a Ksrp meghatározza a monocita és granulocita differenciálódást a Mir-129 biogenezisének és RUNX1 expressziójának szabályozásával

a sejtvonalak monocita és granulocita differenciálódását

a humán monocita sejtvonal THP-1, valamint az NB4 és HL-60 promielocita sejtvonal az ATCC-től (Manassas, USA) vásárolták és az rpmi1640-ben tartották, 10% magzati szarvasmarha szérummal kiegészítve (gibco, Carlsbad, CA). A sejteket PCR-rel szűrtük hitelesítés céljából, valamint immunfluoreszcens tesztekkel a mycoplasma-szennyeződéstől való mentesség érdekében. A THP-1 és a HL-60 sejtek monocita differenciálódását a sejtek 50 nM-es PMA-val (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) történő kezelésével indukáltuk 0, 24, 48 és 72 órán keresztül. az NB4 és HL-60 sejtek granulocita differenciálódását a sejtek 1 MHz-es atra-val történő kezelésével indukáltuk (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország). Az iclac és az NCBI Biosample által fenntartott, gyakran tévesen azonosított sejtvonalak adatbázisában nem találtak ebben a vizsgálatban használt sejtvonalakat. A sejtvonalakat mycoplasma-fertőzésre tesztelték, de nem hitelesítették újra.

Válogatás CD34+ HPCs

az emberi köldökzsinórvér (UCB) a pekingi uniós Kórház normál teljes idejű szállításaiból, a normál donorok csontvelőjét (BM) pedig a kínai Népi Felszabadító Hadsereg 307.Kórházából nyerték. A kutatási Etikai Bizottság tájékozott beleegyezését és jóváhagyását szerezték meg. A mononukleáris sejt (MNC) frakciókat UCB-ből és BM-ből izoláltuk Percoll sűrűséggradienssel (d = 1,077; Amersham Biotech, Németország). A CD34 + sejteket pozitív immunmágneses szelekcióval gazdagítottuk MNC-kből (CD34+ MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Németország).

a HPC-K monocitikus differenciálódása

a dúsított CD34+ hematopoietikus progenitor sejteket (HPC-ket) magas glükóz IMDM-ben tenyésztettük, kiegészítve 30% magzati szarvasmarha szérummal (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 kb 2-ME, 2 ng/mL rekombináns humán IL-3, 100 ng/mL rekombináns humán SCF, 50 ng/mL rekombináns humán M-CSF, 100 ng/ml rekombináns humán FLT3, 1 ng/ml rekombináns humán IL-6, 60 mg/ml penicillin és 100 mg/ml sztreptomicin a monocyta differenciálódás kiváltására. A citokineket a Peprotech-től (Rocky Hill, NJ) vásárolták. A sejteket 3-5 naponta betakarítottuk. A morfológiai elemzésekhez a sejteket üveglemezekre kenjük, 10 percig metanolban rögzítjük, május-gr-I (Maynwald/Giemsa) festékkel festjük, és 400-szoros nagyítással elemezzük mikroszkóp alatt (Nikon TE2000, Japán), digitális kamerával felszerelve.

a HPC-K granulocitikus differenciálódása

a dúsított CD34+ hematopoietikus progenitor sejteket (HPC-ket) magas glükóz IMDM-ben tenyésztettük, kiegészítve 30% magzati szarvasmarha szérummal (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 kb 2-ME, 2 ng/mL rekombináns humán IL-3, 100 ng/mL rekombináns humán SCF, 20 ng/mL rekombináns humán G-CSF, 10 ng/ml rekombináns humán IL-6, 60 mg/ml penicillin és 100 mg/ml sztreptomicin a granulocyta differenciálódás kiváltására. A citokineket a Peprotech-től (Rocky Hill, NJ) vásárolták. A sejteket 3-5 naponta betakarítottuk. A morfológiai elemzéseket ugyanúgy végeztük, mint a monocita differenciálódást.

oligonukleotidokat és

mir-129 mimikákat (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), miRNS inhibitorokat (anti-129) és negatív kontroll molekulákat (NC) nyertünk Dharmacon-ból (Austin, TX), és a sejteket 100 nM-es végső koncentrációval transzfektáltuk a dharmfect1 (Dharmacon, Austin, TX) alkalmazásával. a siRNS-eket (kifejezetten a KSRP és a RUNX1 esetében) és a kontroll siRNS-eket (Si-Con) a Dharmacon szintetizálta, és a sejteket 100 nM-es siRNS-ekkel transzfektálták a DharmFECT1 segítségével.

