KSRP spécifie la différenciation monocytaire et granulocytaire par la régulation de la biogenèse miR-129 et de l’expression RUNX1

Différenciation monocytaire et granulocytaire des lignées cellulaires

La lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 et la lignée cellulaire promyélocytaire NB4 et HL-60 ont été achetées d’ATCC (Manassas, USA) et maintenu dans RPMI1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (Gibco, Carlsbad, CA). Les cellules ont été criblées par PCR pour l’authentification et par des tests d’immunofluorescence pour être exemptes de contamination par mycoplasmes. La différenciation monocytaire des cellules THP-1 et HL-60 a été induite par le traitement des cellules avec une PMA de 50 nM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne) pendant 0, 24, 48 et 72 h. La différenciation granulocytaire des cellules NB4 et HL-60 a été induite par le traitement des cellules avec un ATRA de 1 µM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne). Aucune lignée cellulaire utilisée dans cette étude n’a été trouvée dans la base de données de lignées cellulaires communément mal identifiées qui est maintenue par le biosample ICLAC et NCBI. Des lignées cellulaires ont été testées pour la contamination par les mycoplasmes, mais n’ont pas été ré-authentifiées.

Tri CD34 + HPCs

Le sang de cordon ombilical humain (UCB) a été obtenu à partir d’accouchements normaux à terme à l’Hôpital de l’Union de Pékin, et la moelle osseuse (BM) de donneurs normaux a été obtenue à partir du 307e Hôpital de l’Armée populaire de libération chinoise. Le consentement éclairé et l’approbation du Comité d’éthique de la recherche ont été obtenus. Des fractions de cellules mononucléées (MNC) ont été isolées d’UCB et de BM en utilisant un gradient de densité de Percoll (d = 1,077; Amersham Biotech, Allemagne). Les cellules CD34+ ont été enrichies à partir de MNC en utilisant la sélection immunomagnétique positive (Kit CD34+ MultiSort, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Allemagne).

Différenciation monocytaire des CHP

Les cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ enrichies (CHP) ont été cultivées dans un IMDM à haute teneur en glucose additionné de sérum fœtal bovin à 30% (Hyclone, Logan, Utah), 1% de BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng/mL d’IL-3 humain recombinant, 100 ng/mL de SCF humain recombinant, 50 ng/mL de M- LCR, 100 ng / mL de FLT3 humain recombinant, 1 ng / mL d’IL-6 humain recombinant, 60 mg / mL de pénicilline et 100 mg / mL de streptomycine pour induire la différenciation des monocytes. Les cytokines ont été achetées à Peprotech (Rocky Hill, New Jersey). Les cellules ont été récoltées tous les 3 à 5 jours. Pour les analyses morphologiques, les cellules ont été étalées sur des lames de verre, fixées dans du méthanol 10 min, colorées avec May-Grünwald / Giemsa, et analysées à un grossissement de 400x au microscope (Nikon TE2000, Japon) équipé d’un appareil photo numérique.

Différenciation granulocytaire des HPCs

Les cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ enrichies (HPCs) ont été cultivées dans un IMDM à haute teneur en glucose additionné de sérum de bovin fœtal à 30% (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng/mL IL-3 humain recombinant, 100 ng/mL SCF humain recombinant, 20 ng/mL G humain recombinant – LCR, 10 ng / mL d’IL-6 humaine recombinante, 60 mg / mL de pénicilline et 100 mg / mL de streptomycine pour induire la différenciation des granulocytes. Les cytokines ont été achetées à Peprotech (Rocky Hill, New Jersey). Les cellules ont été récoltées tous les 3 à 5 jours. Les analyses morphologiques ont été effectuées de la même manière que la différenciation monocytaire.

Oligonucléotides et constructions

Des imitations de miR-129 (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), des inhibiteurs de miARN (anti-129) et des molécules témoins négatives (NC) ont été obtenues à partir de Dharmacon (Austin, TX) et des cellules ont été transfectées avec une concentration finale de ces constructions de 100 nM en utilisant DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). Les ARNSI (spécifiquement pour KSRP et RUNX1) et les ARNSI témoins (Si-Con) ont été synthétisés par Dharmacon et les cellules ont été transfectées avec des ARNSI de 100 nM à l’aide de DharmFECT1.

