KSRP geeft monocytic en granulocytic differentiatie door middel van het reguleren van de miR-129 biogenesis en RUNX1 expressie

Monocytic en granulocytic differentiatie van de cel lijnen

De menselijke monocytic cellijn THP-1, en de promyelocytic cellijn NB4 en HL-60 werden gekocht bij ATCC (Manassas, USA) en onderhouden RPMI1640 aangevuld met 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA). De cellen werden gescreend door PCR voor authenticatie en door immunofluorescentietests voor vrijheid van mycoplasma besmetting. Monocytaire differentiatie van THP – 1-en HL-60-cellen werd veroorzaakt door de cellen te behandelen met 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Duitsland) voor 0, 24, 48 en 72 uur. granulocytische differentiatie van NB4-en HL-60-cellen werd veroorzaakt door de cellen te behandelen met 1 µM ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Duitsland). Geen cellijnen die in deze studie worden gebruikt werden gevonden in het gegevensbestand van algemeen verkeerd geïdentificeerde cellijnen die door Iclac en NCBI-Biosample worden gehandhaafd. Cellijnen werden getest op mycoplasma contaminatie maar zijn niet opnieuw geverifieerd.

het sorteren van CD34+ HPC ‘s

menselijk navelstrengbloed (UCB) werd verkregen uit normale voldragen leveringen in het Peking Union Hospital, en beenmerg (BM) van normale donoren werden verkregen uit het 307th Hospital of Chinese People’ s Liberation Army. Informed consent en goedkeuring van de Research Ethics Committee werd verkregen. Mononucleaire cel (MNC) fracties werden geïsoleerd uit UCB en BM met behulp van een Percoll dichtheid gradiënt (d = 1.077; Amersham Biotech, Duitsland). CD34 + cellen werden verrijkt uit multinationals met behulp van positieve immunomagnetische selectie (CD34 + MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Duitsland).

Monocytic differentiatie van HPCs

De verrijkte CD34+ hematopoëtische voorlopercellen (HPCs) werden gekweekt in hoge glucose IMDM aangevuld met 30% fetal bovine serum (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-MIJ, 2 ng/mL recombinant humaan IL-3, 100 ng/mL recombinant humaan SCF, 50 ng/mL recombinant humaan M-CSF, 100 ng/mL recombinant humaan FLT3, 1 ng/mL recombinant humaan IL-6, 60 mg/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine voor het opwekken van monocyten differentiatie. Cytokines werden gekocht bij Peprotech (Rocky Hill, NJ). De cellen werden om de 3-5 dagen geoogst. Voor morfologische analyses werden cellen uitgesmeerd op glazen objectglaasjes, gefixeerd in methanol 10 min, gekleurd met May-Grünwald / Giemsa, en geanalyseerd bij 400x vergroting onder een microscoop (Nikon TE2000, Japan) uitgerust met een digitale camera.

Granulocytic differentiatie van HPCs

De verrijkte CD34+ hematopoëtische voorlopercellen (HPCs) werden gekweekt in hoge glucose IMDM aangevuld met 30% fetal bovine serum (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-MIJ, 2 ng/mL recombinant humaan IL-3, 100 ng/mL recombinant humaan SCF, 20 ng/mL recombinant humaan G-CSF, 10 ng/mL recombinant humaan IL-6, 60 mg/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine voor het opwekken van granulocyte differentiatie. Cytokines werden gekocht bij Peprotech (Rocky Hill, NJ). De cellen werden om de 3-5 dagen geoogst. Morfologische analyses werden uitgevoerd op dezelfde manier als monocytaire differentiatie.

oligonucleotiden en constructies

mir-129 nabootsingen (5 ‘- CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3’), miRNA-remmers (anti-129) en negatieve controlemoleculen (NC) werden verkregen uit Dharmacon (Austin, TX) en cellen werden getransfecteerd met een uiteindelijke concentratie van deze constructies van 100 nM met behulp van DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNAs (specifiek voor KSRP en RUNX1) en control siRNAs (Si-Con) werden gesynthetiseerd door Dharmacon en cellen werden getransfecteerd met 100 nM siRNAs met behulp van DharmFECT1.

