KSRP especifica monocytic e granulocytic diferenciação através de regulação miR-129 biogênese e runx1 a expressão

Monocytic e granulocytic diferenciação de linhas de células

humano monocytic linha de células THP-1, e o promyelocytic linha de células NB4 e HL-60 foram comprados da ATCC (Manassas, EUA) e mantidos em RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (Gibco, Carlsbad, Autoridade de CERTIFICAÇÃO). As células foram rastreadas por PCR para autenticação e por testes de imunofluorescência para ausência de contaminação por micoplasma. Monocytic diferenciação de THP-1 e HL-60 células foi induzida pelo tratamento das células com 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha) por 0, 24, 48 e 72 h. Granulocytic diferenciação de NB4 e HL-60 células foi induzida pelo tratamento das células com 1 µM ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha). Nenhuma linha celular usada neste estudo foi encontrada no banco de dados de linhas celulares comumente identificadas incorretamente que são mantidas pelo Iclac e NCBI Biosample. As linhagens celulares foram testadas quanto à contaminação por micoplasma, mas não foram re-autenticadas.

a triagem de CD34 + HPCs

o sangue do cordão umbilical humano (UCB) foi obtido a partir de partos normais a termo no Hospital da União de Pequim, e a medula óssea (BM) de doadores normais foi obtida no 307º Hospital do exército de Libertação do Povo Chinês. Obteve-se consentimento informado e aprovação do Comitê de Ética em pesquisa. As frações de células mononucleares (MNC) foram isoladas de UCB e BM usando um gradiente de densidade de Percoll (d = 1,077; Amersham Biotech, Alemanha). As células CD34 + foram enriquecidas a partir de MNCs usando seleção imunomagnética positiva (CD34+ MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Alemanha).

Monocytic diferenciação de HPCs

enriquecidas CD34+ células progenitoras hematopoéticas (HPCs) foram cultivadas em glucose elevada IMDM suplementado com 30% de soro bovino fetal (Hyclone, Logan, Utah), 1% de BSA, 100 µM de 2-ME, de 2 ng/mL humano recombinante, IL-3, 100 ng/mL humano recombinante, SCF, 50 ng/mL humano recombinante, M-CSF, 100 ng/mL humano recombinante FLT3, 1 ng/mL humano recombinante, IL-6, 60 mg/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina para induzir a diferenciação de monócitos. As citocinas foram compradas da Peprotech (Rocky Hill, NJ). As células foram colhidas a cada 3-5 dias. Para análises morfológicas, as células foram manchadas em lâminas de vidro, fixado em metanol (10 min), coradas com May-Grünwald/Giemsa e analisadas à ampliação de 400x sob um microscópio (Nikon TE2000, Japão), equipado com uma câmera digital.

Granulocytic diferenciação de HPCs

enriquecidas CD34+ células progenitoras hematopoéticas (HPCs) foram cultivadas em glucose elevada IMDM suplementado com 30% de soro bovino fetal (Hyclone, Logan, Utah), 1% de BSA, 100 µM de 2-ME, de 2 ng/mL humano recombinante, IL-3, 100 ng/mL humano recombinante, SCF, de 20 ng/mL humano recombinante, G-CSF, de 10 ng/mL humano recombinante, IL-6, 60 mg/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina para induzir granulócitos diferenciação. As citocinas foram compradas da Peprotech (Rocky Hill, NJ). As células foram colhidas a cada 3-5 dias. As análises morfológicas foram realizadas da mesma forma que a diferenciação monocítica.

Oligonucleotídeos e construções

miR-129 imita (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), miRNA inibidores (anti-129) e controle negativo moléculas (NC) foram obtidos a partir de Dharmacon (Austin, TX) e as células foram transfected com uma concentração final de essas construções de 100 nM, usando DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNAs (especificamente para KSRP e RUNX1) e siRNAs de controle (Si-Con) foram sintetizados por Dharmacon e as células foram transfectadas com siRNAs de 100 nM usando DharmFECT1.

