mL: aan IP-puskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, proteinaasi-inhibiittoricocktail), ja niille tehtiin 2 kierrosta hellävaraista sonikointia ja sentrifugoitiin soluuutteiden saamiseksi. Supernatanttia inkuboitiin ensin MS2-MBP: llä 1 tunnin ajan ja sitten amyloosihelmillä (NEB) vielä 1 tunnin ajan 4 C: ssä.Helmet pestiin viisi kertaa IP-puskurilla hellävaraisella kivellä ja viimeinen pesu IP-puskurilla, johon lisättiin 150 mM NaCl. Proteiinikomponentit eluoitiin lopuksi helmistä, joiden IP-puskuria täydennettiin 12 mM Maltoosilla, ja WB tarkasti seuraavat primaariset vasta-aineet: rabbit anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), rabbit anti-dgcr8 (ab191875, Abcam; 1:1000), rabbit anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) ja mouse anti-gapdh (60004-1-IG, proteintech; 1:1 000 000).

RNaasi h-suojausmenetelmä

standardoitu RNaasi h-suojausreaktio suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 µL, joka sisälsi 1 pmol KSRP-proteiinia, 1 pmol UTP-merkittyä RNA: ta, 20 µg/mL DNA-oligonukleotideja, 12 mm HEPES (pH 8, 0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U rnasiinia (40 U/µL, Promega, Madison, WI), ja 1 u E. coli RNaasi H. kontrollia varten reaktio, jossa vastaava määrä deproteinisoitua-UTP-merkittyä RNA: ta ja samat ioniset olosuhteet kuin uute valmistettiin ja inkuboitiin 25 °C: ssa 15 minuutin ajan. Reaktio päätettiin lisäämällä 75 µL tislattua H2O: ta, 100 µL 2 × PK-puskuria ja 4 µL proteinaasi K: ta (10 mg/mL), ja RNA valmistettiin ”qPCR”: n kuvauksen mukaisesti RNA-fragmenttien analysoimiseksi. RNA suspendoitiin uudelleen 25 µL: aan ureageeliä kuormittavaa puskuria (5 mM EDTA, 10% (v/v) glyserolia, 0, 05% (w/v) Ksyleenisyanolia FF, 0, 05% (w/v) Bromifenolisinistä ja 50% deionisoitua formamidia) ja erotettiin urea-denaturointigeeleillä, minkä jälkeen tehtiin autoradiografia.

qPCR

kokonais-RNA uutettiin soluista ja kudoksista Trizolireagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja sen jälkeen dnase I-digestiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantifioitiin mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä ja käänteiskopioimalla. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) suoritettiin käyttämällä Bio-Rad IQ5-reaaliaikaista PCR-järjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteiskopioinnissa ja qPCR: ssä käytetyt alukkeet on esitetty lisätiedoissa 7. Tiedot normalisoitiin endogeenisten gapdh mRNA: n ja U6 snRNA: n avulla. PCR-tietojen analysointiin käytettiin 2-ΔΔCT-menetelmää.

Virtaussytometria

solut kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ja pestiin kahdesti PBS: llä/0, 5% BSA: lla 4 °C: ssa Fc-reseptorien tukkimiseksi. Transduced CD34+ HPC värjättiin APC-konjugoitu anti-CD14 (klooni: 61D3) tai anti-CD11b (klooni: ICRF44) vasta-aineita (eBioscience, San Diego, CA). Hiiren BM-solut värjättiin PE-konjugoidulla anti-CD33-vasta-aineella (klooni: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Virtaussytometri suoritettiin C6-Virtaussytometrillä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Tiedot analysoitiin FlowJo-ohjelmiston avulla (versio 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

Hiiri-ja elinsiirtomääritykset

kaikki eläinkokeet tehtiin Pekingin unionin lääketieteellisen korkeakoulun Tutkimuseettisen komitean luvalla. Kymmenen miljoonaa lenti-SH-KSRP: llä, lenti-129: llä tai lenti-GFP-kontrollilla infektoitua CD34+ HPC: tä pestiin ja suspendoitiin PBS: ään ja ruiskutettiin sitten 4-6 viikon ikäisten naarashiirien poikittaishäntälaskimoon, joka säteilytettiin röntgensäteillä 250 cGy: n annoksella. Neljä viikkoa CD34+ HPC: n siirron jälkeen hiiret uhrattiin ja BM ja perna kerättiin ja jalostettiin yksisoluisiksi suspensioiksi myöhempiä kokeita varten. Tulokset saatiin 4 hiirellä ryhmää kohti.

