KSRP specifikuje monocytární a granulocytární diferenciaci prostřednictvím regulace biogeneze miR-129 a exprese RUNX1

monocytární a granulocytární diferenciace buněčných linií

lidská monocytární buněčná linie THP-1 a promyelocytární buněčná linie NB4 a HL-60 byly zakoupeny od ATCC (Manassas, USA) a udržováno v rpmi1640 doplněno o 10% fetální bovinní sérum (gibco, Carlsbad, CA). Buňky byly vyšetřeny pomocí PCR pro autentizaci a imunofluorescenčními testy na prostotu kontaminace mykoplazmy. Monocytární diferenciace buněk THP-1 a HL-60 byla indukována ošetřením buněk 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Německo) pro 0, 24, 48 a 72 h.granulocytární diferenciace buněk NB4 a HL-60 byla indukována ošetřením buněk 1 µM ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Německo). V databázi běžně chybně identifikovaných buněčných linií, která je udržována ICLAC a NCBI Biosample, nebyly nalezeny žádné buněčné linie použité v této studii. Buněčné linie byly testovány na kontaminaci mykoplazmou, ale nebyly znovu ověřeny.

třídění CD34+ HPCs

lidská pupečníková krev (UCB) byla získána z běžných termínovaných dodávek v nemocnici Peking Union Hospital a kostní dřeň (BM) od normálních dárců byla získána z 307.Nemocnice Čínské lidové osvobozenecké armády. Byl získán informovaný souhlas a souhlas výzkumné Etické komise. Frakce mononukleárních buněk (MNC) byly izolovány z UCB a BM pomocí gradientu hustoty Perkollu (d = 1.077; Amersham Biotech, Německo). Buňky CD34+ byly obohaceny z MNC pomocí pozitivní imunomagnetické selekce (CD34 + MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Německo).

monocytární diferenciace HPC

obohacené CD34+ hematopoetické progenitorové buňky (HPC) byly kultivovány ve vysoce glukózovém IMDM doplněném 30% fetálním bovinním sérem (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng/mL rekombinantního lidského IL-3, 100 ng/mL rekombinantního lidského SCF, 50 ng/mL rekombinantního lidského M-CSF, 100 ng/mL rekombinantního lidského M-CSF lidský FLT3, 1 ng/ml rekombinantní lidský IL-6, 60 mg/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu k indukci diferenciace monocytů. Cytokiny byly zakoupeny od společnosti Peprotech (Rocky Hill, NJ). Buňky byly sklizeny každých 3-5 dní. Pro morfologické analýzy byly buňky rozmazány na skleněných sklíčkách, fixovány v methanolu 10 min, obarveny May-Grünwald / Giemsa a analyzovány při 400násobném zvětšení pod mikroskopem (Nikon TE2000, Japonsko) vybaveným digitálním fotoaparátem.

granulocytární diferenciace HPC

obohacené CD34+ hematopoetické progenitorové buňky (HPC) byly kultivovány ve vysoce glukózovém IMDM doplněném 30% fetálním bovinním sérem (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng/mL rekombinantního lidského IL-3, 100 ng/mL rekombinantního lidského SCF, 20 ng/mL rekombinantního lidského G-CSF, 10 ng/mL rekombinantní lidský IL-6, 60 mg/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu k indukci diferenciace granulocytů. Cytokiny byly zakoupeny od společnosti Peprotech (Rocky Hill, NJ). Buňky byly sklizeny každých 3-5 dní. Morfologické analýzy byly provedeny stejným způsobem jako monocytární diferenciace.

oligonukleotidy a konstrukty

mimiky miR-129 (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), inhibitory miRNA (anti-129) a negativní kontrolní molekuly (NC) byly získány z Dharmaconu (Austin, TX) a buňky byly transfektovány s konečnou koncentrací těchto konstrukcí 100 nM pomocí DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNA (specificky pro KSRP a RUNX1) a kontrolní siRNA (Si-Con) byly syntetizovány Dharmaconem a buňky byly transfektovány 100 nM siRNA pomocí DharmFECT1.