A ksrp túlexpresszióhoz az emberi ksrp (NM_003685.2) cDNS ORF klónt (pEGFP-KSRP) az Addgene-től (Addgene, MA) vásárolták. A KSRP leütéséhez a KSRP sh-RNS-t a pSIH-H1 vektorba klónozták a H1 promoter (lenti-sh_KSRP) után, vagy közvetlenül lentivirális konstrukciók formájában vásárolták meg (TL311984, Origene, Rockville, MD). A pri-129-1 túlexpresszióhoz egy 700 bp vad típusú konstrukciót klónoztunk a pCMV6 vektorba (129_wt) vagy a pMIRNA1 plazmidba (lenti-129). A pri-129-1 mutáns ksrp-kötő helyei (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 és 129_mutf) szintén pCMV6 vektorokban jöttek létre. A Mir-129 knockdown, miRZIP-129 és miRZIP-control esetében a System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) vásárolta meg. A RUNX1 túlexpresszióhoz a RUNX1 ORF-et klónozták a pMIRNA1 vektorba (Lenti-RUNX1).

A Mir-129 célpontok riporter génvizsgálatához a Mir-129 fordított komplementer szekvenciáját illesztettük be a pmir-riporterbe a firefly luciferáz géntől lefelé, hogy létrehozzuk a pozitív riporter konstrukciót (129_pozitív). A humán RUNX1 mRNS 3 ‘ – UTR-jét felerősítettük és ugyanabba a pmir-riporterbe klónoztuk a firefly luciferáz géntől lefelé, hogy létrehozzuk a vad típusú riportert (RUNX1_WT). A Mir-129 kötőhelyeinek mutációi a humán RUNX1 mRNS szekvenciák 3’-UTR-jében a QuickChange Site-directed Mutagenesis kit segítségével jöttek létre (RUNX1_Mut1, Runx1_mut2és RUNX1_Mut3). A sejteket ezekkel a konstrukciókkal transzfektáltuk Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával 293tn sejtekhez vagy Lipofectamine LTX&PLUS THP-1 sejtekhez és NB4 sejtekhez, a gyártó protokolljai szerint. Az összes alapozót a kiegészítő adatok sorolják fel 7.

Lentivirus production

a megfelelő lentivirus csomagoló készletet a System Biosciences-től (SBI, Palo Alto, CA) vásárolták, és a gyártó irányelveinek megfelelően használták fel. A begyűjtött vírusrészecskéket (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 és lenti-GFP) CD34+ HPC-khez, THP-1 vagy NB4 sejtekhez adtuk, majd a sejteket 24 óra elteltével IMDM-Mel mossuk, majd a későbbi kísérletekhez bevonjuk.

miRNS mély szekvenálás

a THP-1 sejteket pegfp-KSRP-vel vagy pEGFP-vel elektroporáltuk a Neon transzfekciós rendszer alkalmazásával, majd FACS szerint rendezve összegyűjtöttük a GFP-pozitív sejteket. Kis RNS-eket izoláltunk a teljes RNS-ből a mirVana miRNS izolációs készlettel (Ambion, Austin, TX), A gyártó utasításainak megfelelően. A kis RNS könyvtárakat és miRNS szekvenálást a Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Kft., Sanghaj, Kína) Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA) használatával. A szekvenálási adatokat szűrtük, az expressziós profilokat felépítettük, és az adapter dimer leolvasásait elválasztottuk a miRNS leolvasásoktól, amelyeket már azonosítottak a miRbase 17.0-ban. Az RNS-seq adatokat a Genergy Bio elemezte, és azoknak a miRNS-eknek a listáját, amelyek expressziója a KSRP túlzott expressziója után nőtt, a kiegészítő adatok mutatják 5, 6.