Pour la surexpression de KSRP, le clone d’ADNc ORF humain de KSRP (NM_003685.2) (pEGFP-KSRP) a été acheté à Addgene (Addgene, MA). Pour le knockdown de KSRP, l’ARN-SH de KSRP a été cloné dans le vecteur pSIH-H1 en aval du promoteur H1 (lenti-sh_KSRP) ou directement acheté sous forme de constructions lentivirales (TL311984, Origene, Rockville, MD). Pour la surexpression du pri-129-1, une construction de type sauvage de 700 pb a été clonée dans le vecteur pCMV6 (129_WT) ou dans le plasmide pMIRNA1 (lenti-129). Les sites mutants de liaison au KSRP dans pri-129-1 (129_MUT1, 129_MUT2, 129_MUT3, 129_MUT4 et 129_MUTF) ont également été créés dans des vecteurs pCMV6. Pour le knockdown miR-129, miRZIP-129 et miRZIP-control ont été achetés auprès de System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Pour la surexpression de RUNX1, RUNX1 ORF a été cloné dans le vecteur pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

Pour le test du gène rapporteur des cibles miR-129, la séquence complémentaire inverse de miR-129 a été insérée dans le rapporteur pMIR en aval du gène luciférase de la luciole pour générer la construction rapporteuse positive (129_positive). Le 3′-UTR de l’ARNm RUNX1 humain a été amplifié et cloné dans le même rapporteur pMIR en aval du gène luciférase de luciole pour former le rapporteur de type sauvage (RUNX1_WT). Des mutations des sites de liaison miR-129 dans le 3′-UTR des séquences d’ARNm RUNX1 humaines ont été créées à l’aide du kit de Mutagenèse dirigée par site QuickChange (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 et RUNX1_Mut3). Les cellules ont été transfectées avec ces constructions en utilisant soit la Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pour les cellules 293TN, soit la Lipofectamine LTX & PLUS pour les cellules THP-1 et les cellules NB4, selon les protocoles du fabricant. Toutes les amorces sont énumérées dans les données supplémentaires 7.

Production de Lentivirus

Le kit d’emballage de lentivirus approprié a été acheté auprès de System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) et utilisé conformément aux directives du fabricant. Les particules virales récoltées (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 et lenti-GFP) ont été ajoutées aux cellules CD34+ HPCs, THP-1 ou NB4, puis les cellules ont été lavées avec IMDM après 24 heures et plaquées pour des expériences ultérieures.

Séquençage profond des miARN

Cellules THP-1 ont été électroporées avec du pEGFP-KSRP ou du pEGFP à l’aide du système de transfection au néon, puis triées par FACS pour collecter les cellules GFP-positives. De petits ARN ont été isolés de l’ARN total avec le kit d’isolation des miARN mirVana (Ambion, Austin, TX), selon les instructions du fabricant. De petites banques d’ARN et le séquençage des miarns ont été réalisés par Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, Chine) à l’aide d’un Illumina HiSeq2000 (Illumina, États-Unis). Les données de séquençage ont été filtrées, les profils d’expression ont été construits et les lectures de dimères de l’adaptateur ont été séparées des lectures de miARN déjà identifiées dans miRbase 17.0. Les données RNA-seq ont été analysées par Genergy Bio et une liste des MIARN dont l’expression a été augmentée lors de la surexpression de KSRP est présentée dans les Données supplémentaires 5, 6.

Séquençage profond de l’ARN enrichi en Poly(A)

L’ARN total a été extrait à l’aide du réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), selon les instructions du fabricant, pour préparer la banque d’ARN-seq enrichi en poly(A). Des banques d’ARN enrichies en Poly(A) et en ARN profond-seq ont été adaptées à Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) et ont été réalisées par Genergy Bio. Une liste complète des ARNMI primaires dont l’expression a diminué lors de la surexpression de KSRP est répertoriée dans les données supplémentaires 5, 6.