pro nadměrnou expresi KSRP byl lidský klon KSRP (NM_003685.2) cDNA ORF (pEGFP-KSRP) zakoupen od Addgene (Addgene, MA). Pro KSRP knockdown byla KSRP sh-RNA klonována do vektoru pSIH-H1 za promotorem H1 (lenti-sh_KSRP) nebo přímo zakoupena ve formě lentivirových konstrukcí (TL311984, Origene, Rockville, MD). Pro nadměrnou expresi pri-129-1 byl konstrukt divokého typu 700-bp klonován do vektoru pCMV6 (129_WT) nebo do plazmidu pMIRNA1 (lenti-129). Mutantní vazebná místa KSRP v pri-129-1 (129_MUT1, 129_MUT2, 129_MUT3, 129_MUT4 a 129_MUTF) byla také vytvořena ve vektorech pCMV6. Pro mir-129 knockdown byly miRZIP-129 a miRZIP-control zakoupeny od System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Pro nadměrnou expresi RUNX1 byl RUNX1 ORF klonován do vektoru pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

pro reportérský genový test cílů miR-129 byla reverzní komplementární sekvence k miR-129 vložena do pMIR-reportéru za genem světlušky luciferázy, aby se vytvořil pozitivní reportérský konstrukt (129_positive). 3′ – UTR lidské RUNX1 mRNA byla amplifikována a klonována do stejného pMIR reportéru po proudu genu světlušky luciferase za vzniku reportéra divokého typu (RUNX1_WT). Mutace vazebných míst miR-129 v 3 ‚ – UTR lidských RUNX1 mRNA sekvencí byly vytvořeny pomocí sady QuickChange Site-directed Mutagenesis (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 a RUNX1_Mut3). Buňky byly transfektovány těmito konstrukcemi buď za použití Lipofektaminu 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pro 293TN buňky nebo Lipofektaminu LTX& PLUS pro THP-1 buňky a NB4 buňky, podle protokolů výrobce. Všechny primery jsou uvedeny v doplňkových údajích 7.

výroba Lentiviru

příslušná sada balení lentiviru byla zakoupena od System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) a použita podle pokynů výrobce. Sklizené virové částice (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 a lenti-GFP) byly přidány do buněk CD34+ HPCs, THP-1 nebo NB4 a buňky byly poté promyty IMDM po 24 hodinách a pokoveny pro následné experimenty.

Mirna hluboké sekvenování

THP-1 buňky byly elektroporated pEGFP-KSRP nebo pEGFP pomocí neonového transfekčního systému a pak tříděny podle FACS pro sběr GFP-pozitivních buněk. Malé RNA byly izolovány z celkové RNA pomocí izolační sady mirVana miRNA (Ambion, Austin, TX) podle pokynů výrobce. Malé RNA knihovny a sekvenování miRNA byly provedeny společností Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Šanghaj, Čína) pomocí Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA). Data sekvenování byla filtrována, byly vytvořeny profily výrazů a čtení dimeru adaptéru bylo odděleno od čtení miRNA, která již byla identifikována v miRbase 17.0. Data RNA – seq byla analyzována společností Genergy Bio a seznam Mirna, jejichž exprese byla zvýšena při nadměrné expresi KSRP, je uveden v doplňkových datech 5, 6.

hluboké sekvenování RNA obohacené Poly(a)

celková RNA byla extrahována za použití Trizolového činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA) podle pokynů výrobce k přípravě knihovny RNA-seq obohacené poly(a). Poly (a) – obohacené RNA knihovny a hluboké RNA-seq byly přizpůsobeny Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) a byly provedeny Genergy Bio. Úplný seznam primárních Mirna, jejichž exprese se snížila při nadměrné expresi KSRP, je uveden v doplňkových údajích 5, 6.

analýza závodu

k identifikaci celé délky primárního závodu-129-1, 5′ a 3′ byly provedeny reakce na celkové RNA buněk THP-1 pomocí sady 5′-Full RACE Kit a 3′-Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Čína) podle příručky výrobce. Primery použité pro závodní experiment jsou uvedeny v doplňkových údajích 7.