Poli(a)-dúsított RNS mély szekvenálás

A teljes RNS-t trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően a poli(A)-dúsított RNS-seq könyvtár elkészítéséhez. A Poly (A)-dúsított RNS könyvtárakat és a mély RNS-seq-t a Hiseq2000-hez (Illumina, San Diego, CA) adaptálták, és a Genergy Bio végezte. Az elsődleges miRNS-ek teljes listáját, amelyek expressziója csökkent a KSRP túlexpresszió után, a kiegészítő adatok sorolják fel 5, 6.

rassz elemzés

az elsődleges-129-1, 5′ és 3′ rassz teljes hosszának azonosításához a THP-1 sejtek teljes RNS-ét a gyártó kézikönyvének megfelelően az 5′-Full RACE Kit és a 3′-Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Kína) segítségével végeztük. A VERSENYKÍSÉRLETHEZ használt alapozókat a kiegészítő adatok sorolják fel 7.

Luciferase reporter assay

A Mir-129-1 funkcionális mechanisztikus elemzéséhez több mir-129-1 célt jósoltunk meg a targetscan és Miranda bioinformatikai szoftver segítségével, és validáltuk a jelölteket a luciferase reporter assay segítségével. 293TN sejtet kotranszfektáltunk a reporter-konstrukció 0,4 6G-jával, a pRL-tk kontrollvektor 0,015 g-jával és a Mir-129 mimikai vagy negatív kontroll mimikai 5 pmol-jával. 48 óra elteltével a sejteket a gyártó utasításainak megfelelően a Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) segítségével kinyertük és megvizsgáltuk. Minden transzfekciós vizsgálatot három példányban végeztünk.

In vitro feldolgozási vizsgálat

a feldolgozási vizsgálatot 10 mg/mL HeLa sejt NE alkalmazásával végeztük. A KSRP kimerüléséhez 1 mg HeLa sejt NE-hez tíz mikroliter ksrp antitestet, kontrollként pedig IgG antitestet adtak. 30 perces inkubálás után 4CC-n a KSRP fehérjét és antitest komplexet immunprecipitáltuk Protein A gyöngyökkel (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). A felülúszó a ksrp-ben kimerült nukleáris kivonat (ons). A 700-nt, izotóppal jelölt vad típusú pri-129-1-et (129_wt) és pri-129-1-et, amely mind a négy ksrp-kötő hely mutánsát (129_mut) tartalmazza, standard in vitro transzkripcióval T7 RNS polimerázzal-UTP jelenlétében állítottuk elő a 129_WT és 129_mut konstrukciók felhasználásával. A 129_wt-t és a 129_Mut-ot hela cell NEs-sel inkubáltuk (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) 30 percig 37 C-nél ksrp jelenlétében (0, 1 (1×), 2 (2×), és 4 pmol (4 db)). A reakcióelegyeket fenolnak vetettük alá: kloroform extrakciót, kicsapást és denaturáló gélelektroforézist, majd autoradiográfiát végeztünk.

a mentési feldolgozási vizsgálatot elvégeztük. Röviden, 20 (6) L) A (Z)-UTP-vel jelölt primer mir-129 pmol-jával és különböző mennyiségű (0,5) KSRP-vel (0,5) inkubáltuk különböző időpontokban (15, 40 és 60 perc) 37 (37) C-n. a reakcióelegyeket proteináz K-val kezeltük 30 (37) percig 37 (37) C-n, majd fenolnak vetettük alá:kloroform extrakció, kicsapás és denaturáló gélelektroforézis, majd autoradiográfia. Az összes vágatlan RNS gél megtalálható a kiegészítő ábrán. 12.

Northern blot

összesen 40-6G RNS mintát töltöttünk fel és futtattunk 12% – os denaturáló (karbamid) poliakrilamid géleken, majd átvisszük a Hybond membránokra (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A hibridizációt digoxigenin (DIG)-jelölt pri-miR-129-vel végeztük, a 32P-vel jelölt pre – vagy érett mir-129-5P szondával egy éjszakán át, 42-nél. Az U6 snrns-t és az rRNS-t szolgálták a pre -, érett vagy primer miRNS betöltésének vezérlőjeként. Az expressziós szintet az U6 snrns vagy rRNS expressziójának normalizálásával mértük. Az oligonukleotid szondaszekvenciákat a 7. kiegészítő adatok sorolják fel. A miRNS expresszióját az Image J software számszerűsítette. Az összes vágatlan Északi folt megtalálható a kiegészítő ábrán. 12.