Analyse de la COURSE

Pour identifier la longueur totale de la course primaire-129-1, 5′ et 3′, des réactions ont été effectuées sur l’ARN total des cellules THP-1 en utilisant le Kit de COURSE Complet de 5′ et le Kit de COURSE complet de 3′ (TaKaRa, Dalian, Chine) selon le manuel du fabricant. Les amorces utilisées pour l’expérience RACE sont énumérées dans les données supplémentaires 7.

Test de report de la luciférase

Pour les analyses mécanistiques fonctionnelles de miR-129-1, nous avons prédit plusieurs cibles de miR-129-1 à l’aide des logiciels de bioinformatique Targetscan et Miranda et validé les candidats avec le test de report de la luciférase. Les cellules 293TN ont été co-transfectées avec 0,4 µg de la construction rapporteuse, 0,015 µg du vecteur témoin pRL-TK et 5 pmol du mimique miR-129 ou mimique témoin négatif. Après 48 h, les cellules ont été récoltées et dosées avec le Kit de dosage à double Luciférase (Promega, Madison, WI), selon les instructions du fabricant. Tous les tests de transfection ont été effectués en trois exemplaires.

Essai de traitement in vitro

L’essai de traitement a été réalisé à l’aide d’une cellule HeLa NE de 10 mg/mL. Pour l’épuisement du KSRP, dix microlitres d’anticorps KSRP ont été ajoutés à 1 mg de NE cellulaire HeLa et un anticorps IgG a été ajouté comme témoin. Après une incubation de 30 min à 4 °C, le complexe de protéines et d’anticorps KSRP a été immunoprécipité avec des billes de protéine A (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Le surnageant est l’extrait nucléaire appauvri en KSRP (ΔKSRP-NE). Les pri-129-1 (129_WT) et pri-129-1 de type sauvage marqué par isotope 700-nt contenant les quatre mutants du site de liaison au KSRP (129_Mut) ont été préparés par transcription in vitro standard avec l’ARN polymérase T7 en présence de -UTP en utilisant les constructions 129_WT et 129_Mut. 129_WT et 129_Mut ont été incubés avec des cellules HeLa NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) pendant 30 min à 37 °C en présence de KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), et 4 pmol (4×)). Les mélanges réactionnels ont été soumis à une extraction au phénol : chloroforme, précipitation et électrophorèse sur gel dénaturant, suivie d’une autoradiographie.

Le test de traitement de sauvetage a été effectué. Brièvement, 20 µL de ΔKSRP-NE ont été incubés avec 1 pmol de miR-129 primaire marqué-UTP et différentes quantités de KSRP (0,5 µg) pendant différents temps (15, 40 et 60 min) à 37 ° C. Les mélanges réactionnels ont été traités avec de la protéinase K pendant 30 min à 37 ° C, puis soumis à du phénol:extraction du chloroforme, précipitation et électrophorèse sur gel dénaturant, suivie d’une autoradiographie. Tous les gels d’ARN non recadrés se trouvent dans la Fig. 12.

Northern blot

Un total d’échantillons d’ARN de 40 µg a été chargé et exécuté sur des gels de polyacrylamide dénaturants (urée) à 12%, puis transféré sur des membranes Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). L’hybridation a été réalisée avec une sonde miR-129-5p pré ou mature marquée par la digoxigénine (DIG), une nuit à 42 °C. L’arNSN U6 et l’ARNr ont servi de contrôles de charge pour les miARN pré-, matures ou primaires, respectivement. Le niveau d’expression a été mesuré par normalisation à l’expression de l’arNSN U6 ou de l’ARNr. Les séquences de sondes oligonucléotidiques sont énumérées dans les Données supplémentaires 7. L’expression des miARN a été quantifiée par le logiciel Image J. Tous les Northern blot non recadrés peuvent être trouvés dans la Fig. 12.