voor ksrp-overexpressie werd de menselijke ksrp (NM_003685.2) cDNA ORF-kloon (pEGFP-KSRP) gekocht van Addgene (Addgene, MA). Voor ksrp knockdown, werd ksrp sh-RNA gekloond in de pSIH-H1 vector stroomafwaarts van de H1 promotor (lenti-sh_KSRP) of direct gekocht in vorm van lentiviral constructies (TL311984, Origene, Rockville, MD). Voor pri-129-1 overexpressie werd een 700-bp wild-type constructie gekloond in de pcmv6 vector (129_WT) of in het pmirna1 plasmide (lenti-129). De mutante ksrp-bindingsplaatsen in pri-129-1 (129_MUT1, 129_MUT2, 129_MUT3, 129_MUT4 en 129_MUTF) werden ook gecreëerd in pcmv6-vectoren. Voor mir-129 knockdown werden miRZIP-129 en miRZIP-control gekocht bij System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Voor RUNX1 overexpressie werd RUNX1 ORF gekloond in de pmirna1 vector (Lenti-RUNX1).

voor de reporter-genanalyse van Mir-129-targets werd de omgekeerde complementaire sequentie van miR-129 ingevoegd in de pmir-reporter stroomafwaarts van het firefly luciferase-gen om de positieve reporter-construct te genereren (129_positief). De 3 ‘ – UTR van menselijke RUNX1 mRNA werd versterkt en gekloond in dezelfde pmir-reporter stroomafwaarts van het firefly luciferase gen om de wild-type reporter (RUNX1_WT) te vormen. Mutaties van de MIR-129 bindingsplaatsen in de 3 ‘ – UTR van humane RUNX1 mRNA sequenties werden gecreëerd met behulp van de QuickChange Site-directed Mutagenesis kit (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 en RUNX1_Mut3). Cellen werden getransfecteerd met deze constructies met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) voor 293TN-cellen of Lipofectamine LTX&PLUS voor THP-1-cellen en NB4-cellen, volgens de protocollen van de fabrikant. Alle primers zijn vermeld in aanvullende gegevens 7.

lentivirus productie

de geschikte lentivirus verpakkingskit werd gekocht bij System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) en gebruikt volgens de richtlijnen van de fabrikant. De geoogste virale deeltjes (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1, en lenti-GFP) werden toegevoegd aan CD34+ HPCs, THP-1 of NB4 cellen, en de cellen werden dan gewassen met IMDM na 24 uren en geplateerd voor volgende experimenten.

miRNA deep sequencing

THP-1-cellen werden geëlektroporeerd met pEGFP-KSRP of pEGFP met behulp van het neon-transfectiesysteem en vervolgens gesorteerd op FACS om de GFP-positieve cellen te verzamelen. Kleine RNAs werden geà soleerd van het totale RNA met de Mirvana miRNA Isolatieuitrusting (Ambion, Austin, TX), volgens de instructies van de fabrikant. De kleine bibliotheken van RNA en miRNA het rangschikken werden uitgevoerd door Genergy Bio (Genergy Bio-Technologie Co., Ltd., Shanghai, China) met behulp van een Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA). De rangschikkende gegevens werden gefilterd, werden de uitdrukkingsprofielen geconstrueerd en de reads van het adapterdimer werden gescheiden van miRNA reads die reeds in miRbase 17.0 waren geà dentificeerd. RNA-seq gegevens werden geanalyseerd door Genergy Bio en een lijst van miRNAs waarvan de uitdrukking op KSRP overexpressie werd verhoogd wordt getoond in aanvullende gegevens 5, 6.

met Poly(A) verrijkt RNA deep sequencing

totaal RNA werd geëxtraheerd met Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), volgens de instructies van de fabrikant, om de met poly(A) verrijkt RNA-seq-bibliotheek te bereiden. Poly (a)-verrijkte RNA bibliotheken en diepe RNA-seq werden aangepast aan Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) en werden uitgevoerd door Genergy Bio. Een volledige lijst van primaire miRNAs waarvan de uitdrukking na KSRP overexpressie verminderde wordt vermeld in aanvullende gegevens 5, 6.