Luciferase reporter assay

pro funkční mechanistické analýzy miR-129-1 jsme předpovídali několik cílů miR-129-1 pomocí bioinformatického softwaru Targetscan a Miranda a ověřili kandidáty pomocí luciferase reporter assay. 293TN buňky byly ko-transfektovány 0,4 µg reportérového konstruktu, 0,015 µg kontrolního vektoru pRL-TK a 5 pmol mimického nebo negativního kontrolního mimiku miR-129. Po 48 hodinách byly buňky odebrány a testovány pomocí sady Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) podle pokynů výrobce. Všechny transfekční testy byly provedeny ve trojím vyhotovení.

in vitro zpracovatelský test

zpracovatelský test byl proveden za použití 10 mg/mL HeLa buňky NE. Pro depleci KSRP bylo přidáno deset mikrolitrů KSRP protilátky k 1 mg HeLa buňky NE a jako kontrola byla přidána IgG protilátka. Po 30minutové inkubaci při 4 °C byl komplex proteinu a protilátek KSRP imunoprecipitován kuličkami proteinu A (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatantem je jaderný extrakt vyčerpaný KSRP(ΔKSRP-NE). Divoký typ pri-129-1 (129_WT) a pri-129-1 značený izotopem 700-nt obsahující všechny čtyři mutanty vázajícího se místa KSRP (129_Mut)byly připraveny standardní in vitro transkripcí s T7 RNA polymerázou v přítomnosti-UTP pomocí konstrukcí 129_WT a 129_Mut. 129_WT a 129_Mut byly inkubovány s hela cell NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) po dobu 30 minut při 37 °C za přítomnosti KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), a 4 pmol (4×)). Reakční směsi byly podrobeny fenolu: extrakci chloroformu, srážení a denaturační gelová elektroforéza, následovaná autoradiografií.

byl proveden test záchranného zpracování. Krátce bylo 20 µL ΔKSRP-NE inkubováno s 1 pmol-UTP značeného primárního miR-129 a různým množstvím KSRP (0,5 µg) pro různé časy (15, 40 a 60 min) při 37 °C. reakční směsi byly ošetřeny proteinázou K po dobu 30 minut při 37 °C a poté podrobeny fenolu:extrakce chloroformu, srážení a denaturační gelová elektroforéza, následovaná autoradiografií. Všechny nekryté RNA gely lze nalézt v doplňkovém obr. 12.

Northern blot

celkem 40 µg vzorků RNA bylo naloženo a spuštěno na denaturačních (močovinových) 12% polyakrylamidových gelech a poté přeneseno na membrány Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybridizace byla provedena pomocí digoxigenin (DIG) značené pri-miR-129, γ-32P značené pre-nebo zralé sondy miR-129-5p přes noc při 42 °C. U6 snRNA a rRNA byly podávány jako ovládací prvky pro pre -, zralé nebo primární miRNA, resp. Úroveň exprese byla měřena normalizací na expresi U6 snRNA nebo rRNA. Sekvence oligonukleotidových sond jsou uvedeny v doplňujících údajích 7. Exprese miRNA byla kvantifikována softwarem Image J. Všechny uncropped Severní skvrna lze nalézt v doplňkovém Obr. 12.

RNA imunoprecipitační test

stejné množství THP-1 nebo NB4 buněk bylo sklizeno v ledově studeném PBS. Dále byly buněčné pelety resuspendovány v 1 mL lyzačního pufru B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotinin, 1 mM leupeptin a 2 mM vanadyl ribonukleosidové komplexy (VRC)) a jemná sonikace. Po odstředění lyzátů při 12 000 ot / min po dobu 15 minut byly supernatanty předběžně vyčištěny Dynabeady (Invitrogen, Carlsbad, CA) v lyzačním pufru B s 10 µg kvasinkové tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Německo). Poté byly precleared lyzáty použity pro RIP buď s anti-KSRP protilátkou (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1: 500) nebo králičím izotypem IgG (12-370, Merck Millipore, Německo; 1: 500) jako kontrola po dobu 4 hodin při 4 °C. Kuličky byly promyty třikrát lýzovým pufrem B, přičemž poslední promývání obsahovalo dalších 0,5% deoxycholátu sodného a následovala extrakce pufrem C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-merkaptoethanolu a 20% glycerolu) při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Imunoprecipitovaná RNA byla extrahována Trizolem a fenol-chloroformem. Pro RT-PCR byl každý vzorek RNA ošetřen Dnázou I (Ambion, DNA-free TM kit). Poté byla stejná množství reverzní transkripce s vysokokapacitní cDNA reverzní Transkripční soupravou (Invitrogen, Carlsbad, CA). Násobné obohacení RNA KSRP bylo měřeno elektroforézou qPCR a agarózovým gelem. Primery použité pro experimenty s RIP-PCR jsou uvedeny v doplňkových údajích 7.