Western blot

Kokosolulysaateille tehtiin Western blot-analyysi. Kanin polyklonaalinen Anti-KSRP-vasta-aine (6994-1; 1: 1000) ja anti-RUNX1-vasta-aine (ab35962; 1:1000) Epitomiikan (Abcam, Cambridge, MA) tai gapdh-vasta-aine (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100 000) käytettiin ensisijaisina vasta-aineina ja inkuboitiin 1× TBST: ssä, joka sisälsi 5% BSA: ta 2 tunnin ajan huoneenlämmössä (RT) jatkuvalla ravistuksella. Kun kalvot oli pesty 1× TBST: llä 15 minuutin ajan RT: ssä, niitä inkuboitiin HRP-konjugoidulla vuohien anti-rabbit secondary Ab: llä (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) 1 tunnin ajan RT: ssä. viimeisen pesuvaiheen jälkeen 1× tbst: llä 15 minuutin ajan RT: ssä, immunoreaktiiviset kaistat visualisoitiin enhanced chemiluminescence (ECL) – menetelmällä (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ilmoitetulla valotusajalla (”Western blot-valotusaika”). Kaikki poimimattomat Länsi blots löytyy täydentävä Fig. 11.

in vivo processing assay in seeprakala

alkiot kerättiin Tuebingen seeprakalan jalostussiirtokunnasta, jota säilytettiin 28 °C:ssa 14: 10 h: n valoisalla/pimeällä jaksolla ja nostettiin standardiolosuhteissa (China Zebrafish Resource Center). KSRP mRNA ja GFP-Pri-129 WT tai KSRP-sitoutumiskohdan mutantti mRNAs syntetisoitiin in vitro vastaavista linearisoiduista plasmideista käyttäen mMESSAGE mMACHINE Kit-sarjaa (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). KSRP mRNA: ta ja GFP-Pri-129_wt mRNA: ta (tai GFP-Pri-129_mut mRNA: ta) ruiskutettiin samanaikaisesti yksisoluisiin seeprakalan alkioihin. Alkiot vaiheistettiin 28 °C: ssa h.p.f. ja morfologiset kriteerit 52: n mukaisesti. Kuvat alkioista, jotka on lavastettu 4 ja 24 tunnin välein, hankittiin Zeiss SteReo Lumar V12: lla (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Saksa).

in vivo-prosessointimääritys 293TN-soluissa

293tn-soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä 24 tunnin ajan, kunnes ne saavuttivat ≈70-80% yhtymäkohdan. Solut transfektoitiin samanaikaisesti EGFP: n fuusio Pri-129_wt: n tai mutantti Pri-129-plasmidien, pcDNA4-RFP: n ja pCMV-KSRP-plasmidin kanssa Lipofektamiini 2000: lla (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut analysoitiin Zeiss-Fluoresenssimikroskoopilla 400× suurennoksella (Carl Zeiss Microscopy GmbH). RNA uutettiin myös prosessointitehokkuuden qPCR-analyysia varten havaitsemalla primäärinen miR-129 vs. kypsä miR-129. Fluoresenssin voimakkuus määritettiin Image-Pro Plus 6.0-ohjelmistolla (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ proximity ligation assay

in situ PLAs tehtiin Manufacturen protokollan (Sigma-Aldrich) mukaisesti. Rabbit anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) ja rabbit anti-dgcr8 (ab191875, Abcam; 1:50) yhdistettiin anti-KSRP:hen (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Kanada; 1:50) tai normaaliin kanin IgG-polyklonaaliseen vasta-aineeseen (12-370, Merck Millipore, Saksa; 1: 50) ensisijaisten vasta-aineiden osalta. Anti-KSRP ja normaali kanin IgG polyklonaalinen vasta-aine negatiivisena kontrollina. Ennen estoa 293T – tai HeLa-soluja kasvatettiin chambered dioilla (Sigma), jotka oli kiinnitetty 10% formaldehydiin, permeabiloitu 0,25% Triton X-100-PBS: llä. Solut analysoitiin Zeiss lsm780 confocal immunofluoresenssimikroskopialla (Zeiss, Saksa) ja sen jälkeen dekonvoluutiolla Huygens Essential version 16.05 kanssa (Scientific Volume Imaging, Alankomaat, http://svi.nl). PLA-pisteet solua kohti määritettiin blobfinder V3.2-kuvaanalyysiohjelmistolla (Uppsalan yliopisto, Tukholma, Ruotsi) ja Pla-pisteiden keskiarvo solua kohti laskettiin analysoimalla vähintään 100 solua.

bioinformatiikka-analyysi

kaikki paritetut loppulukemat trimmattiin adapterisarjaa varten käyttäen Trim Galore (versio 0.3.7) parametreilla ”-q 25 –stringency 5 –length 50 –coupled –phred33” ja suodatettiin heikkolaatuista sekvenssiä varten. Hg38 reference genome (GRCh38) ja gene annotation file (GTF-formaatti) ladattiin GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/)53: sta. TopHat54, 55 (Versio 2.1.0) käytettiin kohdistamaan suodatettu lukee hg38 genome reference genome oletusasetuksilla, ja Fpkms (Fragments Per Kilobase transkriptome per miljoona lukee) saatiin käyttämällä Cufflinks54 (Versio 2.2.1) oletusparametreilla. Ekspressiotasot estimoitiin käyttäen ominaisuuslukuja 56 (versio 1.5.0) parametreilla ”-T 7 –primary”, geenitason raakaluvut johdettiin geenin kaikkien isoformien vastaavien arvojen summasta.