Test d’immunoprécipitation à ARN

Des quantités égales de cellules THP-1 ou NB4 ont été récoltées dans du PBS glacé. Ensuite, les pastilles cellulaires ont été remises en suspension dans 1 mL de tampon de lyse B (Tris 50 mM, pH 7.4, NaCl de 150 mm, Igépal à 0,05%, PMSF de 1 mM, aprotinine de 1 mM, leupeptine de 1 mM et complexes ribonucléosidiques de vanadyle de 2 mM (VRC)) et sonication douce. Après centrifugation des lysats à 12 000 tr/min pendant 15 min, les surnageants ont été pré-nettoyés avec des Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) dans le tampon de lyse B avec 10 µg d’ARNt de levure (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne). Ensuite, les lysats pré-nettoyés ont été utilisés pour le RIP avec soit un anticorps anti-KSRP (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500), soit une IgG d’isotype de lapin (12-370, Merck Millipore, Allemagne; 1:500) comme témoin pendant 4 h à 4 °C. Les billes ont été lavées trois fois avec du tampon de lyse B, le dernier lavage contenant un désoxycholate de sodium supplémentaire à 0,5%, suivi d’une extraction avec du tampon C (Tris 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, β-mercaptoéthanol 12% et glycérol 20%) à température ambiante pendant 10 min. L’ARN immunoprécipité a été extrait avec du Trizol et du phénol-chloroforme. Pour la RT-PCR, chaque échantillon d’ARN a été traité avec de la DNase I (Ambion, kit TM sans ADN). Ensuite, des quantités égales ont été transcrites inverse avec le Kit de transcription inverse d’ADNc Haute Capacité (Invitrogen, Carlsbad, CA). L’enrichissement en fold des ARN par KSRP a été mesuré par électrophorèse qPCR et gel d’agarose. Les amorces utilisées pour les expériences RIP-PCR sont énumérées dans les Données supplémentaires 7.

L’immunoprécipitation des complexes protéine-ARN

La purification par affinité de la protéine de liaison au maltose (MBP) a été utilisée pour identifier les protéines associées aux MIARN primaires. Le plasmide d’expression de MS2-MBP a été un don du Dr Lingling Chen (Académie chinoise des Sciences) et le MS2-MBP a été exprimé et purifié à partir d’E. coli à l’aide d’un protocole du laboratoire Steize (Université de Yale). Trois sites de liaison aux protéines de la couche MS2 (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3′) ont été insérés en aval de la séquence du gène pri-129-1 ou des séquences mutantes du site de liaison au KSRP pri-129-1. Les cellules 293TN ont été transfectées avec des constructions contenant du MS2 pour obtenir des protéines associées aux MIARN primaires, et 10 millions de cellules ont été utilisées pour chaque test d’immunoprécipitation. Les cellules ont été récoltées 48 h après la transfection et soumises à une analyse d’extraction de l’ARN. En bref, les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS glacé avant d’être récoltées dans 10 mL de PBS glacé par grattage. Ensuite, les pastilles cellulaires ont été remises en suspension dans 1 mL de tampon IP (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mm, Igépal 0,05%, PMSF 1 mM, cocktail inhibiteur de protéinase), et soumises à 2 cycles de sonication douce et centrifugées pour obtenir des extraits cellulaires. Le surnageant a d’abord été incubé avec du MS2-MBP pendant 1 heure, puis des billes de résine d’amylose (NEB) pendant encore 1 heure à 4 C. Les billes ont été lavées cinq fois avec du tampon IP avec de la roche douce et un dernier lavage avec du tampon IP fourni avec du NaCl supplémentaire de 150 mM. Les composants protéiques ont finalement été élués à partir de billes avec du tampon IP additionné de Maltose de 12 mM, et ont été vérifiés par WB avec les anticorps primaires suivants: anti-Drosha de lapin (ab12286, Abcam; 1: 1000), anti-DGCR8 de lapin (ab191875, Abcam; 1: 1000), anti-KSRP de lapin (6994-1, Epitomics; 1: 1000,) et anti-GAPDH de souris (60004-1-Ig , Proteintech; 1:1 000 000).