RACE analyse

om de volledige lengte van primaire-129-1, 5′ en 3′ RACE te bepalen, werden reacties uitgevoerd op totaal RNA van THP-1 cellen met behulp van de 5′-volledige RACE Kit en 3′-Volledige RACE Kit (TaKaRa, Dalian, China) volgens de handleiding van de fabrikant. De primers gebruikt voor het RACE-experiment zijn vermeld in aanvullende gegevens 7.

Luciferase reporter assay

voor functionele mechanistische analyses van miR-129-1 voorspelden we verschillende mir-129-1 doelen met behulp van de bio-informatica software Targetscan en Miranda en valideerden we de kandidaten met de luciferase reporter assay. 293TN cellen werden gelijktijdig getransfecteerd met 0,4 µg van de reporter construct, 0,015 µg van de PRL-TK controlevector en 5 pmol van de MIR-129 nabootsing of negatieve controle nabootsing. Na 48 uur werden de cellen geoogst en getest met de Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI), volgens de instructies van de fabrikant. Alle transfectie assays werden uitgevoerd in drievoud.

in vitro processing assay

de processing assay werd uitgevoerd met behulp van een 10 mg/mL HeLa cell NE. Voor de depletie van KSRP, werden tien microliters van ksrp antilichaam toegevoegd aan 1 mg van HeLa cel NE en een IgG antilichaam werd toegevoegd als controle. Na een incubatie van 30 minuten bij 4 °C, werd het ksrp-eiwit en het antilichaamcomplex immunoprecipitated met proteïne a-parels (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Het supernatant is het ksrp-verarmd kernextract (ΔKSRP-NE). De 700-nt, isotoop-gelabelde wild-type pri-129-1 (129_WT) en pri-129-1 die alle vier ksrp-bindingsplaats mutanten (129_Mut) bevatten werden bereid door standaard in vitro transcriptie met T7 RNA-polymerase in aanwezigheid van-UTP met behulp van de 129_wt en 129_Mut constructies. 129_WT en 129_Mut werden geïncubeerd met HeLa cel NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) gedurende 30 min bij 37 °C in aanwezigheid van KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), en 4 pmol (4×)). De reactiemengsels werden onderworpen aan fenol:chloroformextractie, precipitatie en denaturerende gelelektroforese, gevolgd door autoradiografie.

de rescue processing assay werd uitgevoerd. In het kort werd 20 µL ΔKSRP-NE geïncubeerd met 1 pmol van-UTP-gelabeld primair miR-129 en verschillende hoeveelheden KSRP (0,5 µg) gedurende verschillende tijden (15, 40 en 60 minuten) bij 37 °C. De reactiemengsels werden gedurende 30 minuten bij 37 °C behandeld met proteïnase K en vervolgens onderworpen aan fenol:chloroformextractie, precipitatie en denaturerende gelelektroforese, gevolgd door autoradiografie. Alle niet-gekropte RNA-gels kunnen worden gevonden in aanvullende Fig. 12.

Northern blot

in totaal werden 40-µg RNA-monsters geladen en uitgevoerd op denaturerende (ureum) 12% polyacrylamidegelen en vervolgens overgebracht op Hybond-membranen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybridisatie werd uitgevoerd met digoxigenine (DIG)-gelabelde pri-miR-129, γ-32P-gelabelde pre – of volwassen mir-129-5p sonde ‘ s nachts bij 42 °C. U6 snRNA en rRNA werden gebruikt als de laadcontroles voor respectievelijk pre -, volwassen of primaire miRNA. Expressieniveau werd gemeten door normalisatie naar de expressie van U6 snRNA of rRNA. De oligonucleotidesonde sequenties worden vermeld in aanvullende gegevens 7. De uitdrukking van miRNA werd gekwantificeerd door de software van Beeldj. Alle niet gekropte Noordelijke vlek is te vinden in aanvullende Fig. 12.