para a superexpressão KSRP, o clone humano KSRP (NM_003685.2) cDNA ORF (pEGFP-KSRP) foi comprado da Addgene (Addgene, MA). Para KSRP knockdown, KSRP Sh-RNA foi clonado no vetor pSIH-H1 A Jusante do promotor H1 (lenti-sh_KSRP) ou comprado diretamente na forma de construções lentivirais (TL311984, Origene, Rockville, MD). Para pri-129-1 sobre-expressão, uma construção do tipo selvagem de 700 bp foi clonada no vetor pCMV6 (129_wt) ou no plasmídeo pMIRNA1 (lenti-129). Os locais mutantes de ligação KSRP em pri-129-1 (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 e 129_mutf) também foram criados em vetores pCMV6. Para mir-129 knockdown, miRZIP – 129 e miRZIP-control foram adquiridos da system Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Para a superexpressão RUNX1, RUNX1 ORF foi clonado no vetor pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

para o ensaio de gene repórter de alvos miR-129, a sequência complementar reversa para mir-129 foi inserida no pmir-repórter a jusante do gene firefly luciferase para gerar o construto repórter positivo (129_positivo). O 3 ‘ – UTR do mRNA RUNX1 humano foi amplificado e clonado no mesmo pmir-repórter a jusante do gene firefly luciferase para formar o repórter do tipo selvagem (RUNX1_WT). Mutações dos locais de ligação miR-129 no 3 ‘ – UTR de sequências humanas de mRNA RUNX1 foram criadas usando o Kit de mutagênese dirigido por site QuickChange (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 e RUNX1_Mut3). As células foram transfectadas com esses construtos usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para células 293TN ou Lipofectamina LTX&PLUS para células THP-1 e células NB4, de acordo com os protocolos do fabricante. Todos os primers estão listados em dados suplementares 7.

Lentivirus production

o kit de embalagem lentivirus apropriado foi adquirido da System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) e usado de acordo com as diretrizes do fabricante. Colhida partículas virais (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-runx1 a, lenti-sh_RUNX1, e lenti-GFP) foram adicionados para CD34+ HPCs, THP-1 ou NB4 células, e as células foram então lavadas com IMDM após 24 horas e banhado por experimentos subsequentes.

sequenciamento profundo de miRNA

as células THP-1 foram eletroporadas com pEGFP-KSRP ou pEGFP usando o sistema de transfecção de néon e, em seguida, classificadas por FACS para coletar as células GFP-positivas. Pequenos RNAs foram isolados do RNA total com o kit de isolamento mirVana miRNA (Ambion, Austin, TX), de acordo com as instruções do fabricante. Pequenas bibliotecas de RNA e sequenciamento de miRNA foram realizadas pela Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, China) usando um Illumina HiSeq2000 (Illumina, EUA). Os dados de sequenciamento foram filtrados, os perfis de expressão foram construídos e as leituras do dímero adaptador foram separadas das leituras miRNA que já haviam sido identificadas no miRbase 17.0. Os dados de RNA-seq foram analisados por Genergy Bio e uma lista de miRNAs cuja expressão foi aumentada após a superexpressão de KSRP é mostrada nos dados suplementares 5, 6.

Rna enriquecido com poli(a) sequenciamento profundo

o RNA Total foi extraído usando reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante, para preparar a biblioteca RNA-seq enriquecida com poli(a). Bibliotecas de RNA enriquecidas com poli(A) e RNA-seq profundo foram adaptadas a Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) e foram realizadas por Genergy Bio. Uma lista completa de miRNAs primários cuja expressão diminuiu após a superexpressão KSRP está listada nos dados suplementares 5, 6.

análise de raça

para identificar o comprimento total da raça primária-129-1, 5′ e 3′, as reações foram realizadas no RNA total das células THP-1 usando o kit de corrida completo de 5’e kit de corrida completo de 3′(TaKaRa, Dalian, China) de acordo com o manual do fabricante. Os primers usados para o experimento de corrida estão listados em dados suplementares 7.

Luciferase reporter assay

para análises mecanísticas funcionais do miR-129-1, previmos vários alvos miR-129-1 usando o software de Bioinformática Targetscan e Miranda e validamos os candidatos com o ensaio luciferase reporter. As células 293TN foram co-transfectadas com 0,4 µg do construto repórter, 0,015 µg do vetor controle pRL-TK e 5 pmol do mir-129 mímico ou controle negativo mímico. Após 48 h, as células foram colhidas e testadas com o Kit de ensaio Dual Luciferase (Promega, Madison, WI), de acordo com as instruções do fabricante. Todos os ensaios de transfecção foram realizados em triplicado.

ensaio de Processamento in vitro

o ensaio de processamento foi realizado usando uma célula hela NE de 10 mg / mL. Para a depleção de KSRP, dez microlitros de anticorpo KSRP foram adicionados a 1 mg de HeLa cell NE e um anticorpo IgG foi adicionado como controle. Após uma incubação de 30 minutos a 4 ° C, O complexo de proteínas e anticorpos KSRP foi imunoprecipitado com grânulos de proteína a (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). O sobrenadante é o extrato nuclear esgotado pelo KSRP (ΔKSRP-NE). O 700-nt, tipo selvagem pri-129-1 (129_wt) e pri-129-1 marcado com isótopos contendo todos os quatro mutantes do local de ligação KSRP (129_mut) foram preparados por transcrição in vitro padrão com T7 RNA polimerase na presença de-UTP usando as construções 129_WT e 129_mut. 129_wt e 129_mut foram incubados com hela cell NES (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) por 30 min a 37 °C, na presença de KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), e 4 pmol (4×)). As misturas de reação foram submetidas a fenol: extração de clorofórmio, precipitação e eletroforese em gel desnaturante, seguida de autoradiografia.

o ensaio de processamento de resgate foi realizado. Brevemente, 20 µL de ΔKSRP-NE foi incubado com 1 pmol de -UTP-rotulado como principal miR-129 e diferentes quantidades de KSRP (0,5 µg) para diferentes tempos (15, 40 e 60 min) a 37 °C. A reação misturas foram tratados com proteinase K por 30 min a 37 °C e, em seguida, submetidos a fenol:extração de clorofórmio, precipitação e eletroforese em gel desnaturante, seguida de autoradiografia. Todos os géis de RNA não cortados podem ser encontrados na Fig suplementar. 12.

Northern blot

um total de amostras de RNA de 40 µg foram carregadas e executadas em géis de poliacrilamida desnaturantes (ureia) a 12% e depois transferidas para membranas Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A hibridação foi realizada com digoxigenina (DIG)-marcado pri-miR-129, γ-32P – marcado pré ou Maduro mir-129-5P sonda durante a noite a 42 °C. U6 snRNA e rRNA foram servidos como controles de carregamento para miRNA pré, Maduro ou Primário, respectivamente. O nível de expressão foi medido pela normalização para a expressão de U6 snRNA ou rRNA. As sequências de sonda de oligonucleotídeo estão listadas em dados suplementares 7. A expressão de miRNA foi quantificada pelo software Image J. Toda a mancha Norte não cortada pode ser encontrada na Fig suplementar. 12.

ensaio de IMUNOPRECIPITAÇÃO de RNA

quantidades iguais de células THP-1 ou NB4 foram colhidas em PBS geladas. Em seguida, as pelotas celulares foram ressuspendidas em 1 mL de tampão de lise B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mm PMSF, 1 mM aprotinina, 1 mm leupeptina e 2 mm vanadil ribonucleosídeo complexos (VRC)) e sonicação suave. Após os lisados foram centrifugadas a 12.000 rpm por 15 min, o sobrenadante foram precleared com Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) em tampão de lise B com 10 µg de levedura tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha). Em seguida, o precleared os lisados foram usadas para RASGAR com um anti-KSRP de anticorpos (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) ou um coelho isotype IgG (12-370, a Merck Millipore, Alemanha; 1:500) como o controle para 4 h a 4 °C. Os grânulos foram lavados três vezes com tampão de lise B, com a última lavagem contendo um desoxicolato de sódio adicional de 0,5%, seguido de extração com tampão C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-mercaptoetanol e 20% glicerol) à temperatura ambiente por 10 min. O RNA imunoprecipitado foi extraído com Trizol e fenol-clorofórmio. Para RT-PCR, cada amostra de RNA foi tratada com DNase I (Ambion, Kit TM sem DNA). Em seguida, quantidades iguais foram reversas transcritas com o kit de transcrição reversa cDNA de alta capacidade (Invitrogen, Carlsbad, CA). O enriquecimento da dobra dos RNAs por KSRP foi medido por eletroforese em gel de qPCR e agarose. Os primers usados para os experimentos RIP-PCR estão listados em dados suplementares 7.

Imunoprecipitação dos complexos proteína-RNA

Maltose-binding protein (MBP)-purificação de afinidade foi usada para identificar proteínas associadas a miRNAs primários. O plasmídeo de expressão MS2-MBP foi um presente do Dr. Lingling Chen (Academia Chinesa de Ciências) e o MS2-MBP foi expresso e purificado de E. coli usando um protocolo do Steize lab (Universidade de Yale). Três sítios de ligação à proteína de revestimento MS2 (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagcccatggcgtaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3′) foram inseridos a jusante da sequência do gene pri-129-1 ou das sequências mutantes do local de ligação pri-129-1 KSRP. As células 293tn foram transfectadas com construtos contendo MS2 para obter proteínas associadas a miRNAs primários, e 10 milhões de células foram usadas para cada ensaio de imunoprecipitação. As células foram colhidas 48 h pós-transfecção e submetidas à análise de pull-down de RNA. Em resumo, as células foram enxaguadas duas vezes com PBS gelado antes da colheita em 10 mL de PBS gelado por raspagem. Em seguida, os pellets celulares foram ressuspendidos em tampão IP de 1 mL (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, coquetel inibidor de proteinase), e submetidos a 2 rodadas de sonicação suave e centrifugados para obter extratos celulares. O sobrenadante foi primeiro incubado com MS2-MBP por 1 hora e depois grânulos de resina de amilose (NEB) por mais 1 hora a 4 C. Os grânulos foram lavados cinco vezes com tampão IP com rocha suave e uma última lavagem com tampão IP fornecido com NaCl adicional de 150 mM. Os componentes de proteína finalmente foram eluídas de contas com o IP buffer complementada com 12 mM de Maltose, e foram verificados por WB com os seguintes anticorpos primários: coelho anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), de coelho anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), de coelho anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) e de rato anti-GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech; 1:1,000,000).

RNase H ensaio de protecção

Um padrão de RNase H a proteção de reação foi realizada em um volume total de 25 µL contendo 1 pmol de KSRP de proteína, 1 pmol de -UTP-rotulado de RNA, de 20 µg/mL de DNA de oligonucleotídeos, 12 mM de HEPES (pH 8,0), 60 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 20 U de RNasin (40 U/µL, Promega, Madison, WI), e 1 U de E. coli RNase H. Para o controle, uma reação com a correspondente quantidade de deproteinized -UTP-rotulado de RNA e o mesmo iônica condições como o extrato foi preparado e incubadas a 25 °C por 15 min. A reação foi terminada adicionando 75 µL de H2o destilado, 100 µL de tampão 2 × PK e 4 µL de proteinase K (10 mg/mL), e o RNA foi preparado conforme descrito no ‘qPCR’ para analisar os fragmentos de RNA. O RNA foi ressuspendido em 25 µL de tampão de carregamento de gel de ureia (5 mm EDTA, 10% (V/v) glicerol, 0,05% (w/v) xileno Cianol FF, 0,05% (W/V) Azul de bromofenol e 50% formamida desionizada) e separado em géis desnaturantes de ureia, seguido de autoradiografia.

qPCR

o RNA Total foi extraído das células e tecidos usando reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguido de digestão DNase I, de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi quantificado medindo a absorbância a 260 nm e transcrito reverso. O PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi realizado usando o sistema de PCR em tempo real Bio-Rad IQ5 de acordo com as instruções do fabricante. Primers usados para transcrição reversa e qPCR foram mostrados em dados suplementares 7. Os dados foram normalizados usando mRNA endógeno de GAPDH e snRNA U6. O método 2-ΔΔCT foi utilizado para analisar os dados de PCR.

citometria de fluxo

as células foram colhidas nos pontos de tempo indicados e lavadas duas vezes com PBS/0,5% BSA a 4 °C para bloquear os receptores Fc. Os CD34+ HPCs transduzidos foram corados com anticorpos anti-CD14 conjugados com APC (clone: 61D3) ou anti-CD11b (clone: ICRF44) (eBioscience, San Diego, CA). Células Bm de camundongos foram coradas com um anticorpo anti-CD33 conjugado com PE (clone: HIM3-4 eBioscience, CA, EUA). A citometria de fluxo foi realizada em um Citômetro de fluxo C6 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Os dados foram analisados por meio do Software FlowJo (versão 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

camundongos e ensaios de transplante

todos os experimentos em animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Peking Union Medical College. Dez milhões de CD34+ HPCs infectado com lenti-sh-KSRP, lenti-129 ou lenti-GFP de controle foram lavadas e em suspensão em PBS e, em seguida, injetada na veia caudal lateral de 4 semanas a 6 semanas de idade, do sexo feminino NOD/SCID destinatário ratos irradiados com raios-x, na dose de 250 cGy. Quatro semanas após o transplante do CD34+ HPCs, os camundongos foram sacrificados, e o BM e spleens foram coletados e processados em suspensões unicelulares para os experimentos subsequentes. Os resultados foram obtidos de 4 camundongos por grupo.

Western blot

lisados de células inteiras foram submetidos à análise de Western blot. Anticorpo policlonal anti-KSRP do coelho (6994-1; 1:1000) e anticorpo anti-RUNX1 (ab35962; 1:1000) que da Epitômica (Abcam, Cambridge, MA), ou um anticorpo GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) foram utilizados como anticorpos primários e incubados em 1 × TBST contendo 5% de BSA por 2 h à temperatura ambiente (RT) com agitação contínua. Após lavagens com 1× TBST por 15 min no RT, as membranas foram incubadas com uma SOLUÇÃO conjugado de cabra anti-coelho secundário Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) por 1 h, a RT. Depois de um final de etapa de lavagem com 1× TBST por 15 min a RT, o imunorreativa bandas foram visualizadas pelo reforço da quimioluminescência (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), no tempo de exposição indicado (“tempo de Exposição “Western blot”). Todas as manchas ocidentais não cortadas podem ser encontradas na Fig suplementar. 11.

ensaio de Processamento in vivo em peixes-Zebra

embriões foram coletados de uma colônia de criação de laboratório de peixes-zebra de Tuebingen alojados a 28 °C em um ciclo claro/escuro de 14:10 h E criados sob condições padrão (China Zebrafish Resource Center). MRNA KSRP e mRNAs mutantes do local de ligação GFP-Pri-129 WT ou KSRP foram sintetizados in vitro a partir de plasmídeos linearizados correspondentes usando o Kit mMESSAGE mMACHINE (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). O mRNA KSRP e o mRNA GFP-Pri-129_wt (ou mRNA GFP-Pri-129_mut) foram co-injetados em embriões de peixe-zebra em estágio de uma célula. Os embriões foram encenados a 28 °C De acordo com o H. p.f.e critérios morfológicos52. Imagens de embriões encenados em 4 H. p. f. e 24 H. p. f.foram adquiridos usando um Zeiss Stereo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha).

ensaio de Processamento in vivo em células 293TN

células 293tn foram cultivadas em placas de 6 poços por 24 h até atingirem a confluência ≈70-80%. As células foram co-transfectadas com o EGFP fusion Pri-129_wt ou plasmídeos mutantes Pri-129, pcDNA4-RFP e o plasmídeo pCMV-KSRP usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vinte e quatro horas depois, as células foram analisadas sob um microscópio de fluorescência Zeiss com ampliação de 400× (Carl Zeiss Microscopy GmbH). O RNA também foi extraído para uma análise qPCR da eficiência de processamento, detectando o mir-129 primário vs. o mir-129 Maduro. A intensidade da fluorescência foi quantificada usando o software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

ensaio de ligadura de proximidade in situ

PLAs in situ foram feitos seguindo o protocolo de fabricação (Sigma-Aldrich). Coelho anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) e de coelho anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) foi emparelhado com anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canadá; 1:50), ou normal coelho IgG anticorpo policlonal (12-370, a Merck Millipore, Alemanha; 1:50) para o primário anticorpos. Anticorpo policlonal IgG anti-KSRP e coelho normal como controle negativo. Antes do bloqueio, células 293t ou HeLa foram cultivadas em lâminas chanfradas (Sigma), fixadas em formaldeído a 10%, permeabilizadas com Triton X-100-PBS a 0,25%. As células foram analisadas por microscopia de imunofluorescência confocal Zeiss Lsm780 (Zeiss, Alemanha) seguida de desconvolução com Huygens Essential versão 16.05 (Scientific Volume Imaging, Holanda, http://svi.nl). Os pontos PLA por célula foram quantificados com o software de análise de imagem BlobFinder V3.2 (Uppsala University, Estocolmo, Suécia) e o número médio de pontos PLA por célula foi calculado analisando um mínimo de 100 células.

análise de Bioinformática

todas as leituras emparelhadas foram cortadas para a sequência do adaptador usando Trim Galore (versão 0.3.7) com parâmetros “- q 25 — stringency 5 — length 50 — coupled — phred33 ” e filtradas para sequência de baixa qualidade. O genoma de referência Hg38 (GRCh38) e o arquivo de anotação de genes (formato GTF) foram baixados do gencode Release 24 (http://www.gencodegenes.org/)53. TopHat54, 55 (Versão 2.1.0) foi usado para alinhar as leituras filtradas ao genoma de referência do genoma hg38 com configurações padrão, e FPKMs (fragmentos por transcriptoma de Kilobase por milhão de leituras) foram obtidos usando Cufflinks54 (Versão 2.2.1) com parâmetros padrão. Os níveis de expressão foram estimados usando Contagem de características56 (Versão 1.5.0) com os parâmetros “- t 7-primário”, as contagens brutas no nível do gene foram derivadas da soma dos valores correspondentes para todas as isoformas de um gene.

EBSeq-HMM18 foram utilizados para analisar as diferenças na expressão gênica entre três estágios de diferenciação de monócitos e granulócitos, respectivamente. Existem duas etapas principais para o EBSeq-HMM obter genes diferencialmente expressos (de) :

1. 1)

   detecção de genes DE que mostraram mudança significativa entre quaisquer dois estágios sob uma taxa de descoberta falsa alvo (FDR) de 0,05.

2. 2)

   agrupar genes em caminhos de expressão com a probabilidade posterior máxima (PP) maior que 0,5.

usando EBSeq-HMM, obtivemos genes DE e seus caminhos de expressão correspondentes (ou seja, “Up-Down”) no dia 5, 10 e 15 de diferenciação de monócitos (ou granulócitos) (dados suplementares 1). O caminho de expressão “Up-Down” representa que um gene foi regulado para cima no dia 10 em comparação com o dia 5, enquanto regulado para baixo no dia 15 em comparação com o dia 10. Genes monotonicamente aumentados (“Up-Up”) ou diminuídos (“Down-Down”), durante a diferenciação de monócitos (ou granulócitos) foram escolhidos para análise posterior.Os níveis de expressão gênica foram estimados usando o FPKM, e todos os genes com o FPKM ≥ 1 como os genes expressos foram usados para análise posterior. As informações do RBP foram baixadas dos bancos de dados RBPDB19 e ATtRACT20. Desenvolvemos um script R (dados suplementares 8) para genes de classificados com caminhos de expressão “Up-Up” ou “Down-Down” (dados suplementares 2, 3) em diferentes padrões de expressão.

os mapas de calor foram desenhados usando a função ‘pheatmap’ de pacotes R ‘pheatmap’ e o VennDiagram foram desenhados usando a função ‘draw.em pares.venn ‘do pacote R ‘VennDiagram’. K-means clustering foi realizada com a saída da função ‘pheatmap’ e clusters foram obtidos com a função ‘cutree’ usando R.

Plasmídeo electrotransfections

usamos o Neon Transfection Sistema de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) para melhorar o plasmídeo de transfeccao de eficiência no THP-1 células para o RNA-seq análise. As células foram electrotransfected com plasmídeos (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP ou pSIH-H1-sh-KSRP). Os parâmetros de eletroporação para células 1 × 107 THP-1 ou NB4 foram um pulso de 1350 V, largura de pulso de 10 ms e 4 pulsos usando uma ponta de 10 µL. Quarenta e oito horas depois, a eficiência de eletrotransfecção foi detectada por Western blotting ou qPCR.

ensaios de resgate

para validar que o KSRP promove o processamento pri-miR-129 para regular a diferenciação da linhagem mielóide, as células THP-1 foram transfectadas com pEGFP-KSRP usando Lipofectamina 2000 e 24 h depois, as células foram transfectadas com um inibidor miR-129. As células NB4 foram transfectadas com si-KSRP em uma concentração final de 100 nM usando DharmFECT1, e 24 h depois as células foram transfectadas com um mir-129 mímico. Para validar que o alvo RUNX1 mir-129 para regular a diferenciação da linhagem mielóide, as células THP-1 e NB4 foram transfectadas com si-RUNX1 e um inibidor miR-129 ou seus controles pelo sistema de transfecção de néon. As células foram então estimuladas com PMA ou ATRA por mais 48 h antes de serem colhidas para análises subsequentes. A expressão de CD14 em células THP-1 submetidas a diferenciação monocítica e a expressão de CD11b em células NB4 submetidas a diferenciação granulocítica foram analisadas por citometria de fluxo.

tempo de exposição para Western blot

A maior parte do western blot foi desenvolvida pelo sistema automático de análise de imagem em gel Digital Tanon 5200 (Tanon, Xangai, China), e o tempo de exposição do GAPDH é de 150-350 ms. na Fig. 2a, o tempo de exposição das amostras ao longo da diferenciação monocítica é de 20 s para KSRP; o tempo de exposição das amostras ao longo da diferenciação granulocítica é de 200 ms para KSRP. Na Fig. 2b, o tempo de exposição é 20 s para KSRP. Na Fig. 4f-h, o tempo de exposição é 60 s para KSRP. Na Fig. 5b, o tempo de exposição é 60 s para Drosha, DGCR8 e KSRP. Na Fig. 6j, k, o tempo de exposição é de 90 s para RUNX1. Na Fig. 7g, o tempo de exposição é 90 s para RUNX1 e KSRP. Na Fig. 7h, o tempo de exposição é de 30 s para RUNX1 e KSRP. Em Suplementar Fig. 2a, o tempo de exposição das amostras ao longo da diferenciação monocítica é de 3 s para KSRP; o tempo de exposição das amostras ao longo da diferenciação granulocítica é de 300 ms para KSRP. Em Suplementar Fig. 4a, e, f, o tempo de exposição é 60 s para KSRP. Em Suplementar Fig. 7m, o tempo de exposição é 10 s e 90 S para RUNX1 em THP-1 e NB4, respevtively. Em Suplementar Fig. 8a, o tempo de exposição é de 60 s para RUNX1.

para outras imagens que mostram o resultado da exposição manual (Fig. 2D, i; suplementar Fig. 7n), o tempo de exposição para GAPDH é estimado em 1 s. na Fig. 2d, o tempo de exposição é de 30 s para KSRP em amostras induzidas por PMA e 10 S para KSRP em amostras induzidas por ATRA. Na Fig. 2i, o tempo de exposição é 60 s para KSRP. Em Suplementar Fig. 7n, o tempo de exposição é 90 s para RUNX1.

Isolamento de monócitos e neutrófilos do sangue periférico

o consentimento Informado foi obtido de acordo com o Conselho de Revisão Institucional da Academia Chinesa de Ciências Médicas. Humanos monócitos e neutrófilos foram isoladas do sangue periférico de doadores saudáveis em 3% dextran e foram isoladas por gradiente de percoll a centrifugação, seguida de purificação por CD14 micro-esferas (130-050-201, Miltenyl Biotec, em Bergisch-Feliz-bach, Alemanha) ou EasySep Neutrófilo Humano Enriquecimento Kit (#19257, Stemcell Tecnologias, Canadá). Após ordenadas por microesferas CD14, as células CD14 positivas obtidas foram revestidas em frascos T-25 e cultivadas por 4-6 h a 37 °C até que os monócitos aderentes fossem coletados por raspagem.

análise estatística

para todos os estudos, n Por Grupo é como indicado na legenda da figura. Todos os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc. EUA) e apresentado como meios ± DP. As diferenças entre os grupos experimentais e os grupos controle foram analisadas usando o teste T de Student de duas caudas. A significância estatística foi aceita em P < 0,05. Não foram utilizados métodos estatísticos para predeterminar o tamanho da amostra. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três repetições biológicas. Escolhemos os testes apropriados de acordo com as distribuições de dados. Os experimentos não foram randomizados e não excluímos nenhuma amostra. Os investigadores não foram cegados para alocação durante experimentos e avaliação de resultados.

disponibilidade de dados

os dados de sequenciamento miRNA e pri-mir-RNA foram depositados no banco de dados GEO sob o código de adesão GSE87318. Os dados para sequenciamento de mRNA também foram depositados no banco de dados GEO sob o código de adesão GSE87088. Dados de origem para a Fig. 1c-e foram fornecidos como dados suplementares 1-4. Dados de origem para a Fig. 2B, c foram fornecidos como dados suplementares 5, 6. Todos os outros dados que apóiam os achados deste estudo estão disponíveis do autor correspondente, mediante solicitação.