Essai de protection de la RNase H

Une réaction standard de protection de la RNase H a été réalisée dans un volume total de 25 µL contenant 1 pmol de protéine KSRP, 1 pmol d’ARN marqué-UTP, 20 µg/mL d’oligonucléotides d’ADN, 12 mm HEPES (pH 8,0), 60 mm MgCl2, 1 mm DTT, 20 U de RNASINE (40 U/µL, Promega, Madison, WI) , et 1 U d’E. coli RNase H. Pour le contrôle, une réaction avec la quantité correspondante d’ARN marqué déprotéinisé-UTP et les mêmes conditions ioniques que l’extrait a été préparée et incubée à 25 °C pendant 15 min. La réaction a été terminée par ajout de 75 µL de H2O distillé, 100 µL de tampon 2 × PK et 4 µL de protéinase K (10 mg/mL), et de l’ARN a été préparé comme décrit dans le « qPCR » pour analyser les fragments d’ARN. L’ARN a été remis en suspension dans 25 µL de tampon chargé en gel d’urée (EDTA de 5 mM, glycérol à 10 % (v/v), Xylène Cyanol FF à 0,05 % (p/v), Bleu de bromophénol à 0,05 % (p/v) et formamide désionisé à 50%) et séparé sur gels dénaturants à l’urée, suivi d’une autoradiographie.

qPCR

L’ARN total a été extrait des cellules et des tissus à l’aide du réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) suivi d’une digestion par la DNase I, selon les instructions du fabricant. L’ARN a été quantifié en mesurant l’absorbance à 260 nm et transcrit en inverse. La PCR quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée à l’aide du système de PCR en temps réel Bio-Rad IQ5 conformément aux instructions du fabricant. Les amorces utilisées pour la transcription inverse et la qPCR ont été présentées dans les données supplémentaires 7. Les données ont été normalisées en utilisant l’ARNm endogène de la GAPDH et l’arNSN U6. La méthode 2-ΔΔCT a été utilisée pour analyser les données de PCR.

Cytométrie en flux

Les cellules ont été récoltées aux moments indiqués et lavées deux fois avec du PBS/0,5% de BSA à 4 °C pour bloquer les récepteurs Fc. Les HPC CD34+ transduites ont été colorées avec des anticorps anti-CD14 (clone: 61D3) ou anti-CD11B (clone : ICRF44) conjugués à l’APC (eBioscience, San Diego, CA). Les cellules BM de souris ont été colorées avec un anticorps anti-CD33 conjugué au PE (clone: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). La cytométrie en flux a été réalisée sur un cytomètre en flux C6 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Les données ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo (version 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

Souris et tests de transplantation

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées avec l’approbation du Comité d’éthique de la recherche du Collège médical de l’Union de Pékin. Dix millions de HPC CD34+ infectés par des témoins lenti-sh-KSRP, lenti-129 ou lenti-GFP ont été lavés et remis en suspension dans du PBS, puis injectés dans la veine latérale de la queue de souris réceptrices NOD/SCID femelles âgées de 4 à 6 semaines irradiées aux rayons X à une dose de 250 cGy. Quatre semaines après la transplantation des HPC CD34 +, les souris ont été sacrifiées et les BM et les spleens ont été collectés et transformés en suspensions unicellulaires pour les expériences suivantes. Les résultats ont été obtenus à partir de 4 souris par groupe.

Western blot

Des lysats de cellules entières ont été soumis à une analyse Western blot. Anticorps polyclonal anti-KSRP de lapin (6994-1; 1:1000) et anticorps anti-RUNX1 (ab35962; 1:1000) provenant d’Epitomics (Abcam, Cambridge, MA), ou d’un anticorps GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL;1:100 000) ont été utilisés comme anticorps primaires et incubés dans 1× TBST contenant 5% de BSA pendant 2 h à température ambiante (RT) avec agitation continue. Après des lavages avec 1× TBST pendant 15 min à TA, les membranes ont été incubées avec un Ab secondaire anti-lapin de chèvre conjugué HRP (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) pendant 1 h à TA. Après une dernière étape de lavage avec 1× TBST pendant 15 min à TA, les bandes immunoréactives ont été visualisées par chimiluminescence améliorée (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) au temps d’exposition indiqué (« Temps d’exposition pour Western blot »). Tous les western blots non coupés peuvent être trouvés dans la Fig. 11.