RNA-immunoprecipitatietest

gelijke hoeveelheden THP-1-of NB4-cellen werden geoogst in ijskoude PBS. Vervolgens werden de celkorrels geresuspendeerd in 1 mL lysis buffer B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotinine, 1 mM leupeptine en 2 mM VANADYL ribonucleoside complexen (VRC)) en zachte sonicatie. Nadat de lysaten gedurende 15 minuten bij 12.000 toeren per minuut waren gecentrifugeerd, werden de supernatanten met Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) in lysis-buffer B met 10 µg gist tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Duitsland) voorgesneden. Vervolgens werden de voorgesneden lysaten gebruikt voor RIP met een anti-KSRP-antilichaam (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1: 500) of een konijnisotype IgG (12-370, Merck Millipore, Duitsland; 1:500) als controle gedurende 4 uur bij 4 °C. De parels werden driemaal gewassen met lysisbuffer B, waarbij de laatste spoeling nog eens 0,5% natriumdeoxycholaat bevatte, gevolgd door extractie met buffer C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-mercaptoethanol en 20% glycerol) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Het immunoprecipitated RNA werd geëxtraheerd met Trizol en fenol chloroform. Voor RT-PCR werd elk RNA-Monster behandeld met DNase I (Ambion, DNA-vrije TM-kit). Dan, gelijke hoeveelheden werden omgekeerd getranscribeerd met de Hoge Capaciteit cDNA Reverse transcriptie Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). De vouwverrijking van RNAs door KSRP werd gemeten door qPCR en agarosegelelektroforese. De voor de RIP-PCR-experimenten gebruikte primers zijn vermeld in aanvullende gegevens 7.

Immunoprecipitatie van de eiwit-RNA-complexen

Maltose-bindend eiwit (MBP) – affiniteit zuivering werd gebruikt om eiwitten geassocieerd met primaire miRNAs te identificeren. De MS2-MBP expressie plasmide was een geschenk van Dr.Lingling Chen (Chinese Academie van Wetenschappen) en MS2-MBP werd uitgedrukt en gezuiverd van E. coli met behulp van een protocol van het Steize lab (Yale University). Drie MS2 coat eiwitbindingsplaatsen (5′-cgtacaccatcagggtacggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacgtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3′) werden na de PRI-129-1-gensequentie of de PRI-129-1 ksrp-mutantsequenties ingevoegd. 293TN cellen werden transfected met MS2-bevattende constructen om proteã nen verbonden aan primaire miRNAs te verkrijgen, en 10 miljoen cellen werden gebruikt voor elke immunoprecipitation analyse. De cellen werden 48 h post-transfectie geoogst en onderworpen aan RNA pull-down analyse. Kortom, cellen werden tweemaal gespoeld met ijskoude PBS voordat ze werden geoogst in 10 mL ijskoude PBS door ze te schrapen. Vervolgens werden de celkorrels geresuspendeerd in 1 mL IP-buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, proteïnaseremmercocktail), en onderworpen aan 2 rondes zachte sonicatie en gecentrifugeerd om celextracten te verkrijgen. De supernatant werd eerst geïncubeerd met MS2-MBP gedurende 1 uur en vervolgens amylose hars parels (NEB) gedurende nog eens 1 uur bij 4 C. De parels werden vijf keer gewassen met IP buffer met gentle rock en een laatste was met IP buffer geleverd met extra 150 mM NaCl. De eiwitcomponenten werden uiteindelijk geëlueerd uit parels met IP buffer aangevuld met 12 mM Maltose, en werden gecontroleerd door WB met de volgende primaire antilichamen: konijn anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1: 1000), konijn anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), konijn anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000,) en muis anti-GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech; 1:1.000.000).

RNase h protection assay

een standaard RNase H protection reaction werd uitgevoerd in een totaal volume van 25 µL met 1 pmol ksrp-eiwit, 1 pmol van-UTP-gelabeld RNA, 20 µg/mL DNA-oligonucleotiden, 12 mM HEPES (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U RNasin (40 u/µL, Promega, Madison, WI) en 1 U E. coli RNase H. controle, een reactie met de overeenkomstige hoeveelheid Gedeproteïniseerd-utp-geëtiketteerd RNA en dezelfde Ionische voorwaarden als het extract werd bereid en geïncubeerd bij 25 °C gedurende 15 min. De reactie werd beëindigd door toevoeging van 75 µL gedestilleerd H2O, 100 µL 2 × pk-buffer en 4 µL proteïnase K (10 mg/mL), en RNA werd bereid zoals beschreven in de ‘qPCR’ om de RNA-fragmenten te analyseren. RNA werd geresuspendeerd in 25 µL ureumgelladingsbuffer (5 mM EDTA, 10% (v/v) glycerol, 0,05% (g/v) XYLEENCYANOL FF, 0,05% (g/v) Broomfenolblauw en 50% gedeïoniseerd formamide) en gescheiden op ureumdenatureringsgels, gevolgd door autoradiografie.

qPCR

totaal RNA werd geëxtraheerd uit de cellen en weefsels met behulp van Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) gevolgd door DNase I-spijsvertering, volgens de instructies van de fabrikant. RNA werd gekwantificeerd door de absorptie bij 260 nm te meten en omgekeerd getranscribeerd. Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) werd uitgevoerd met behulp van het Bio-Rad iQ5 real-time PCR-systeem volgens de instructies van de fabrikant. De inleidingen die voor omgekeerde transcriptie en qPCR worden gebruikt werden getoond in aanvullende gegevens 7. De gegevens werden genormaliseerd met behulp van endogeen GAPDH mRNA en U6 snRNA. De 2-ΔΔCT methode werd gebruikt om de PCR-gegevens te analyseren.

Cytometrie Flow

de cellen werden op de aangegeven tijdstippen geoogst en tweemaal gewassen met PBS/0,5% BSA bij 4 °C om de Fc-receptoren te blokkeren. De transduced CD34 + HPCs waren gekleurd met APC-geconjugeerde anti-CD14 (kloon: 61D3) of anti-CD11b (kloon: ICRF44) antilichamen (eBioscience, San Diego, CA). BM-cellen van muizen werden bevlekt met een PE-geconjugeerd anti-CD33 antilichaam (kloon: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Cytometry stroom werd uitgevoerd op een C6-Stroomcytometer (Biosciences van BD, Franklin Lakes, NJ). De gegevens werden geanalyseerd met FlowJo software (versie 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

muizen en transplantatietests

alle dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van de Onderzoeksethiekcommissie van het Peking Union Medical College. Tien miljoen CD34 + HPCs besmet met lenti-sh-KSRP, lenti-129 of Lenti-GFP controle werden gewassen en geresuspendeerd in PBS en dan ingespoten in de zijstaartader van 4 weken tot 6 weken oude vrouwelijke nod/SCID ontvanger muizen die met röntgenstralen bij een dosis van 250 cGy worden bestraald. Vier weken na de transplantatie van de CD34+ HPCs, werden de muizen opgeofferd, en de BM en milten werden verzameld en verwerkt tot eencellige suspensies voor de volgende experimenten. De resultaten werden verkregen van 4 muizen per groep.

Western blot

hele-cel lysaten werden onderworpen aan Western blot analyse. Konijn polyclonal anti-KSRP antilichaam (6994-1; 1: 1000) en anti-RUNX1 antilichaam (ab35962; 1:1000) dat van Epitomics (Abcam, Cambridge, MA), of een GAPDH antilichaam (60004-1 – IG, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) werden gebruikt als primaire antilichamen en geïncubeerd in 1× TBST met 5% BSA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) met continu schudden. Na wassen met 1 × TBST gedurende 15 minuten op RT, werden de membranen geïncubeerd met een HRP-geconjugeerde geit anti-konijn secundaire Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) gedurende 1 uur op RT. na een laatste wastap met 1× TBST gedurende 15 minuten op RT, werden de immunoreactieve banden gevisualiseerd door verbeterde chemiluminescentie (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) op de aangegeven Blootstellingstijd (“Blootstellingstijd voor Western blot”). Alle niet gekropte western blots zijn te vinden in aanvullende Fig. 11.