EBSeq-HMM18: aa käytettiin analysoimaan geeniekspression eroja monosyyttien ja granulosyyttien erilaistumisen kolmen vaiheen välillä. On olemassa kaksi päävaihetta EBSeq-HMM saada eri tavoin ilmaistut (DE) geenit:

1. 1)

   havaitsemme DE-geenejä, jotka osoittivat merkittävää muutosta minkä tahansa kahden vaiheen välillä 0, 05: n (target false discovery rate, FDR) mukaisesti.

2. 2)

   geenien ryhmittely ekspressiopoluiksi, joiden posteriorinen maksimitodennäköisyys (PP) on suurempi kuin 0,5.

EBSeq-HMM: n avulla saimme DE-geenit ja sen vastaavat ilmentymispolut (eli ”ylös-alas”) monosyyttien (tai granulosyyttien) erilaistumisen 5, 10 ja 15 päivänä (lisätiedot 1). Ilmaisupolku ”ylös-alas” tarkoittaa, että geeni säädeltiin ylös 10.päivänä verrattuna 5. päivään, kun taas alas säädeltiin 15. päivänä verrattuna 10. päivään. Monotonisesti lisääntyneet (”Up-Up”) tai pienentyneet (”Down-Down”) geenit monosyyttien (tai granulosyyttien) erilaistumisen aikana valittiin jatkotutkimusta varten.

geenin ekspressiotasot arvioitiin käyttäen fpkm: ää, ja kaikkia geenejä, joiden fpkm ≥ 1 ilmaistuina geeneinä käytettiin tarkempaan analyysiin. RBP: n tiedot ladattiin RBPDB19-ja ATtRACT20-tietokannoista. Kehitimme R-skriptin (Supplementary Data 8) luokiteltuihin DE-geeneihin, joissa on ”Up-Up” tai ”Down-Down” – ekspressiopolkuja (Supplementary Data 2, 3) eri ilmentymämalleiksi.

lämpökartat piirrettiin R-pakettien ”pheatmap” – funktiolla ja Venndiagrammi piirrettiin funktiolla ” draw.pairwise.venn ”of R paketti ”VennDiagram”. K-means clustering suoritettiin funktion ’featmap’ ulostulolla ja klusterit saatiin funktion ’cutree’ avulla käyttämällä R.

Plasmidisähkösiirtoja

käytimme neonsiirtojärjestelmää valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti parantaaksemme plasmidisiirtojen tehokkuutta THP-1-soluissa RNA-seq-analyysissä. Solut sähköistettiin plasmideilla (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP tai pSIH-H1-SH-KSRP). 1 × 107 THP-1-tai NB4-solujen elektroporaatioparametrit olivat 1350 V: n pulssi, 10 ms: n pulssin leveys ja 4 pulssia käyttäen 10 µL: n kärkeä. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia myöhemmin elektransfektiotehokkuus havaittiin Western blotting-eli qPCR-tekniikalla.

Rescue assets

sen varmistamiseksi, että KSRP edistää pri-miR-129-käsittelyä myelooisten sukujuurten erilaistumisen säätelemiseksi, THP-1-solut transfektoitiin pEGFP-KSRP: llä lipofektamiini 2000: lla, ja 24 tuntia myöhemmin solut transfektoitiin mir-129-inhibiittorilla. NB4-solut transfektoitiin si-KSRP: llä 100 nM: n lopullisena pitoisuutena dharmfect1-menetelmällä, ja 24 tuntia myöhemmin solut transfektoitiin mir-129-imitaatiolla. Jotta mir-129-kohde-RUNX1 voitaisiin vahvistaa myelooisten sukujuurten erilaistumista sääteleväksi, THP-1-ja NB4-solut transfektoitiin si-RUNX1: llä ja Mir-129-estäjällä tai niiden kontrolleilla Neonsiirtojärjestelmän avulla. Tämän jälkeen soluja stimuloitiin PMA: lla tai ATRALLA vielä 48 tunnin ajan ennen kuin ne otettiin talteen myöhempiä analyysejä varten. Virtaussytometrialla analysoitiin CD14-ekspressio THP-1-soluissa, joissa oli käynnissä monosyyttinen erilaistuminen, ja CD11b-ekspressio NB4-soluissa, joissa suoritettiin granulosyyttinen erilaistuminen.

valotusaika Western blotille

suurin osa Western blotista on kehitetty Tanon 5200 automatic digital gel image analysis Systemillä (Tanon, Shanghai, Kiina), ja gapdh: n valotusaika on 150-350 ms. Fig: ssä. 2A, KSRP: llä näytteiden altistusaika monosyyttisessä differentiaatiossa on 20 s; ksrp: llä näytteiden altistusaika granulosyyttisessä differentiaatiossa on 200 ms. Kuvassa. 2B, KSRP: n valotusaika on 20 s. Kuvassa. 4F-h, KSRP: n valotusaika on 60 s. Kuvassa. 5B, valotusaika on 60 s droshalle, DGCR8: lle ja KSRP: lle. Kuvassa. 6J, k, valotusaika on RUNX1: llä 90 s. Kuvassa. 7G, valotusaika on 90 s RUNX1: lle ja KSRP: lle. Kuvassa. 7H, valotusaika on 30 s RUNX1: lle ja KSRP: lle. In Supplementary Fig. 2A, näytteiden altistusaika MONOSYYTTISELLÄ differentiaatiolla on KSRP: llä 3 s; granulosyyttisellä differentiaatiolla näytteiden altistusaika KSRP: llä on 300 ms. In Supplementary Fig. 4A, e, f, KSRP: n valotusaika on 60 s. In Supplementary Fig. 7M, valotusaika on 10 s ja 90 s RUNX1: lle THP-1: ssä ja NB4: ssä. In Supplementary Fig. 8A, valotusaika on 60 s RUNX1: lle.

muiden kuvien osalta, jotka osoittavat manuaalisen altistuksen tuloksen (kuva. 2d, i; täydentävä Kuva. 7n), gapdh: n valotusaika on arviolta 1 s. Kuvassa. 2D, altistusaika on 30 s KSRP: llä PMA: n indusoimissa näytteissä ja 10 s KSRP: llä Atran indusoimissa näytteissä. Kuvassa. 2I, KSRP: n valotusaika on 60 s. In Supplementary Fig. 7N, valotusaika on 90 s RUNX1: lle.

monosyyttien ja neutrofiilien eristäminen perifeerisestä verestä

tietoon perustuva suostumus saatiin Kiinan lääketieteen Akatemian Institutional Review Board-lautakunnan mukaisesti. Ihmisen monosyytit ja neutrofiilit eristettiin terveiden luovuttajien perifeerisestä verestä 3%: ssa dekstraania, ja ne eristettiin percoll gradientin sentrifugoinnilla, jota seurasi puhdistus CD14-mikrobeilla (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Saksa) tai Easysep Human neutrofiilien Rikastuspaketilla (#19257, Stemcell Technologies, Kanada). Kun saadut CD14-positiiviset solut oli lajiteltu CD14-mikrobeilla, ne pinnoitettiin T-25-pulloihin ja niitä viljeltiin 4-6 tunnin ajan 37 °C: n lämpötilassa, kunnes kiinnittyneet monosyytit kerättiin kaapimalla.

tilastollinen analyysi

kaikkien tutkimusten kohdalla n ryhmää kohti on kuviolegendan mukainen. Kaikki tiedot analysoitiin Grappad Prism 5.0-ohjelmistolla (Grappad Software, Inc., USA)ja esitetään muodossa ± SD. Erot koe-ja kontrolliryhmien välillä analysoitiin kaksihäntäisen oppilaan t-testillä. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin arvolla P < 0, 05. Otoksen koon määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä. Kaikki kokeet tehtiin vähintään kolmella biologisella kopiolla. Valitsimme sopivat testit tietojen jakautumisen mukaan. Kokeita ei satunnaistettu, emmekä sulkeneet pois yhtään näytettä. Tutkijat eivät sokaistuneet jakamisesta kokeiden ja tulosten arvioinnin aikana.

tietojen saatavuus

miRNA-ja pri-miR-RNA-sekvensointitiedot on talletettu GEO-tietokantaan liittymiskoodilla GSE87318. MRNA-sekvensointia koskevat tiedot on myös talletettu GEO-tietokantaan liittymiskoodilla GSE87088. Lähde tiedot Fig. 1c-e on toimitettu lisätietoina 1-4. Lähde tiedot Fig. 2b, c on toimitettu täydentävinä tietoina 5, 6. Kaikki muut tämän tutkimuksen tuloksia tukevat tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta tekijältä.