Essai de traitement in vivo chez le poisson zèbre

Des embryons ont été collectés dans une colonie reproductrice en laboratoire de poisson zèbre de Tuebingen logée à 28 ° C sur un cycle lumière/obscurité de 14:10 h et élevés dans des conditions standard (China Zebrafish Resource Center). Les ARNM KSRP et les ARNM mutants du site de liaison au GFP-Pri-129 WT ou au site de liaison au KSRP ont été synthétisés in vitro à partir de plasmides linéarisés correspondants à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). L’ARNm KSRP et l’ARNm GFP-Pri-129_WT (ou ARNm GFP-Pri-129_Mut) ont été co-injectés dans des embryons de poisson-zèbre à un stade cellulaire. Les embryons ont été mis en scène à 28 °C selon les critères h.p.f. et morphologiques52. Des images d’embryons mis en scène à 4 hpf et 24 hpf ont été acquises à l’aide d’un Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Allemagne).

Essai de traitement in vivo dans des cellules 293TN

Des cellules 293TN ont été cultivées dans des plaques à 6 puits pendant 24 h jusqu’à ce qu’elles atteignent ≈70-80% de confluence. Les cellules ont été co-transfectées avec les plasmides de fusion EGFP Pri-129_WT ou mutant Pri-129, pcDNA4-RFP et le plasmide pCMV-KSRP en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été analysées au Microscope à fluorescence Zeiss à un grossissement de 400× (Carl Zeiss Microscopy GmbH). L’ARN a également été extrait pour une analyse qPCR de l’efficacité du traitement en détectant le miR-129 primaire par rapport au miR-129 mature. L’intensité de fluorescence a été quantifiée à l’aide du logiciel Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

Test de ligature de proximité In situ

Les PLA in situ ont été réalisées selon le protocole de fabrication (Sigma-Aldrich). L’anti-Drosha de lapin (ab12286, Abcam; 1:50) et l’anti-DGCR8 de lapin (ab191875, Abcam; 1:50) ont été associés à l’anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canada; 1:50) ou à l’anticorps polyclonal IgG de lapin normal (12-370, Merck Millipore, Allemagne; 1:50) pour les anticorps primaires. Anticorps polyclonal anti-KSRP et IgG de lapin normal comme témoin négatif. Avant le blocage, des cellules 293T ou HeLa ont été cultivées sur des lames chambrées (Sigma), fixées dans du formaldéhyde à 10%, perméabilisées avec du Triton X-100-PBS à 0,25%. Les cellules ont été analysées par microscopie à immunofluorescence confocale Zeiss LSM780 (Zeiss, Allemagne) suivie d’une déconvolution avec Huygens Essential version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Pays-Bas, http://svi.nl). Les points PLA par cellule ont été quantifiés avec le logiciel d’analyse d’images BlobFinder V3.2 (Université d’Uppsala, Stockholm, Suède) et le nombre moyen de points PLA par cellule a été calculé en analysant un minimum de 100 cellules.

Analyse bioinformatique

Toutes les lectures d’extrémité appariées ont été rognées pour la séquence de l’adaptateur en utilisant Trim Galore (version 0.3.7) avec les paramètres « -q 25strstringency 5lengthlength 50pairedpairedphphred33 » et filtrées pour la séquence de faible qualité. Le génome de référence hg38 (GRCh38) et le fichier d’annotation des gènes (format GTF) ont été téléchargés à partir de la version 24 du code GENCODE (http://www.gencodegenes.org/) 53. TopHat54,55 (Version 2.1.0) a été utilisé pour aligner les lectures filtrées sur le génome de référence du génome hg38 avec des paramètres par défaut, et des FPKMs (Fragments par transcriptome Kilobase par million de lectures) ont été obtenus en utilisant Cufflinks54 (Version 2.2.1) avec des paramètres par défaut. Les niveaux d’expression ont été estimés à l’aide du nombre de Caractéristiques56 (version 1.5.0) avec les paramètres « -T 7 –primaire », le nombre brut au niveau du gène a été dérivé de la somme des valeurs correspondantes pour toutes les isoformes d’un gène.