in vivo processing assay bij zebravis

embryo ‘ s werden verzameld in een laboratorium broedkolonie van zebravis uit Tuebingen, gehuisvest bij 28 °C in een 14:10 uur licht/donker cyclus en gekweekt onder standaardomstandigheden (China zebrafish Resource Center). KSRP mRNA en GFP-Pri-129 WT of ksrp-bindende plaats mutant mRNAs werden samengesteld in vitro van overeenkomstige linearized plasmiden gebruikend de Mmessage mMACHINE uitrusting (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). KSRP mRNA en GFP-Pri-129_WT mRNA (of GFP-Pri-129_Mut mRNA) werden gelijktijdig geïnjecteerd in één-cel Stadium zebravis embryo ‘ s. De embryo ‘ s werden geënsceneerd bij 28 °C volgens de h.p.f. en morfologische criteria52. Beelden van embryo ‘ s geënsceneerd op 4 H.p.f. en 24 h.p.f. werden verkregen met behulp van een Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Duitsland).

in vivo processing assay in 293TN cellen

293TN cellen werden gekweekt in 6-put platen gedurende 24 uur tot ze ≈70-80% samenvloeiing bereikten. De cellen werden gelijktijdig getransfecteerd met de EGFP fusion Pri-129_WT of mutant Pri-129 plasmiden, pcDNA4-RFP en het pcmv-KSRP plasmide met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vierentwintig uren later, werden de cellen geanalyseerd onder een Zeiss fluorescentiemicroscoop bij 400 × vergroting (Carl Zeiss Microscopy GmbH). RNA werd ook geëxtraheerd voor een qPCR-analyse van verwerkingsefficiency door primaire mir-129 Versus Rijpe mir-129 te ontdekken. De fluorescentie intensiteit werd gekwantificeerd met behulp van Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ proximity ligation assay

In situ PLAs werden gedaan volgens het fabricageprotocol (Sigma-Aldrich). Konijn anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1: 50) en konijn anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) werd gecombineerd met anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canada; 1:50), of normaal konijn IgG polyclonal antilichaam (12-370, Merck Millipore, Duitsland; 1:50) voor de primaire antilichamen. Anti-KSRP en normaal konijn IgG polyclonal antilichaam als een negatieve controle. Alvorens te blokkeren, werden 293T of HeLa cellen gekweekt op chambered dia ‘ s (Sigma), gefixeerd in 10% formaldehyde, permeabilized met 0,25% Triton X-100-PBS. De cellen werden geanalyseerd door Zeiss lsm780 confocale immunofluorescentiemicroscopie (Zeiss, Duitsland) gevolgd door deconvolutie met Huygens essentiële versie 16.05 (Scientific Volume Imaging, Nederland, http://svi.nl). PLA-punten per cel werden gekwantificeerd met BlobFinder v3. 2 beeldanalysesoftware (Universiteit van Uppsala, Stockholm, Zweden) en het gemiddelde aantal PLA-punten per cel werd berekend door een minimum van 100 cellen te analyseren.

Bioinformatica-analyse

alle gepaarde eindwaarden werden getrimd voor adaptersequentie met Trim Galore (versie 0.3.7) met parameters “-q 25 –stringency 5 –length 50 –paired –phred33” en gefilterd voor sequentie van lage kwaliteit. Het hg38 referentiegenoom (GRCh38) en genannotatiebestand (GTF-formaat) zijn gedownload van GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/)53. TopHat54, 55 (Versie 2.1.0) werd gebruikt om de gefilterde reads uit te lijnen met het hg38 genoom referentie genoom met standaardinstellingen, en FPKMs (fragmenten Per Kilobase transcriptome per miljoen reads) werden verkregen met behulp van Manchetknopen 54 (Versie 2.2.1) met standaard parameters. Expressieniveaus werden geschat met functie tellingen 56 (Versie 1.5.0) met parameters “-T 7 –primair”, gen-niveau ruwe tellingen werden afgeleid van de som van de overeenkomstige waarden voor alle isovormen van een gen.

EBSeq-HMM18 werd gebruikt om de verschillen in genexpressie tussen drie stadia van monocyt en granulocyt differentiatie, respectievelijk te analyseren. Er zijn twee belangrijke stappen voor EBSeq-HMM om differentieel tot expressie gebrachte (DE) genen te krijgen:

1. 1)

   het ontdekken van de genen die significante verandering tussen om het even welke twee stadia onder een tarief van de doel valse ontdekking (FDR) van 0,05 toonden.

2. 2)

   het clusteren van de genen in expressiepaden met de maximale posterieure waarschijnlijkheid (PP) groter dan 0,5.

door EBSeq-HMM te gebruiken, verkregen we de genen en de bijbehorende expressiepaden (d.w.z., “omhoog-omlaag”) op dag 5, 10 en 15 van monocyt (of granulocyt) differentiatie (aanvullende Data 1). Het expressiepad “omhoog-omlaag” vertegenwoordigt dat een gen op dag 10 vergeleken met DAG 5 up-geregeld was terwijl neerreguleerd op dag 15 vergeleken met dag 10. Monotoon verhoogde (“Up-Up”) of verlaagde (“Down-Down”) genen, tijdens monocyt (of granulocyt) differentiatie werden gekozen voor verdere analyse.

genexpressie niveaus werden geschat met behulp van de FPKM, en alle genen met de fpkm ≥ 1 als de tot expressie gebrachte genen werden gebruikt voor verdere analyse. Informatie over RBP is gedownload van rbpdb19 en ATtRACT20 databases. We ontwikkelden een R-script (aanvullende Data 8) om de genen te classificeren met “Up-Up” of “Down-Down” expressiepaden (aanvullende Data 2, 3) in verschillende expressiepatronen.

de heat maps werden getekend met behulp van de functie ‘pheatmap’ van R pakketten ‘pheatmap’ en het VennDiagram werden getekend met behulp van de functie ‘draw.paarsgewijs.venn ‘van R pakket “VennDiagram”. K-means clustering werd uitgevoerd met de output van functie ‘ pheatmap ‘en clusters werden verkregen met functie’ cutree ‘ door gebruik te maken van R.

plasmide elektrotransfecties

we gebruikten het Neon transfectie systeem volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, Carlsbad, CA) om de plasmide transfectie efficiëntie in THP-1 cellen te verbeteren voor de RNA-seq analyse. Cellen werden elektrotransfect met plasmiden (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP of pSIH-H1-sh-KSRP). De elektroporatieparameters voor 1 × 107 THP-1 of NB4 cellen waren een 1350-V puls, 10-ms pulsbreedte en 4 pulsen met behulp van een 10-µL tip. Achtenveertig uren later, werd de electrotransfection efficiency ontdekt door Western blotting of qPCR.

Rescue assays

om te valideren dat KSRP pri-mir-129-verwerking bevordert om de differentiatie van myeloïde afstamming te reguleren, werden THP-1-cellen getransfecteerd met pEGFP-KSRP met behulp van Lipofectamine 2000, en 24 uur later werden de cellen getransfecteerd met een mir-129-remmer. NB4 cellen werden getransfecteerd met si-KSRP bij een definitieve concentratie van 100 nM gebruikend DharmFECT1, en 24 h later werden de cellen getransfecteerd met Mir-129 nabootsend. Om te valideren dat miR-129 target RUNX1 myeloïde afstamming differentiatie reguleert, THP-1 en NB4 cellen werden getransfecteerd met si-RUNX1 en een mir-129 remmer of hun controles door het neon transfectiesysteem. De cellen werden dan gestimuleerd met PMA of ATRA voor een extra 48 h alvorens voor volgende analyses te worden geoogst. De uitdrukking CD14 in THP-1 cellen die monocytic differentiatie ondergaan en de uitdrukking CD11b in NB4 cellen die granulocytic differentiatie ondergaan werden geanalyseerd door cytometry stroom.

belichtingstijd voor Western blot

het grootste deel van de Western blot is ontwikkeld door Tanon 5200 automatic digital gel image analysis system (Tanon, Shanghai, China), en de belichtingstijd van GAPDH is 150-350 ms. in Fig. 2a, belichtingstijd van monsters langs monocytaire differentiatie is 20 s voor KSRP; belichtingstijd van monsters langs granulocytaire differentiatie is 200 ms voor KSRP. In Fig. 2b, belichtingstijd is 20 s voor KSRP. In Fig. 4f-h, belichtingstijd is 60 s voor KSRP. In Fig. 5b, belichtingstijd is 60 s voor Drosha, DGCR8 en KSRP. In Fig. 6J, k, belichtingstijd is 90 s voor RUNX1. In Fig. 7g, belichtingstijd is 90 s voor RUNX1 en KSRP. In Fig. 7u, belichtingstijd is 30 s voor RUNX1 en KSRP. In Aanvullende Fig. 2a, belichtingstijd van monsters langs monocytaire differentiatie is 3 s voor KSRP; belichtingstijd van monsters langs granulocytaire differentiatie is 300 ms voor KSRP. In Aanvullende Fig. 4a, e, f, belichtingstijd is 60 s voor KSRP. In Aanvullende Fig. 7m, belichtingstijd is 10 s en 90 s voor RUNX1 in THP-1 en NB4, respectievelijk. In Aanvullende Fig. 8a, belichtingstijd is 60 s voor RUNX1.

voor andere foto ‘ s die het resultaat van handmatige blootstelling weergeven (Fig. 2d, i; aanvullende Fig. 7n), is de blootstellingstijd voor GAPDH voor geschat 1 s. in Fig. 2d, belichtingstijd is 30 s voor KSRP in PMA-geïnduceerde monsters en 10 s voor KSRP in ATRA-geïnduceerde monsters. In Fig. 2i, belichtingstijd is 60 s voor KSRP. In Aanvullende Fig. 7n, belichtingstijd is 90 s voor RUNX1.

isolatie van monocyten en neutrofielen uit perifeer bloed

geïnformeerde toestemming werd verkregen in overeenstemming met de Institutional Review Board van de Chinese Academy of Medical Science. Menselijke monocyten en neutrofielen werden geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde donoren in 3% dextran en werden geïsoleerd door percoll gradiëntcentrifugatie gevolgd door zuivering met CD14 MicroBeads (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Duitsland) of Easysep Humane Neutrofielverrijkingskit (#19257, Stemcell Technologies, Canada). Na gesorteerd door CD14 microbeads, werden de verkregen CD14 positieve cellen geplateerd in T-25 kolven en gekweekt voor 4-6 h bij 37 °C tot de adherente monocyten werden verzameld door schrapen.

statistische analyse

voor alle onderzoeken is n per groep zoals aangegeven in de figuur legenda. Alle gegevens zijn geanalyseerd met GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc., USA)en gepresenteerd als gemiddelden ± SD. Verschillen tussen experimentele groepen en controlegroepen werden geanalyseerd met behulp van de tweestaart Student T-test. Statistische significantie werd aanvaard bij P < 0,05. Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefgrootte vooraf te bepalen. Alle experimenten werden uitgevoerd met ten minste drie biologische replicaten. We kozen de juiste tests op basis van de datadistributies. De experimenten werden niet gerandomiseerd en we hebben geen monsters uitgesloten. De onderzoekers waren niet geblindeerd voor toewijzing tijdens experimenten en resultaatbeoordeling.

beschikbaarheid van gegevens

miRNA-en pri-mir-RNA-sequentiegegevens zijn gedeponeerd in de GEO-database onder toetredingscode GSE87318. De gegevens voor het rangschikken van mRNA zijn ook gedeponeerd in het GEO-gegevensbestand onder toetredingscode GSE87088. Brongegevens voor Fig. 1c-e zijn verstrekt als aanvullende gegevens 1-4. Brongegevens voor Fig. 2b, c zijn verstrekt als aanvullende gegevens 5, 6. Alle andere gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn op verzoek verkrijgbaar bij de desbetreffende auteur.