Imunoprecipitace komplexů protein-RNA

k identifikaci proteinů spojených s primárními Mirna byla použita afinitní purifikace proteinu vázajícího maltózu (MBP). MS2-MBP exprese plasmid byl dar od Dr. Lingling Chen (Čínská akademie věd) a MS2-MBP byl exprimován a purifikován z E. coli pomocí protokolu z laboratoře Steize (Yale University). Za sekvenci genu pri-129-1 nebo za mutantní sekvence vazebného místa pri-129-1 KSRP byla vložena tři místa vázající protein MS2 (5′-cgtakaccatcaggagctagcccatggcgtacaccatcagggtacctcgtacaccatcagggtacg-3′). 293TN buňky byly transfektovány konstrukcemi obsahujícími MS2 za účelem získání proteinů spojených s primárními miRNA a pro každý imunoprecipitační test bylo použito 10 milionů buněk. Buňky byly odebrány 48 hodin po transfekci a podrobeny RNA pull-down analýze. Stručně řečeno, buňky byly dvakrát opláchnuty ledově studeným PBS před sklizní v 10 mL ledově studeného PBS škrábáním. Poté byly buněčné pelety resuspendovány v 1 mL IP pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, koktejl inhibitoru proteinázy) a podrobeny 2 kolům jemné sonikace a centrifugovány za účelem získání buněčných extraktů. Supernatant byl nejprve inkubován s MS2-MBP po dobu 1 hodiny a poté s kuličkami amylózové pryskyřice (NEB) po dobu dalších 1 hodiny při 4 C. kuličky byly pětkrát promyty IP pufrem s jemnou horninou a posledním promytím IP pufrem dodaným s přídavným 150 mM NaCl. Proteinové složky byly nakonec eluovány z kuliček s IP pufrem doplněným 12 mM maltózou a byly kontrolovány WB s následujícími primárními protilátkami: králičí anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1: 1000), králičí anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), králičí anti-KSRP (6994-1, Epitomika; 1:1000) a myší anti-gapdh (60004-1-Ig, Proteintech; 1:1 000 000).

test ochrany Rnázy h

byla provedena standardní ochranná reakce Rnázy H v celkovém objemu 25 µL obsahujícím 1 pmol proteinu KSRP, 1 pmol RNA značené-UTP, 20 µg/mL DNA oligonukleotidů, 12 mM HEPES (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U Rnasinu (40 U/µL, Promega, Madison, WI) a 1 U E.coli Rnázy h. Pro kontrola, reakce s odpovídajícím množstvím deproteinizované-UTP značené rna a stejnými iontovými podmínkami jako extrakt byl připraven a inkubován při 25 °C po dobu 15 minut. Reakce byla ukončena přidáním 75 µL destilovaného H2O, 100 µL 2 × PK pufru a 4 µL proteinázy K (10 mg / mL) a RNA byla připravena, jak je popsáno v „qPCR“ pro analýzu fragmentů RNA. RNA byla resuspendována v 25 µL močovinového gelového pufru (5 mM EDTA, 10% (v/v) glycerolu, 0,05% (w/v) Xylenkyanolu FF, 0,05% (w/v) Bromofenolové modři a 50% deionizovaného formamidu) a oddělena na denaturačních gelech močoviny, následovaná autoradiografií.

qPCR

celková RNA byla extrahována z buněk a tkání za použití Trizolového činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA) následovaného trávením DNase I podle pokynů výrobce. RNA byla kvantifikována měřením absorbance při 260 nm a reverzní transkripcí. Kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) byla provedena pomocí systému Bio-Rad IQ5 real-time PCR podle pokynů výrobce. Primery používané pro reverzní transkripci a qPCR byly uvedeny v doplňujících údajích 7. Data byla normalizována pomocí endogenní mRNA GAPDH a U6 snRNA. K analýze dat PCR byla použita metoda 2-ΔΔCT.