Les EBSeq-HMM18 ont été utilisés pour analyser les différences d’expression des gènes entre trois étapes de différenciation des monocytes et des granulocytes, respectivement. Il y a deux étapes principales pour que EBSeq-HMM obtienne des gènes (DE) exprimés différentiellement:

1. 1)

   Détection de gènes DE qui ont montré un changement significatif entre deux étapes quelconques sous un taux de fausse découverte cible (FDR) de 0,05.

2. 2)

   Regroupement des gènes DE dans des voies d’expression avec la probabilité postérieure maximale (PP) supérieure à 0,5.

En utilisant EBSeq-HMM, nous avons obtenu des gènes DE et ses voies d’expression correspondantes (c’est-à-dire « Haut-Bas ») aux jours 5, 10 et 15 de différenciation des monocytes (ou granulocytes) (Données supplémentaires 1). Le chemin d’expression « Haut-bas » représente qu’un gène a été régulé à la hausse au jour 10 par rapport au jour 5, tandis qu’il a été régulé à la baisse au jour 15 par rapport au jour 10. Des gènes monotones augmentés (« Up-Up ») ou diminués (« Down-Down »), au cours de la différenciation des monocytes (ou des granulocytes) ont été choisis pour une analyse plus approfondie.Les niveaux d’expression des gènes

ont été estimés à l’aide du FPKM, et tous les gènes avec le FPKM ≥ 1 comme gènes exprimés ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Les informations sur la RBP ont été téléchargées à partir des bases de données RBPDB19 et ATtRACT20. Nous avons développé un script R (Données supplémentaires 8) pour classer les gènes DE avec des chemins d’expression « Up-Up » ou « Down-Down » (Données supplémentaires 2, 3) dans différents modèles d’expression.

Les cartes thermiques ont été dessinées à l’aide de la fonction ‘pheatmap’ des paquets R ‘pheatmap’ et le venndiagramme a été dessiné à l’aide de la fonction ‘draw.par paire.venn’ du paquet R ‘VennDiagram’. Le regroupement des moyennes-K a été réalisé avec la sortie de la fonction ‘pheatmap’ et les clusters ont été obtenus avec la fonction ‘cutree’ en utilisant R.

Électrotransfections plasmidiques

Nous avons utilisé le système de transfection au néon selon les instructions du fabricant (Invitrogen, Carlsbad, CA) pour améliorer l’efficacité de transfection plasmidique dans les cellules THP-1 pour l’analyse ARN-seq. Les cellules ont été électrotransfectées avec des plasmides (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP ou pSIH-H1-sh-KSRP). Les paramètres d’électroporation pour les cellules 1 × 107 THP-1 ou NB4 étaient une impulsion de 1350 V, une largeur d’impulsion de 10 ms et 4 impulsions utilisant une pointe de 10 µL. Quarante-huit heures plus tard, l’efficacité de l’électrotransfection a été détectée par Western blot ou qPCR.

Tests de sauvetage

Pour valider que le KSRP favorise le traitement pri-miR-129 pour réguler la différenciation de la lignée myéloïde, des cellules THP-1 ont été transfectées avec du pEGFP-KSRP en utilisant la lipofectamine 2000, et 24 h plus tard, les cellules ont été transfectées avec un inhibiteur de miR-129. Les cellules NB4 ont été transfectées avec du si-KSRP à une concentration finale de 100 nM en utilisant DharmFECT1, et 24 h plus tard, les cellules ont été transfectées avec un mimique miR-129. Pour valider que MIR-129 cible RUNX1 pour réguler la différenciation de la lignée myéloïde, les cellules THP-1 et NB4 ont été transfectées avec si-RUNX1 et un inhibiteur de miR-129 ou leurs contrôles par le système de transfection au néon. Les cellules ont ensuite été stimulées par PMA ou ATRA pendant 48 h supplémentaires avant d’être récoltées pour des analyses ultérieures. L’expression de CD14 dans les cellules THP-1 subissant une différenciation monocytaire et l’expression de CD11b dans les cellules NB4 subissant une différenciation granulocytaire ont été analysées par cytométrie en flux.