RNS immunprecipitációs vizsgálat

azonos mennyiségű THP-1 vagy NB4 sejtet gyűjtöttünk jéghideg PBS-ben. Ezután a sejtpelleteket 1 mL B lízispufferben (50 mM Tris, pH 7) reszuszpendáltuk.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotinin, 1 mM leupeptin és 2 mM vanadyl ribonukleozid komplexek (VRC)) és gyengéd szonikáció. Miután a lizátumokat 12 000 fordulat / perc sebességgel 15 percig centrifugáltuk, a felülúszókat Dynabeadokkal (Invitrogen, Carlsbad, CA) előtisztítottuk A B lízispufferben 10 db élesztő tRNS-sel (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország). Ezután a precleared lizátumokat RIP-hez használtuk anti-KSRP antitesttel (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) vagy IgG nyúl izotípussal (12-370, Merck Millipore, Németország; 1:500), mint kontroll 4 órán át 4CC-n. A gyöngyöket háromszor mossuk B lízispufferrel, az utolsó mosás további 0,5% nátrium-dezoxikolátot tartalmaz, majd extraháljuk C pufferrel (100 mM-es trisz, pH 6,8, 4% SDS, 12% – os Anavar-merkapto-etanol és 20% glicerin) szobahőmérsékleten 10 percig. Az immunprecipitált RNS-t trizollal és fenol-kloroformmal extraháltuk. Az RT-PCR esetében minden RNS-mintát DNase I-vel kezeltünk (Ambion, DNS-mentes TM kit). Ezután egyenlő mennyiségeket fordítottunk át a nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlettel (Invitrogen, Carlsbad, CA). Az RNS-ek ksrp-vel történő dúsulását qPCR-rel és agarózgél-elektroforézissel mértük. A Rip-PCR kísérletekhez használt primereket a 7. kiegészítő adatok sorolják fel.

fehérje-RNS komplexek Immunprecipitációját

Maltózkötő fehérje (MBP)-affinitás tisztítást használtunk az elsődleges miRNS-ekhez kapcsolódó fehérjék azonosítására. Az MS2-MBP expressziós plazmid Dr. Lingling Chen (Kínai Tudományos Akadémia) ajándéka volt, és az MS2-MBP-t E. coli-ból expresszálták és tisztították a Steize lab (Yale Egyetem) protokolljával. Három MS2 rétegfehérje-kötő helyet (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagcccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagtagtaggatctctcgtacaccatcagggtacg-3′) illesztettünk be a pri-129-1 génszekvencia vagy a pri-129-1 ksrp-kötő hely mutáns szekvenciák után. 293tn sejtet TRANSZFEKTÁLTUNK MS2-t tartalmazó konstrukciókkal, hogy primer miRNS-ekhez kapcsolódó fehérjéket kapjunk, és minden egyes immunprecipitációs vizsgálathoz 10 millió sejtet használtunk. A sejteket 48 órával a transzfekció után gyűjtöttük be, és RNS-lehúzási elemzésnek vetettük alá. Röviden, a sejteket kétszer öblítettük jéghideg PBS-sel, mielőtt 10 mL jéghideg PBS-ben kaparással betakarítottuk. Ezután a sejt pelleteket 1 mL IP pufferben (50 mM-es Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, proteináz inhibitor koktél) reszuszpendáltuk, és 2 körös kíméletes szonikációnak vetettük alá, és centrifugáltuk, hogy sejtkivonatokat kapjunk. A felülúszót először MS2-MBP-vel inkubáltuk 1 órán át, majd amilózgyanta gyöngyökkel (NEB) további 1 órán át 4 C-on.a gyöngyöket ötször mossuk gyengéd kőzetű IP pufferrel, az utolsó mosást pedig további 150 mM-es NaCl-lal ellátott IP pufferrel. A fehérjekomponenseket végül 12 mM-es Maltózzal kiegészített IP pufferrel ellátott gyöngyökből eluáltuk, és a WB a következő primer antitestekkel ellenőrizte: nyúl Anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), nyúl anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), nyúl anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000,) és egér anti-GAPDH (60004-1-ig, proteintech; 1:1 000 000).

RNáz-H védettségi vizsgálat

standard RNáz-H védettségi reakciót hajtottunk végre 25 db teljes térfogatban, amely 1 db pmol KSRP fehérjét, 1 db pmol-UTP-vel jelölt RNS-t, 20 db 62 mm HEPES-t (pH 8,0), 60 mM MgCl2-T, 1 mM DTT-t, 20 E Rnasint (40 U/ml, Promega, Madison, WI), és 1 E. coli RNáz H. a kontroll, a reakció a megfelelő mennyiségű deproteinizált-UTP-jelölt RNS és azonos Ionos körülmények között, mint a kivonat állítottuk elő, és inkubáljuk 25 kb 15 percig. A reakciót 75 db desztillált H2O, 100 db 2 db PK puffer és 4 db proteináz K (10 mg/mL) hozzáadásával fejeztük be, és az RNS-fragmensek elemzésére a qPCR-ben leírtak szerint RNS-t állítottunk elő. Az RNS-t reszuszpendáltuk 25 ml karbamid gél-betöltő pufferben (5 mM EDTA, 10% (v/v) glicerin, 0,05% (m/v) xilol Cianol FF, 0,05% (m/v) Brómfenol kék és 50% ionmentesített formamid), majd karbamid denaturáló géleken szétválasztottuk, majd autoradiográfiával.

qPCR

A teljes RNS-t a sejtekből és szövetekből Trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) extraháltuk, majd a gyártó utasításainak megfelelően DNase I emésztést végeztünk. Az RNS-t az abszorbancia 260 nm-en történő mérésével és reverz transzkripcióval számszerűsítettük. A Kvantitatív valós idejű PCR-t (qPCR) a Bio-Rad iQ5 valós idejű PCR-rendszerrel hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint. A reverz transzkripcióhoz és a qPCR-hez használt primereket a 7.kiegészítő adatok mutatták be. Az adatokat endogén gapdh mRNS és U6 snrns alkalmazásával normalizáltuk. A PCR−adatok elemzéséhez a 2-ONCT módszert alkalmaztuk.

áramlási citometria

a sejteket a megadott időpontokban kinyertük, és kétszer PBS/0,5% BSA-val mossuk 4CC-n, hogy blokkoljuk az Fc receptorokat. A transzdukált CD34 + HPC-ket APC-konjugált anti-CD14 (klón: 61d3) vagy anti-CD11b (klón: ICRF44) antitestekkel festettük (eBioscience, San Diego, CA). Az egér BM sejtjeit PE-konjugált anti-CD33 antitesttel festettük (klón: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Áramlási citometriát végeztünk egy C6 áramlási Citométeren (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Az adatokat flowjo szoftverrel elemeztük (7.6-os verzió, TreeStar, Ashland vagy).

Egerek és transzplantációs vizsgálatok

minden állatkísérletet a pekingi Orvosi Egyetem kutatási Etikai Bizottságának jóváhagyásával végeztek. Tízmillió lenti-sh-KSRP-vel, lenti-129-vel vagy lenti-GFP-vel fertőzött CD34+ HPC-t mostunk, reszuszpendáltunk PBS-ben, majd injektáltuk a 4-től 6-ig hetes nőstény nőstény nod/SCID recipiens egerek oldalsó farokvénájába, röntgensugárral besugárzott 250 cGy dózisban. Négy héttel a CD34 + HPC-k átültetése után az egereket feláldozták, majd a BM-et és a lépeket összegyűjtötték és egysejtű szuszpenziókká dolgozták fel a későbbi kísérletekhez. Az eredményeket csoportonként 4 Egerből kaptuk.

Western blot

A teljes sejtes lizátumokat Western blot elemzésnek vetettük alá. Nyúl poliklonális anti-KSRP antitest (6994-1; 1:1000) és anti-RUNX1 antitest (ab35962; 1:1000), hogy a Epitomics (Abcam, Cambridge, MA), vagy egy gapdh antitest (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) elsődleges antitestként használták, és 1 db 5% testfelszínt tartalmazó, 5 órán át szobahőmérsékleten (RT), folyamatos rázással inkubálták. Mosás után 1 db tbst-vel 15 percig RT-n, a membránokat inkubáltuk HRP-konjugált kecske nyúlellenes másodlagos AB-vel (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) 1 órán át RT-n. az utolsó mosási lépés után 1 db tbst-vel 15 percig RT-n, az immunreaktív sávokat fokozott kemilumineszcenciával (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) vizualizáltuk a jelzett expozíciós időben (“expozíciós idő a Western blot számára”). Az összes levágatlan western blot megtalálható a kiegészítő ábrán. 11.

In vivo feldolgozási vizsgálat zebrafish-ban

embriókat gyűjtöttek a Tuebingen zebrafish laboratóriumi tenyészkolóniájából, amelyet 28 Kb-on, 14:10 órás Világos/Sötét ciklusban helyeztek el, és standard körülmények között neveltek (China Zebrafish Resource Center). KSRP mRNS-t és GFP-Pri-129 WT vagy KSRP-kötőhelyen mutáns mRNS-eket szintetizáltunk in vitro a megfelelő linearizált plazmidokból az mMESSAGE mMACHINE Kit (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) segítségével. A KSRP mRNS-t és a GFP-Pri-129_wt mRNS-t (vagy GFP-Pri-129_mut mRNS-t) együtt injektáltuk egysejtű zebrafish embriókba. Az embriókat a H. P. F. és a morfológiai kritériumok52 szerint 28 .. C-on állították fel. A 4 és 24 órán át tartott embriók felvételeit Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Németország) segítségével szereztük be.

In vivo feldolgozási vizsgálat 293TN sejtekben

293TN sejteket tenyésztettünk 6 lyukú lemezeken 24 órán át, amíg el nem érik a 70-80%-os összefolyást. A sejteket együtt transzfektáltuk az EGFP fúziós Pri-129_wt vagy mutáns Pri-129 plazmidokkal, pcDNA4-RFP-vel és a pCMV-KSRP plazmiddal Lipofektamin 2000 alkalmazásával (Invitrogen, Carlsbad, CA). Huszonnégy órával később a sejteket Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal elemeztük 400 MHz-es nagyítással (Carl Zeiss Microscopy GmbH). Az RNS-t a feldolgozás hatékonyságának qPCR elemzéséhez is extraháltuk az elsődleges mir-129 vs.az érett mir-129 kimutatásával. A fluoreszcencia intenzitását Image-Pro Plus 6.0 szoftverrel (Media Cybernetics, Rockville, MD) számszerűsítettük.

in situ proximity ligation assay

In situ Pla-kat a gyártás protokollja (Sigma-Aldrich) szerint végeztük. A nyúl Anti-Drosha-t (ab12286, Abcam; 1 : 50) és a nyúl anti-DGCR8-at (ab191875, Abcam; 1:50) párosították anti-KSRP-vel (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Kanada; 1:50) vagy normál nyúl IgG poliklonális antitesttel (12-370, Merck Millipore, Németország; 1:50) Az elsődleges antitestek tekintetében. Anti-KSRP és normál nyúl IgG poliklonális antitest negatív kontrollként. A blokkolás előtt 293t vagy HeLa sejteket tenyésztettünk kamrás tárgylemezeken (Sigma), 10% formaldehidben rögzítve, 0,25% Triton X-100-PBS-sel permeabilizálva. A sejteket Zeiss lsm780 konfokális immunfluoreszcens mikroszkóppal elemeztük (Zeiss, Németország), majd dekonvolúcióval Huygens Essential version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Hollandia, http://svi.nl). A PLA pontokat cellánként blobfinder V3.2 képelemző szoftverrel (Uppsala Egyetem, Stockholm, Svédország) számszerűsítettük, és a PLA pontok átlagos számát cellánként legalább 100 sejt elemzésével számítottuk ki.

bioinformatikai elemzés

az összes párosított végű olvasatot az adapter szekvenciájához vágtuk a Trim Galore (0.3.7 Verzió) paraméterekkel “-q 25-stringency 5-Hossz 50-párosított-phred33” és szűrjük az alacsony minőségű szekvenciához. A hg38 reference genome (GRCh38) és a gene annotation file (GTF formátum)a GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53-ból került letöltésre. TopHat54, 55 (Verzió 2.1.0) segítségével igazítottuk a szűrt olvasmányokat a hg38 Genom referencia genomjához az alapértelmezett beállításokkal, az FPKMs-t (fragmentumok Kilobázis-transzkriptómonként millió olvasásra) pedig mandzsettagombokkal kaptuk 54 (2.2.1 verzió) alapértelmezett paraméterekkel. Az expressziós szinteket a funkciószámok56 (1.5.0 verzió) segítségével becsültük meg a “-T 7 –primer ” paraméterekkel, a génszintű nyers számokat a gén összes izoformájának megfelelő értékeinek összegéből származtattuk.

EBSeq-HMM18-at használtunk a monocyta és granulocyta differenciálódás három fázisa közötti génexpressziós különbségek elemzésére. Két fő lépés van az EBSeq-HMM számára, hogy differenciálisan expresszált (DE) géneket kapjon:

1. 1)

   olyan de gének kimutatása, amelyek szignifikáns változást mutattak bármely két szakasz között 0,05-ös cél hamis felfedezési Arány (FDR) alatt.

2. 2)

   A de gének expressziós utakba csoportosítása a maximális posterior valószínűség (PP) nagyobb, mint 0,5.

az EBSeq-hmm alkalmazásával a monocita (vagy granulocita) differenciálódás 5., 10. és 15. napján megkaptuk a de géneket és a hozzájuk tartozó expressziós útvonalakat (azaz “fel-le”) (1. kiegészítő adat). A “Fel-Le” kifejezési út azt jelenti, hogy egy gént a 10.napon az 5. naphoz képest felfelé szabályoztak, míg a 15. napon a 10. naphoz képest lefelé szabályoztak. A monocita (vagy granulocita) differenciálódás során monoton módon megnövekedett (“Fel-Fel”) vagy csökkent (“le-le”) géneket választottunk további elemzésre.

a génexpressziós szinteket az FPKM segítségével becsülték meg, és az összes olyan gént, amelynek expresszált génjei az fpkm-et tartalmazzák, további elemzésre használták. Az RBP információit az Rbpdb19 és ATtRACT20 adatbázisokból töltötték le. Kifejlesztettünk egy R szkriptet (8. kiegészítő adat) a de gének osztályozására “Fel-Fel” vagy “le-le” expressziós útvonalakkal (2., 3. Kiegészítő adat) különböző expressziós mintákba.

A hőtérképeket a ‘pheatmap’ r csomagok ‘pheatmap’ függvényével, a Venndiagramot pedig a ‘draw’ függvény segítségével rajzoltuk meg.páronként.venn’ az R csomag ‘VennDiagram’.

plazmid elektrotranszfekciók

A Neon Transzfekciós rendszert használtuk a gyártó utasításai szerint (Invitrogen, Carlsbad, CA), hogy javítsuk a plazmid transzfekciós hatékonyságot a THP-1 sejtekben az RNS-seq elemzéshez. A sejteket elektrotranszfektáltuk plazmidokkal (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP vagy pSIH-H1-sh-KSRP). Az elektroporációs paraméterek 1 607 THP-1 vagy NB4 sejt esetében 1350 V-os impulzus, 10 ms-os impulzusszélesség és 4 impulzus volt 10 6L-es csúcs alkalmazásával. Negyvennyolc órával később az elektrotranszfekciós hatékonyságot Western blotting vagy qPCR segítségével detektálták.

mentési vizsgálatok

annak igazolására, hogy a KSRP elősegíti a pri-miR-129 feldolgozást a mieloid származás differenciálódásának szabályozására, a THP-1 sejteket pegfp-KSRP-vel transzfektáltuk Lipofektamin 2000 alkalmazásával, majd 24 órával később a sejteket mir-129 inhibitorral transzfektáltuk. Az NB4 sejteket si-KSRP-vel transzfektáltuk 100 nM végső koncentrációban DharmFECT1 alkalmazásával, majd 24 órával később a sejteket mir-129 mimikával transzfektáltuk. Annak igazolására, hogy a Mir-129 a mieloid vonal differenciálódásának szabályozására a runx1-et célozta meg, a THP-1 és az NB4 sejteket si-RUNX1-gyel és egy miR-129 inhibitorral vagy azok kontrolljaival transzfektálták a Neon transzfekciós rendszerrel. A sejteket ezután PMA-val vagy ATRA-val stimuláltuk további 48 órán keresztül, mielőtt betakarítottuk őket a későbbi elemzésekhez. A CD14 expressziót monocita differenciálódáson átesett THP-1 sejtekben, a CD11b expressziót pedig granulocita differenciálódáson átesett NB4 sejtekben áramlási citometriával elemeztük.

expozíciós idő a Western blot esetében

A Western blot nagy részét a Tanon 5200 automatikus digitális gél képelemző rendszer fejlesztette ki (Tanon, Sanghaj, Kína), és a gapdh expozíciós ideje 150-350 ms. 2a, a minták expozíciós ideje a monocita differenciálódás mentén 20 s a ksrp esetében; a minták expozíciós ideje a granulocita differenciálódás mentén 200 ms A KSRP esetében. Ábra. 2b, az expozíciós idő 20 s a KSRP esetében. Ábra. 4f-h, az expozíciós idő 60 s a KSRP esetében. Ábra. 5b, az expozíciós idő 60 s Drosha, DGCR8 és KSRP esetén. Ábra. 6j, k, az expozíciós idő 90 s a RUNX1 esetében. Ábra. 7g, az expozíciós idő 90 s a RUNX1 és a KSRP esetében. Ábra. 7h, az expozíciós idő 30 s a RUNX1 és a KSRP esetében. Kiegészítő Ábra. 2a, a minták expozíciós ideje a monocita differenciálódás mentén 3 s a ksrp esetében; a minták expozíciós ideje a granulocita differenciálódás mentén 300 ms A KSRP esetében. Kiegészítő Ábra. 4a, e, f, az expozíciós idő 60 s a KSRP esetében. Kiegészítő Ábra. 7m, expozíciós idő 10 s és 90 s RUNX1 a THP-1 és NB4, respevtively. Kiegészítő Ábra. 8a, az expozíciós idő 60 s a RUNX1 esetében.

a kézi expozíció eredményét mutató egyéb képek esetében (ábra. 2D, I; kiegészítő ábra. 7n), a GAPDH expozíciós ideje becsült 1 s.ábrán. 2d, az expozíciós idő 30 s a KSRP esetében a PMA-indukált mintákban és 10 s A KSRP esetében az ATRA-indukált mintákban. Ábra. 2i, az expozíciós idő 60 s a KSRP esetében. Kiegészítő Ábra. 7n, az expozíciós idő 90 s a RUNX1 esetében.

a monociták és neutrofilek izolálása perifériás vérből

a tájékoztatáson alapuló beleegyezést a Kínai Orvostudományi Akadémia intézményi felülvizsgálati testületének megfelelően szerezték meg. Humán monocitákat és neutrofileket izoláltunk egészséges donorok perifériás véréből 3% dextránban, és percoll gradiens centrifugálással izoláltuk, majd CD14 Mikrogyöngyökkel (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Németország) vagy EasySep humán neutrofil dúsító készlettel (#19257, Stemcell Technologies, Kanada) tisztítottuk. A CD14 mikrogyöngyök szerinti rendezést követően a kapott CD14 pozitív sejteket T-25 lombikokba vontuk be, és 4-6 órán át tenyésztettük 37 .. C-on, amíg a tapadó monocitákat kaparással összegyűjtöttük.

statisztikai elemzés

minden vizsgálat esetében az n csoportonként az ábra jelmagyarázat szerint van feltüntetve. Az összes adatot a GraphPad Prism 5.0 szoftver (GraphPad Software, Inc., USA), és azt jelenti, hogy az SD. A kísérleti csoportok és a kontrollcsoportok közötti különbségeket a Kétfarkú diák t-tesztjével elemeztük. A statisztikai szignifikanciát p < 0,05 értéken fogadták el. A minta méretének előzetes meghatározására nem alkalmaztak statisztikai módszereket. Minden kísérletet legalább három biológiai ismétléssel végeztünk. A megfelelő teszteket az adateloszlások szerint választottuk. A kísérleteket nem randomizáltuk, és nem zártunk ki mintákat. A kutatók nem voltak vakok a kiosztásra a kísérletek és az eredményértékelés során.

adatok rendelkezésre állása

a miRNS és a pri-miR-RNS szekvenálási adatokat a GEO adatbázisba helyezték el a gse87318 csatlakozási kód alatt. Az mRNS szekvenáláshoz szükséges adatokat a GEO adatbázisba is letétbe helyezték a gse87088 csatlakozási kód alatt. Forrás adatok ábra. Az 1c–e kiegészítő adatként 1-4. Forrás adatok ábra. 2b, c kiegészítő adatként 5, 6. A tanulmány eredményeit alátámasztó összes többi adat kérésre rendelkezésre áll a megfelelő szerzőtől.