průtoková cytometrie

buňky byly odebrány v uvedených časových bodech a dvakrát promyty PBS / 0,5% BSA při 4 °C, aby se blokovaly Fc receptory. Transdukované CD34+ HPC byly obarveny anti-CD14 konjugovanými APC (klon: 61D3) nebo anti-CD11b (klon: ICRF44) protilátkami (eBioscience, San Diego, CA). Myší BM buňky byly obarveny PE konjugovanou anti-CD33 protilátkou (klon: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Průtoková cytometrie byla provedena na průtokovém cytometru C6 (Bd Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo (verze 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

myši a transplantační testy

všechny pokusy na zvířatech byly provedeny se souhlasem výzkumné Etické komise pekingské Unie Medical College. Deset milionů CD34 + HPC infikovaných kontrolou lenti-SH-KSRP, lenti-129 nebo Lenti-GFP bylo promyto a resuspendováno v PBS a poté injikováno do laterální ocasní žíly 4týdenních až 6týdenních samic nod/SCID přijímajících myší ozářených rentgenovými paprsky v dávce 250 cGy. Čtyři týdny po transplantaci CD34 + HPC byly myši obětovány a BM a spleens byly shromážděny a zpracovány do jednobuněčných suspenzí pro následné experimenty. Výsledky byly získány ze 4 myší na skupinu.

Western blot

celobuněčné lyzáty byly podrobeny analýze Western blot. Králičí polyklonální anti-KSRP protilátka (6994-1; 1:1000) a anti-RUNX1 protilátka (ab35962; 1:1000), která pochází z Epitomiky (Abcam, Cambridge, MA) nebo protilátky GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100 000) byly použity jako primární protilátky a inkubovány v 1× TBST obsahující 5% BSA po dobu 2 h při pokojové teplotě (RT) s kontinuálním třepáním. Po promytí 1× TBST po dobu 15 minut při RT byly membrány inkubovány s HRP konjugovanou kozí anti-králičí sekundární Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) po dobu 1 hodiny při RT. po posledním promývacím kroku s 1× TBST po dobu 15 minut při RT byly imunoreaktivní pásy vizualizovány zvýšenou chemiluminiscencí (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) v indikované době expozice („expoziční čas pro Western blot“). Všechny uncropped západní bloty lze nalézt v doplňkovém Obr. 11.

in vivo processing assay in zebrafish

embrya byla odebrána z laboratorní chovné kolonie zebrafish Tuebingen umístěných při 28 °C v cyklu světlo/tma 14:10 h a chovaných za standardních podmínek (China Zebrafish Resource Center). MRNA KSRP a GFP-Pri-129 WT nebo mutantní mRNA vázající místo KSRP byly syntetizovány in vitro z odpovídajících linearizovaných plazmidů pomocí sady mMESSAGE mMACHINE (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). MRNA KSRP a GFP-Pri-129_WT mRNA (nebo GFP-Pri-129_Mut mRNA) byly současně injikovány do jednobuněčných embryí zebrafish. Embrya byla inscenována při teplotě 28 °C podle h. p. f.a morfologických kritérií 52. Snímky embryí představených ve 4 h. p. f. a 24 h. p. f. byly získány pomocí Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Německo).

in vivo processing assay in 293TN cells

293tn cells were cultured in 6-jamkové destičky for 24 h until they reached 70 70-80% confluence . Buňky byly souběžně transfektovány s fúzí EGFP Pri-129_WT nebo mutantními plasmidy Pri-129, pcDNA4-RFP a plazmidem pCMV-KSRP za použití Lipofektaminu 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O dvacet čtyři hodin později byly buňky analyzovány pod fluorescenčním mikroskopem Zeiss při zvětšení 400× (Carl Zeiss Microscopy GmbH). RNA byla také extrahována pro qPCR analýzu účinnosti zpracování detekcí primárního miR-129 vs. zralý miR-129. Intenzita fluorescence byla kvantifikována pomocí softwaru Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ proximity ligation assay

in situ PLAs byly provedeny podle výrobního protokolu (Sigma-Aldrich). Králík anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1: 50) a králík anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) byl spárován s anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Kanada; 1:50) nebo normální králičí IgG polyklonální protilátka (12-370, Merck Millipore, Německo; 1:50) pro primární protilátky. Anti-KSRP a normální králičí IgG polyklonální protilátka jako negativní kontrola. Před blokováním byly buňky 293T nebo HeLa pěstovány na komorových sklíčidlech (Sigma), fixovaných v 10% formaldehydu, permeabilizovaných 0,25% Tritonem X-100-PBS. Buňky byly analyzovány konfokální imunofluorescenční mikroskopií Zeiss LSM780 (Zeiss, Německo) následovanou dekonvolucí s Huygens Essential verze 16.05 (Scientific Volume Imaging, Nizozemsko, http://svi.nl). Pla tečky na buňku byly kvantifikovány pomocí softwaru pro analýzu obrazu BlobFinder V3.2 (Uppsala University, Stockholm, Švédsko) a průměrný počet Pla bodů na buňku byl vypočítán analýzou minimálně 100 buněk.

Bioinformatická analýza

Všechna párová čtení byla oříznuta pro sekvenci adaptérů pomocí Trim Galore (verze 0.3.7) s parametry „-q 25 –stringency 5 –length 50 –paired –phred33“ a filtrována pro sekvenci nízké kvality. Referenční genom hg38 (GRCh38) a soubor anotace genů (formát GTF) byl stažen z vydání GENCODE 24 (http://www.gencodegenes.org/)53. TopHat54, 55 (Verze 2.1.0) byl použit k zarovnání filtrovaných čtení s referenčním genomem hg38 s výchozím nastavením a FPKMs (fragmenty na Kilobázový transkriptom na milion čtení) byly získány pomocí Cufflinks54 (Verze 2.2.1) s výchozími parametry. Úrovně exprese byly odhadnuty pomocí funkcí Counts56 (Verze 1.5.0) s parametry „-T 7 –primary“, počty raw na úrovni genu byly odvozeny ze součtu odpovídajících hodnot pro všechny izoformy genu.

EBSeq-HMM18 byly použity k analýze rozdílů v genové expresi mezi třemi stupni diferenciace monocytů a granulocytů. Existují dva hlavní kroky pro EBSeq-HMM, aby se odlišně exprimované (DE) geny:

1. 1)

   detekce de genů, které vykazovaly významnou změnu mezi libovolnými dvěma stupni pod cílovou rychlostí falešného objevu (FDR) 0,05.

2. 2)

   shlukování de genů do expresních cest s maximální zadní pravděpodobností (PP) větší než 0,5.

„nahoru-dolů“) v den 5, 10 a 15 diferenciace monocytů (nebo granulocytů) (doplňkové údaje 1). Cesta exprese „nahoru-dolů“ představuje, že gen byl up-regulován v den 10 ve srovnání s dnem 5, zatímco downregulován v den 15 ve srovnání s dnem 10. Monotónně zvýšené („nahoru-nahoru“) nebo snížené („dolů-dolů“) geny, během diferenciace monocytů (nebo granulocytů) byly vybrány pro další analýzu.

hladiny genové exprese byly odhadnuty pomocí FPKM a všechny geny s FPKM ≥ 1 jako exprimované geny byly použity pro další analýzu. Informace o RBP byly staženy z databází RBPDB19 a ATtRACT20. Vyvinuli jsme R skript (doplňková Data 8) pro klasifikaci de genů s expresními cestami „nahoru-nahoru „nebo“ dolů-dolů “ (doplňková Data 2, 3) do různých expresních vzorců.

tepelné mapy byly nakresleny pomocí funkce ‚pheatmap‘ R balíčků ‚pheatmap‘ a VennDiagram byly nakresleny pomocí funkce ‚ draw.párově.venn ‚z R balíčku ‚VennDiagram‘. Shlukování k-prostředků bylo provedeno s výstupem funkce „pheatmap“ a shluky byly získány s funkcí „cutree“ pomocí R.

Plazmidové elektrotransfekce

Použili jsme neonový Transfekční systém podle pokynů výrobce (Invitrogen, Carlsbad, CA) ke zlepšení účinnosti transfekce plazmidů v buňkách THP-1 pro analýzu RNA-seq. Buňky byly elektrotransfektovány plazmidy (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP nebo pSIH-H1-SH-KSRP). Parametry elektroporace pro buňky 1 × 107 THP-1 nebo NB4 byly puls 1350-V, Šířka pulsu 10-ms a 4 impulsy pomocí špičky 10-µL. O čtyřicet osm hodin později byla účinnost elektrotransfekce detekována Western blotting nebo qPCR.

záchranné testy

aby se ověřilo, že KSRP podporuje zpracování pri-miR-129 pro regulaci diferenciace myeloidní linie, byly buňky THP-1 transfektovány pEGFP-KSRP pomocí Lipofektaminu 2000 a o 24 hodin později byly buňky transfektovány inhibitorem miR-129. Buňky NB4 byly transfektovány si-KSRP v konečné koncentraci 100 nM pomocí DharmFECT1 a o 24 hodin později byly buňky transfektovány mimikou miR-129. K ověření, že cílový RUNX1 miR-129 pro regulaci diferenciace myeloidních linií byly buňky THP-1 a NB4 transfektovány si-RUNX1 a inhibitorem miR-129 nebo jejich kontrolami neonovým transfekčním systémem. Buňky byly poté stimulovány PMA nebo ATRA po dobu dalších 48 hodin, než byly sklizeny pro následné analýzy. Exprese CD14 v buňkách THP-1 podstupujících monocytární diferenciaci a exprese CD11b v buňkách NB4 podstupujících granulocytární diferenciaci byly analyzovány průtokovou cytometrií.

doba expozice pro Western blot

většina Western blot byla vyvinuta Tanon 5200 automatic digital gel image analysis system (Tanon, Šanghaj, Čína) a doba expozice GAPDH je 150-350 ms. na obr. 2a, doba expozice vzorků podél monocytární diferenciace je 20 s pro KSRP; doba expozice vzorků podél granulocytární diferenciace je 200 ms pro KSRP. Na Obr. 2b, doba expozice je 20 s pro KSRP. Na Obr. 4f-h, Doba expozice je 60 s pro KSRP. Na Obr. 5b, doba expozice je 60 s pro Drosha, DGCR8 a KSRP. Na Obr. 6j, k, doba expozice je 90 s pro RUNX1. Na Obr. 7g, doba expozice je 90 s pro RUNX1 a KSRP. Na Obr. 7h, doba expozice je 30 s pro RUNX1 a KSRP. V Doplňkovém Obr. 2a, doba expozice vzorků podél monocytární diferenciace je 3 s pro KSRP; doba expozice vzorků podél granulocytární diferenciace je 300 ms pro KSRP. V Doplňkovém Obr. 4a, e, f, doba expozice je 60 s pro KSRP. V Doplňkovém Obr. 7m, expoziční doba je 10 s a 90 s pro RUNX1 v THP-1 a NB4, respektive. V Doplňkovém Obr. 8a, doba expozice je 60 s pro RUNX1.

u ostatních snímků zobrazujících výsledek ruční expozice (obr. 2d, i; doplňkový obr. 7n), doba expozice pro GAPDH je odhadovaná na 1 s. Na obr. 2d, doba expozice je 30 s pro KSRP ve vzorcích indukovaných PMA a 10 s pro KSRP ve vzorcích indukovaných ATRA. Na Obr. 2i, doba expozice je 60 s pro KSRP. V Doplňkovém Obr. 7n, doba expozice je 90 s pro RUNX1.

izolace monocytů a neutrofilů z periferní krve

informovaný souhlas byl získán v souladu s institucionální revizní komisí Čínské akademie lékařských věd. Lidské monocyty a neutrofily byly izolovány z periferní krve zdravých dárců v 3% dextranu a byly izolovány centrifugací s percollovým gradientem a následným čištěním mikrokuličkami CD14 (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Německo) nebo EasySep Human neutrofil Enrichment Kit (#19257, StemCell Technologies, Kanada). Po tříděných mikrokuličkami CD14 byly získané pozitivní buňky CD14 pokoveny do baněk T-25 a kultivovány po dobu 4-6 hodin při 37 °C, dokud nebyly adherentní monocyty odebrány škrábáním.

Statistická analýza

pro všechny studie je n na skupinu, jak je uvedeno v legendě obrázku. Všechna data byla analyzována pomocí softwaru GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., USA) a prezentovány jako prostředek ± SD. Rozdíly mezi experimentálními skupinami a kontrolními skupinami byly analyzovány pomocí t-testu dvouocasého studenta. Statistická významnost byla přijata při P < 0,05. K předurčení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Všechny experimenty byly provedeny s nejméně třemi biologickými replikáty. Vybrali jsme vhodné testy podle rozdělení dat. Pokusy nebyly randomizovány a nevyloučili jsme žádné vzorky. Vyšetřovatelé nebyli zaslepeni alokací během experimentů a hodnocení výsledků.

dostupnost dat

údaje o sekvenování miRNA a pri-miR-RNA byly uloženy v GEO databázi pod přístupovým kódem GSE87318. Údaje pro sekvenování mRNA byly rovněž uloženy v GEO databázi pod přístupovým kódem GSE87088. Zdrojová data pro obr. 1c-e byly poskytnuty jako doplňkové údaje 1-4. Zdrojová data pro obr. 2b, c byly poskytnuty jako doplňkové údaje 5, 6. Všechny ostatní údaje podporující zjištění této studie jsou k dispozici od příslušného autora na vyžádání.