Temps d’exposition pour le Western blot

La majeure partie du Western blot a été développée par le système d’analyse automatique d’images en gel numérique Tanon 5200 (Tanon, Shanghai, Chine), et le temps d’exposition du GAPDH est de 150 à 350 ms. Sur la Fig. 2a, le temps d’exposition des échantillons le long de la différenciation monocytaire est de 20 s pour le KSRP; le temps d’exposition des échantillons le long de la différenciation granulocytaire est de 200 ms pour le KSRP. Sur la Fig. 2b, le temps d’exposition est de 20 s pour KSRP. Sur la Fig. 4f-h, le temps d’exposition est de 60 s pour le KSRP. Sur la Fig. 5b, le temps d’exposition est de 60 s pour Drosha, DGCR8 et KSRP. Sur la Fig. 6j, k, le temps d’exposition est de 90 s pour RUNX1. Sur la Fig. 7g, le temps d’exposition est de 90 s pour RUNX1 et KSRP. Sur la Fig. 7h, le temps d’exposition est de 30 s pour RUNX1 et KSRP. Sur La Fig. 2a, le temps d’exposition des échantillons le long de la différenciation monocytaire est de 3 s pour le KSRP; le temps d’exposition des échantillons le long de la différenciation granulocytaire est de 300 ms pour le KSRP. Sur La Fig. 4a, e, f, le temps d’exposition est de 60 s pour KSRP. Sur La Fig. 7m, le temps d’exposition est de 10 s et 90 s pour RUNX1 dans THP-1 et NB4, respectivement. Sur La Fig. 8a, le temps d’exposition est de 60 s pour RUNX1.

Pour les autres images montrant le résultat de l’exposition manuelle (Fig. 2d, i; Fig. supplémentaire. 7n), le temps d’exposition pour la GAPDH est estimé à 1 s. Sur la Fig. 2d, le temps d’exposition est de 30 s pour le KSRP dans les échantillons induits par la PMA et de 10 s pour le KSRP dans les échantillons induits par l’ATRA. Sur la Fig. 2i, le temps d’exposition est de 60 s pour KSRP. Sur La Fig. 7n, le temps d’exposition est de 90 s pour RUNX1.

Isolement des monocytes et des neutrophiles du sang périphérique

Le consentement éclairé a été obtenu conformément au Conseil d’examen institutionnel de l’Académie Chinoise des Sciences médicales. Des monocytes et des neutrophiles humains ont été isolés du sang périphérique de donneurs sains dans du dextrane à 3% et ont été isolés par centrifugation par gradient de percoll suivie d’une purification par microbilles CD14 (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Allemagne) ou par Kit d’enrichissement en neutrophiles humains EasySep (#19257, Stemcell Technologies, Canada). Après tri par microbilles CD14, les cellules positives CD14 obtenues ont été plaquées dans des flacons T-25 et cultivées pendant 4-6 h à 37 °C jusqu’à ce que les monocytes adhérents soient collectés par raclage.

Analyse statistique

Pour toutes les études, n par groupe est tel qu’indiqué dans la légende de la figure. Toutes les données ont été analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., États-Unis) et présenté comme moyen ± SD. Les différences entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins ont été analysées à l’aide du test t de Student à deux queues. La signification statistique a été acceptée à P < 0,05. Aucune méthode statistique n’a été utilisée pour prédéterminer la taille de l’échantillon. Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins trois répliques biologiques. Nous avons choisi les tests appropriés en fonction des distributions de données. Les expériences n’ont pas été randomisées et nous n’avons exclu aucun échantillon. Les chercheurs n’ont pas été aveuglés par l’allocation lors des expériences et de l’évaluation des résultats.

Disponibilité des données

Des données de séquençage d’ARN miARN et pri-miR-ARN ont été déposées dans la base de données GEO sous le code d’adhésion GSE87318. Les données pour le séquençage des ARNm ont également été déposées dans la base de données GEO sous le code d’adhésion GSE87088. Données sources pour la Fig. 1c-e ont été fournies à titre de données supplémentaires 1-4. Données sources pour la Fig. 2b, c ont été fournis à titre de données supplémentaires 5, 6. Toutes les autres données à l’appui des résultats de cette étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande.