KSRP spezifiziert monozytäre und granulozytäre Differenzierung durch Regulierung der miR-129-Biogenese und der RUNX1-Expression

Monozytäre und granulozytäre Differenzierung von Zelllinien

Die humane monozytäre Zelllinie THP-1 und die promyelozytäre Zelllinie NB4 und 60 wurden von ATCC (Manassas, USA) gekauft und in RPMI1640 gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum (Gibco, Carlsbad, CA) ergänzt wurde. Die Zellen wurden durch PCR auf Authentifizierung und durch Immunfluoreszenztests auf Freiheit von Mycoplasma-Kontamination gescreent. Die monozytäre Differenzierung von THP-1- und HL-60-Zellen wurde durch Behandlung der Zellen mit 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) für 0, 24, 48 und 72 h induziert. Die granulozytäre Differenzierung von NB4- und HL-60-Zellen wurde durch Behandlung der Zellen mit 1 µM ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) induziert. In der Datenbank der häufig falsch identifizierten Zelllinien, die von ICLAC und NCBI Biosample verwaltet wird, wurden keine in dieser Studie verwendeten Zelllinien gefunden. Zelllinien wurden auf Mycoplasma-Kontamination getestet, aber nicht erneut authentifiziert.

Menschliches Nabelschnurblut (UCB) wurde aus normalen Vollzeitlieferungen im Peking Union Hospital gewonnen, und Knochenmark (BM) von normalen Spendern wurde aus dem 307. Die Einverständniserklärung und Genehmigung der Forschungsethikkommission wurde eingeholt. Mononukleäre Zell (MNC)-Fraktionen wurden aus UCB und BM unter Verwendung eines Percoll-Dichtegradienten (d = 1,077; Amersham Biotech, Deutschland) isoliert. CD34+ Zellen wurden aus MNCs mittels positiver immunomagnetischer Selektion angereichert (CD34+ MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland).

Monozytäre Differenzierung von HPCs

Die angereicherten CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) wurden in IMDM mit hoher Glucose kultiviert, ergänzt mit 30% fetalem Rinderserum (Hyklon, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng / ml rekombinantem humanem IL-3, 100 ng / ml rekombinantem humanem SCF, 50 ng / ml rekombinantem humanem M-CSF, 100 ng / ml rekombinantes humanes FLT3, 1 ng / ml rekombinantes humanes IL-6, 60 mg / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin zur Induktion der Monozytendifferenzierung. Zytokine wurden von Peprotech (Rocky Hill, NJ) gekauft. Die Zellen wurden alle 3-5 Tage geerntet. Für morphologische Analysen wurden Zellen auf Objektträger geschmiert, 10 min in Methanol fixiert, mit May-Grünwald/Giemsa angefärbt und bei 400facher Vergrößerung unter einem Mikroskop (Nikon TE2000, Japan) mit Digitalkamera analysiert.

Granulozytäre Differenzierung von HPCs

Die angereicherten CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) wurden in IMDM mit hoher Glucose kultiviert, ergänzt mit 30% fetalem Rinderserum (Hyklon, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng / ml rekombinantem humanem IL-3, 100 ng / ml rekombinantem humanem SCF, 20 ng / ml rekombinantem humanem G-CSF , 10 ng/ml recombinant menschliches IL-6, 60 mg/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin, zum von Granulozytendifferenzierung zu verursachen. Zytokine wurden von Peprotech (Rocky Hill, NJ) gekauft. Die Zellen wurden alle 3-5 Tage geerntet. Morphologische Analysen wurden auf die gleiche Weise wie die monozytäre Differenzierung durchgeführt.

Oligonukleotide und Konstrukte

miR-129-Mimics (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), miRNA-Inhibitoren (anti-129) und negative Kontrollmoleküle (NC) wurden von Dharmacon (Austin, TX) erhalten und Zellen mit einer Endkonzentration dieser Konstrukte von 100 nM unter Verwendung von DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX) transfiziert. siRNAs (speziell für KSRP und RUNX1) und Kontroll-siRNAs (Si-Con) wurden von Dharmacon synthetisiert und Zellen mit 100 nM siRNAs unter Verwendung von DharmFECT1 transfiziert.

Für die KSRP-Überexpression wurde der humane KSRP (NM_003685.2) cDNA-ORF-Klon (pEGFP-KSRP) von Addgene (Addgene, MA) gekauft. Für den KSRP-Knockdown wurde KSRP-sh-RNA in den PSIH-H1-Vektor stromabwärts des H1-Promotors kloniert (lenti-sh_KSRP) oder direkt in Form von lentiviralen Konstrukten gekauft (TL311984, Origene, Rockville, MD). Für die pri-129-1-Überexpression wurde ein 700-bp-Wildtyp-Konstrukt in den pCMV6-Vektor (129_WT) oder in das pMIRNA1-Plasmid (lenti-129) kloniert. Die Mutanten-KSRP-Bindungsstellen in pri-129-1 (129_MUT1, 129_MUT2, 129_MUT3, 129_MUT4 und 129_MUTF) wurden ebenfalls in pCMV6-Vektoren erzeugt. Für miR-129 knockdown wurden miRZIP-129 und miRZIP-control von System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) erworben. Für die RUNX1-Überexpression wurde RUNX1 ORF in den pMIRNA1-Vektor (Lenti-RUNX1) geklont.

Für den Reportergen-Assay von miR-129-Targets wurde die reverse komplementäre Sequenz zu miR-129 in den pMIR-Reporter stromabwärts des Firefly-Luciferase-Gens eingefügt, um das positive Reporterkonstrukt (129_positiv) zu erzeugen. Die 3′-UTR der humanen RUNX1-mRNA wurde amplifiziert und in denselben pMIR-Reporter stromabwärts des Glühwürmchen-Luciferase-Gens kloniert, um den Wildtyp-Reporter (RUNX1_WT) zu bilden. Mutationen der miR-129-Bindungsstellen in der 3′-UTR von humanen RUNX1-mRNA-Sequenzen wurden mit dem QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 und RUNX1_Mut3) erzeugt. Die Zellen wurden mit diesen Konstrukten entweder unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) für 293TN-Zellen oder Lipofectamine LTX & PLUS für THP-1-Zellen und NB4-Zellen gemäß den Protokollen des Herstellers transfiziert. Alle Primer sind in den ergänzenden Daten 7 aufgeführt.

Lentivirus-Produktion

Das entsprechende Lentivirus-Verpackungskit wurde von System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) erworben und gemäß den Richtlinien des Herstellers verwendet. Die geernteten Viruspartikel (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 und lenti-GFP) wurden zu CD34+ HPCs-, THP-1- oder NB4-Zellen gegeben, und die Zellen wurden dann nach 24 Stunden mit IMDM gewaschen und für nachfolgende Experimente plattiert.

miRNA Deep sequencing

THP-1-Zellen wurden mit pEGFP-KSRP oder pEGFP unter Verwendung des Neon-Transfektionssystems elektroporiert und dann nach FACS sortiert, um die GFP-positiven Zellen zu sammeln. Kleine RNAs wurden aus der Gesamt-RNA mit dem mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Kleine RNA-Bibliotheken und miRNA-Sequenzierung wurden von Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, China) unter Verwendung eines Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA). Die Sequenzierungsdaten wurden gefiltert, die Expressionsprofile wurden konstruiert und die Adapter-Dimer-Lesevorgänge wurden von den miRNA-Lesevorgängen getrennt, die bereits in miRbase 17.0 identifiziert worden waren. RNA-seq-Daten wurden von Genergy Bio analysiert und eine Liste von miRNAs, deren Expression bei KSRP-Überexpression erhöht war, ist in den ergänzenden Daten 5, 6 gezeigt.

Poly(A)-angereicherte RNA-Tiefensequenzierung

Zur Herstellung der poly(A)-angereicherten RNA-seq-Bibliothek wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung des Trizol-Reagenzes (Invitrogen, Carlsbad, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Poly (A) -angereicherte RNA-Bibliotheken und Deep RNA-seq wurden an Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) angepasst und von Genergy Bio durchgeführt. Eine vollständige Liste der primären miRNAs, deren Expression bei KSRP-Überexpression abnahm, ist in Supplementary Data 5, 6 aufgeführt.

Rassenanalyse

Um die vollständige Länge der primären-129-1-, 5′- und 3′-RASSE zu identifizieren, wurden Reaktionen an Gesamt-RNA von THP-1-Zellen unter Verwendung des 5′-Full RACE Kit und des 3′-Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, China) gemäß dem Herstellerhandbuch durchgeführt. Die für das RACE-Experiment verwendeten Primer sind in den ergänzenden Daten 7 aufgeführt.

Luciferase Reporter Assay

Für funktionelle mechanistische Analysen von miR-129-1 haben wir mehrere miR-129-1-Targets mit der Bioinformatik-Software Targetscan und Miranda vorhergesagt und die Kandidaten mit dem Luciferase Reporter Assay validiert. 293TN-Zellen wurden mit 0,4 µg des Reporterkonstrukts, 0,015 µg des pRL-TK-Kontrollvektors und 5 pmol des miR-129-Mimik- oder Negativkontroll-Mimik-kotransfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen geerntet und mit dem Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) nach Herstellerangaben untersucht. Alle Transfektionstests wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

In vitro Processing Assay

Der Processing Assay wurde unter Verwendung einer 10 mg/ml HeLa-Zellprobe durchgeführt. Zur Abreicherung von KSRP wurden zehn Mikroliter KSRP-Antikörper zu 1 mg HeLa-Zellkultur gegeben und ein IgG-Antikörper als Kontrolle zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 4°C wurde der KSRP-Protein-Antikörper-Komplex mit Protein-A-Beads immunpräzipitiert (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Der Überstand ist der KSRP-abgereicherte Kernextrakt (ΔKSRP-NE). Die 700-nt, isotopenmarkierten Wildtyp-Pri-129-1 (129_WT) und pri-129-1, die alle vier KSRP-Bindungsstellenmutanten (129_Mut) enthielten, wurden durch Standard-In-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von -UTP unter Verwendung der Konstrukte 129_WT und 129_Mut hergestellt. 129_WT und 129_Mut wurden mit HeLa cell NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) für 30 min bei 37°C in Gegenwart von KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), und 4 pmol (4×)). Die Reaktionsgemische wurden einer Phenol:Chloroform-Extraktion, Fällung und denaturierender Gelelektrophorese und anschließender Autoradiographie unterzogen.

Der Rescue Processing Assay wurde durchgeführt. Kurzzeitig wurden 20 µL ΔKSRP-NE mit 1 pmol -UTP-markiertem primärem miR-129 und unterschiedlichen Mengen KSRP (0,5 µg) für unterschiedliche Zeiten (15, 40 und 60 min) bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionsgemische wurden 30 min bei 37°C mit Proteinase K behandelt und dann Phenol ausgesetzt:Chloroformextraktion, Fällung und denaturierende Gelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie. Alle uncropped RNA-Gele sind in Ergänzender Abb. 12.

Northern Blot

Insgesamt 40 µg RNA-Proben wurden beladen und auf denaturierende (Harnstoff) 12% Polyacrylamidgele laufen gelassen und anschließend auf Hybond-Membranen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) transferiert. Die Hybridisierung wurde mit Digoxigenin (DIG)-markierter pri-miR-129, γ-32P-markierter prä- oder reifer miR-129-5p-Sonde über Nacht bei 42 °C durchgeführt. U6 snRNA und rRNA dienten als Beladungskontrollen für prä-, reife bzw. primäre miRNA. Das Expressionsniveau wurde durch Normalisierung auf die Expression von U6 snRNA oder rRNA gemessen. Die Oligonukleotid-Sondensequenzen sind in den ergänzenden Daten 7 aufgeführt. Die Expression von miRNA wurde mit Image J Software quantifiziert. Alle ungeschnittenen Northern Blot finden Sie in der ergänzenden Abb. 12.

RNA-Immunpräzipitationsassay

Gleiche Mengen an THP-1- oder NB4-Zellen wurden in eiskaltem PBS geerntet. Anschließend wurden die Zellpellets in 1 ml Lysepuffer B (50 mM Tris, pH 7) resuspendiert.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM Aprotinin, 1 mM Leupeptin und 2 mM Vanadylribonukleosidkomplexe (VRC)) und schonende Beschallung. Nach 15 min Zentrifugation der Lysate bei 12.000 upm wurden die Überstände mit Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) in Lysepuffer B mit 10 µg Hefe-tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) vorgereinigt. Anschließend wurden die vorgereinigten Lysate entweder mit einem Anti-KSRP-Antikörper (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) oder einem Kaninchen-Isotyp IgG (12-370, Merck Millipore, Deutschland; 1:500) als Kontrolle für 4 h bei 4°C zur RIP verwendet. Die Perlen wurden dreimal mit Lysepuffer B gewaschen, wobei die letzte Wäsche zusätzlich 0,5% Natriumdeoxycholat enthielt, gefolgt von einer Extraktion mit Puffer C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-Mercaptoethanol und 20% Glycerin) bei Raumtemperatur für 10 min. Die immunpräzipitierte RNA wurde mit Trizol und Phenol-Chloroform extrahiert. Für die RT-PCR wurde jede RNA-Probe mit DNase I (Ambion, DNA-free TM kit) behandelt. Dann wurden gleiche Mengen mit dem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) reverse transkribiert. Die Faltenanreicherung der RNAs durch KSRP wurde mittels qPCR und Agarosegelelektrophorese gemessen. Die für die RIP-PCR-Experimente verwendeten Primer sind in den ergänzenden Daten 7 aufgeführt.

Immunpräzipitation der Protein-RNA-Komplexe

Maltose-bindendes Protein (MBP)-Affinitätsreinigung wurde verwendet, um Proteine zu identifizieren, die mit primären miRNAs assoziiert sind. Das MS2-MBP-Expressionsplasmid war ein Geschenk von Dr. Lingling Chen (Chinesische Akademie der Wissenschaften) und MS2-MBP wurde exprimiert und aus E. coli unter Verwendung eines Protokolls des Steize Lab (Yale University) gereinigt. Drei MS2-Hüllproteinbindungsstellen (5′-cgtacaccatcagggtacgagctagcccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacaccatcagggtacg-3′) wurden stromabwärts der pri-129-1-Gensequenz oder der pri-129-1-KSRP-Bindungsstellenmutantensequenzen eingefügt. 293TN-Zellen wurden mit MS2-haltigen Konstrukten transfiziert, um Proteine zu erhalten, die mit primären miRNAs assoziiert sind, und 10 Millionen Zellen wurden für jeden Immunpräzipitationstest verwendet. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion geerntet und einer RNA-Pull-Down-Analyse unterzogen. Kurz gesagt, die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gespült, bevor sie in 10 ml eiskaltem PBS durch Schaben geerntet wurden. Anschließend wurden die Zellpellets in 1 ml IP-Puffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, Proteinase-Inhibitor-Cocktail) resuspendiert, 2 Runden schonend beschallt und zentrifugiert, um Zellextrakte zu erhalten. Der Überstand wurde zunächst 1 h mit MS2-MBP und dann weitere 1 h mit Amyloseharz-Beads (NEB) bei 4 C inkubiert. Die Beads wurden fünfmal mit IP-Puffer mit Gentle Rock und einer letzten Wäsche mit IP-Puffer mit zusätzlichem 150 mM NaCl gewaschen. Die Proteinkomponenten wurden schließlich mit IP-Puffer, ergänzt mit 12 mM Maltose, aus Beads eluiert und mittels WB mit folgenden Primärantikörpern überprüft: rabbit anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), rabbit anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), rabbit anti-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000,) und mouse anti-GAPDH (60004-1-Ig , Proteintech; 1:1.000.000).

RNase-H-Schutz-Assay

Eine Standard-RNase-H-Schutzreaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µL durchgeführt, das 1 pmol KSRP-Protein, 1 pmol -UTP-markierte RNA, 20 µg/ml DNA-Oligonukleotide, 12 mM HEPES (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 U RNasin (40 U/µL, Promega, Madison , WI) und 1 U E. coli RNase H. Zur Kontrolle wurde eine Reaktion mit der entsprechenden Menge deproteinisierter -UTP-markierter RNA und den gleichen Ionenbedingungen wie der Extrakt hergestellt und 15 min bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 75 µL destilliertem H2O, 100 µL 2×PK-Puffer und 4 µL Proteinase K (10 mg/ml) abgebrochen und RNA wurde wie in der ‚qPCR‘ beschrieben zur Analyse der RNA-Fragmente hergestellt. RNA wurde in 25 µL Harnstoff-Gelbeladungspuffer (5 mM EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 0,05% (w/v) Xylolcyanol FF, 0,05% (w/v) Bromphenolblau und 50% deionisiertes Formamid) resuspendiert und auf harnstoffdenaturierenden Gelen abgetrennt, gefolgt von Autoradiographie.

qPCR

Gesamt-RNA wurde aus den Zellen und Geweben unter Verwendung des Trizol-Reagenzes (Invitrogen, Carlsbad, CA) extrahiert, gefolgt von einem DNase-I-Aufschluss gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die RNA wurde durch Messung der Extinktion bei 260 nm quantifiziert und reverse transkribiert. Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) wurde unter Verwendung des Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR-Systems gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Primer, die für die reverse Transkription und qPCR verwendet wurden, wurden in Supplementary Data 7 gezeigt. Die Daten wurden mit endogener GAPDH-mRNA und U6-snRNA normalisiert. Zur Analyse der PCR−Daten wurde die 2-ΔΔCT-Methode verwendet.

Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und zweimal mit PBS/0,5% BSA bei 4°C gewaschen, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Die transduzierten CD34+ HPCs wurden mit APC-konjugierten Anti-CD14 (Klon: 61D3) oder Anti-CD11b (Klon: ICRF44) Antikörpern angefärbt (eBioscience, San Diego, CA). Maus-BM-Zellen wurden mit einem PE-konjugierten Anti-CD33-Antikörper (Klon: HIM3-4 eBioscience, CA, USA) angefärbt. Die Durchflusszytometrie wurde an einem C6-Durchflusszytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) durchgeführt. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software (Version 7.6, TreeStar, Ashland, OR) analysiert.

Mäuse- und Transplantationstests

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der Forschungsethikkommission des Peking Union Medical College durchgeführt. Zehn Millionen CD34 + HPCs, die mit lenti-sh-KSRP, lenti-129 oder lenti-GFP Control infiziert waren, wurden gewaschen und in PBS resuspendiert und dann in die laterale Schwanzvene von 4 bis 6 Wochen alten weiblichen NOD / SCID-Empfängermäusen injiziert, die mit Röntgenstrahlen in einer Dosis von 250 cGy bestrahlt wurden. Vier Wochen nach der Transplantation der CD34 + HPCs wurden die Mäuse geopfert und die BM und Milzen gesammelt und zu Einzelzellsuspensionen für die nachfolgenden Experimente verarbeitet. Die Ergebnisse wurden von 4 Mäusen pro Gruppe erhalten.

Western Blot

Ganzzelllysate wurden einer Western Blot Analyse unterzogen. Kaninchen-polyklonaler Anti-KSRP-Antikörper (6994-1; 1:1000) und Anti-RUNX1-Antikörper (ab35962; 1:1000) der von Epitomics (Abcam, Cambridge, MA) oder ein GAPDH-Antikörper (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100.000) wurden als Primärantikörper verwendet und in 1× TBST enthaltend 5% BSA für 2 h bei Raumtemperatur (RT) unter ständigem Schütteln inkubiert. Nach Wäschen mit 1× TBST für 15 min bei RT wurden die Membranen mit einem HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundär-Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) für 1 h bei RT inkubiert. Nach einem abschließenden Waschschritt mit 1× TBST für 15 min bei RT wurden die immunreaktiven Banden durch Enhanced Chemiluminescence (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) zur angegebenen Expositionszeit („Exposure time for Western Blot“) sichtbar gemacht. Alle ungeschnittenen Western Blots finden Sie in der ergänzenden Abb. 11.

In vivo Processing assay in zebrafish

Embryonen wurden aus einer Laborzuchtkolonie von Tübinger Zebrafischen entnommen, die bei 28 ° C in einem 14:10 h Hell / Dunkel-Zyklus untergebracht und unter Standardbedingungen aufgezogen wurden (China Zebrafish Resource Center). KSRP-mRNA und GFP-Pri-129 WT oder KSRP-bindungsstellenmutante mRNAs wurden in vitro aus entsprechenden linearisierten Plasmiden unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE Kits (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) synthetisiert. Die KSRP-mRNA und die GFP-Pri-129_WT-mRNA (oder GFP-Pri-129_Mut-mRNA) wurden gemeinsam in Zebrafischembryonen im Einzellstadium injiziert. Die Embryonen wurden bei 28 °C gemäß den h.p.f. und morphologischen Kriterien inszeniert52. Mit einem Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) wurden Aufnahmen von Embryonen bei 4 h.p.f. und 24 h.p.f. gemacht.

In vivo Processing Assay in 293TN-Zellen

293TN-Zellen wurden in 6-Well-Platten für 24 h kultiviert, bis sie ≈70-80% Konfluenz erreichten. Die Zellen wurden mit den EGFP Fusion Pri-129_WT oder Mutanten Pri-129 Plasmiden, pcDNA4-RFP und dem pCMV-KSRP Plasmid unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ko-transfiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen unter einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop bei 400× Vergrößerung (Carl Zeiss Microscopy GmbH) analysiert. RNA wurde auch für eine qPCR-Analyse der Verarbeitungseffizienz extrahiert, indem das primäre miR-129 im Vergleich zum reifen miR-129 nachgewiesen wurde. Die Fluoreszenzintensität wurde mit der Software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD) quantifiziert.

In situ proximity Ligation assay

In situ PLAs wurden nach dem Herstellungsprotokoll (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Kaninchen-Anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1: 50) und Kaninchen-Anti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) wurde mit Anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Kanada; 1:50) oder normalen Kaninchen-IgG-polyklonalen Antikörpern (12-370, Merck Millipore, Deutschland; 1:50) für die primären Antikörper gepaart. Anti-KSRP und normaler polyklonaler Kaninchen-IgG-Antikörper als Negativkontrolle. Vor dem Blockieren wurden 293T- oder HeLa-Zellen auf Kammerobjekten (Sigma) gezüchtet, in 10% Formaldehyd fixiert und mit 0,25% Triton X-100-PBS permeabilisiert. Die Zellen wurden mit der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie Zeiss LSM780 (Zeiss, Deutschland) analysiert, gefolgt von einer Dekonvolution mit Huygens Essential Version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Niederlande, http://svi.nl). PLA-Punkte pro Zelle wurden mit der Bildanalysesoftware BlobFinder V3.2 (Universität Uppsala, Stockholm, Schweden) quantifiziert und die mittlere Anzahl von PLA-Punkten pro Zelle durch Analyse von mindestens 100 Zellen berechnet.

Bioinformatikanalyse

Alle Lesevorgänge am gepaarten Ende wurden mit Trim Galore (Version 0.3.7) mit den Parametern „-q 25 –stringency 5 –length 50 –paired –phred33“ für eine Sequenz getrimmt und für eine Sequenz mit geringer Qualität gefiltert. Das hg38-Referenzgenom (GRCh38) und die Genanmerkungsdatei (GTF-Format) wurden von GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53 heruntergeladen. TopHat54,55 (Version 2.1.0) wurde verwendet, um die gefilterten Lesevorgänge mit Standardeinstellungen am hg38-Genom-Referenzgenom auszurichten, und FPKMs (Fragmente pro Kilobase-Transkriptom pro Million Lesevorgänge) wurden unter Verwendung von Cufflinks54 (Version 2.2.1) mit Standardparametern erhalten. Expressionsniveaus wurden unter Verwendung von Merkmalszählungen56 (Version 1.5.0) mit Parametern „-T 7 –primary“ geschätzt, Gen-Level-Rohzählungen wurden aus der Summe der entsprechenden Werte für alle Isoformen eines Gens abgeleitet.

EBSeq-HMM18 wurden verwendet, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen drei Stadien der Monozyten- bzw. Granulozytendifferenzierung zu analysieren. Es gibt zwei Hauptschritte für EBSeq-HMM, um differentiell exprimierte (DE) Gene zu erhalten:

1. 1)

   Nachweis von DE-Genen, die eine signifikante Veränderung zwischen zwei Stufen unter einer Ziel-False-Discovery-Rate (FDR) von 0,05 zeigten.

2. 2)

   Clustern von DE-Genen in Expressionspfade mit der maximalen posterioren Wahrscheinlichkeit (PP) größer als 0,5.

Durch die Verwendung von EBSeq-HMM erhielten wir DE-Gene und ihre entsprechenden Expressionspfade (d. H. „Up-Down“) am Tag 5, 10 und 15 der Monozyten- (oder Granulozyten-) Differenzierung (Ergänzende Daten 1). Der Expressionspfad „Up-Down“ stellt dar, dass ein Gen an Tag 10 im Vergleich zu Tag 5 hochreguliert wurde, während es an Tag 15 im Vergleich zu Tag 10 herunterreguliert wurde. Monoton erhöhte („Up-Up“) oder verminderte („Down-Down“) Gene während der Monozyten- (oder Granulozyten-) Differenzierung wurden zur weiteren Analyse ausgewählt.

Die Genexpressionsniveaus wurden unter Verwendung des FPKM geschätzt, und alle Gene mit dem FPKM ≥ 1 als exprimierte Gene wurden für die weitere Analyse verwendet. Informationen zu RBP wurden aus den Datenbanken RBPDB19 und ATtRACT20 heruntergeladen. Wir entwickelten ein R-Skript (Ergänzungsdaten 8), um DE-Gene mit „Up-Up“ – oder „Down-Down“ -Expressionspfaden (Ergänzungsdaten 2, 3) in verschiedene Expressionsmuster zu klassifizieren.

Die Heatmaps wurden mit der Funktion ‚pheatmap‘ der R-Pakete ‚pheatmap‘ und das Venndiagramm mit der Funktion ‚draw‘ gezeichnet.paarweise.venn‘ von R Paket ‚VennDiagram‘. K-means Clustering wurde mit der Ausgabe der Funktion ‚pheatmap‘ durchgeführt und Cluster wurden mit der Funktion ‚cutree‘ unter Verwendung von R erhalten.

Plasmid electrotransfections

Wir verwendeten das Neon-Transfektionssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, Carlsbad, CA), um die Plasmid-Transfektionseffizienz in THP-1-Zellen für die RNA-seq-Analyse zu verbessern. Zellen wurden mit Plasmiden (pEGFP, pSIH-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP oder pSIH-H1-sh-KSRP) elektrotransfiziert. Die Elektroporationsparameter für 1 × 107 THP-1- oder NB4-Zellen waren ein 1350-V-Impuls, eine 10-ms-Impulsbreite und 4 Impulse unter Verwendung einer 10-µL-Spitze. Achtundvierzig Stunden später wurde die Elektrotransfektionseffizienz durch Western Blotting oder qPCR nachgewiesen.

Rescue Assays

Um zu validieren, dass KSRP die Pri-miR-129-Verarbeitung zur Regulierung der myeloischen Liniendifferenzierung fördert, wurden THP-1-Zellen mit pEGFP-KSRP unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert, und 24 h später wurden die Zellen mit einem miR-129-Inhibitor transfiziert. NB4-Zellen wurden mit si-KSRP bei einer Endkonzentration von 100 nM unter Verwendung von DharmFECT1 transfiziert, und 24 h später wurden die Zellen mit einem miR-129-Mimik transfiziert. Um zu validieren, dass miR-129 RUNX1 zur Regulierung der myeloischen Liniendifferenzierung anvisiert, wurden THP-1- und NB4-Zellen mit si-RUNX1 und einem miR-129-Inhibitor oder deren Kontrollen durch das Neon-Transfektionssystem transfiziert. Die Zellen wurden dann weitere 48 h mit PMA oder ATRA stimuliert, bevor sie für nachfolgende Analysen geerntet wurden. Die CD14-Expression in THP-1-Zellen, die sich einer monozytären Differenzierung unterziehen, und die CD11b-Expression in NB4-Zellen, die sich einer granulozytären Differenzierung unterziehen, wurden durchflusszytometrisch analysiert.

Belichtungszeit für Western Blot

Der größte Teil des Western Blot wurde von Tanon 5200 automatic Digital Gel image Analysis System (Tanon, Shanghai, China) entwickelt, und die Belichtungszeit von GAPDH beträgt 150-350 ms. In Abb. 2a beträgt die Expositionszeit von Proben entlang der monozytären Differenzierung 20 s für KSRP; Die Expositionszeit von Proben entlang der granulozytären Differenzierung beträgt 200 ms für KSRP. In Fig. 2b beträgt die Belichtungszeit für KSRP 20 s. In Fig. 4f-h, belichtungszeit ist 60 s für KSRP. In Fig. 5b, Belichtungszeit beträgt 60 s für Drosha, DGCR8 und KSRP. In Fig. 6j, k, Belichtungszeit beträgt 90 s für RUNX1. In Fig. 7g, Belichtungszeit beträgt 90 s für RUNX1 und KSRP. In Fig. 7h, Belichtungszeit beträgt 30 s für RUNX1 und KSRP. In ergänzender Fig. 2a beträgt die Expositionszeit von Proben entlang der monozytären Differenzierung 3 s für KSRP; Die Expositionszeit von Proben entlang der granulozytären Differenzierung beträgt 300 ms für KSRP. In ergänzender Fig. 4a, e, f, Belichtungszeit beträgt 60 s für KSRP. In ergänzender Fig. 7m, Belichtungszeit ist 10 s und 90 s für RUNX1 in THP-1 und NB4, respevtively. In ergänzender Fig. 8a beträgt die Belichtungszeit für RUNX1 60 s.

Für andere Bilder, die das Ergebnis der manuellen Belichtung zeigen (Abb. 2d, i; Ergänzend Fig. 7n) beträgt die Belichtungszeit für GAPDH schätzungsweise 1 s. In Fig. 2d beträgt die Belichtungszeit 30 s für KSRP in PMA-induzierten Proben und 10 s für KSRP in ATRA-induzierten Proben. In Fig. 2i beträgt die Belichtungszeit für KSRP 60 s. In ergänzender Fig. 7n, Belichtungszeit beträgt 90 s für RUNX1.

Isolierung von Monozyten und Neutrophilen aus peripherem Blut

Die Einverständniserklärung wurde gemäß dem Institutional Review Board der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften eingeholt. Humane Monozyten und Neutrophile wurden aus dem peripheren Blut gesunder Spender in 3% Dextran isoliert und durch perkolloidale Gradientenzentrifugation mit anschließender Reinigung durch CD14 MicroBeads (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) oder EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit (#19257, Stemcell Technologies, Kanada) isoliert. Nach Sortierung nach CD14-Mikrokügelchen wurden die erhaltenen CD14-positiven Zellen in T-25-Kolben plattiert und 4-6 h bei 37 ° C kultiviert, bis die adhärenten Monozyten durch Abkratzen gesammelt wurden.

Statistische Analyse

Für alle Studien ist n pro Gruppe wie in der Figurenlegende angegeben. Alle Daten wurden mit der GraphPad Prism 5.0-Software (GraphPad Software, Inc., USA) und als Mittel ± SD dargestellt. Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen und Kontrollgruppen wurden mit dem Two-tailed Student’s t-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde mit P < 0,05 akzeptiert. Es wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die Stichprobengröße vorherzusagen. Alle Experimente wurden mit mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt. Wir haben die geeigneten Tests entsprechend den Datenverteilungen ausgewählt. Die Experimente wurden nicht randomisiert und wir haben keine Proben ausgeschlossen. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuordnung.

Datenverfügbarkeit

miRNA- und Pri-miR-RNA-Sequenzierungsdaten wurden in der GEO-Datenbank unter dem Zugangscode GSE87318 hinterlegt. Die Daten für die mRNA-Sequenzierung wurden ebenfalls in der GEO-Datenbank unter dem Zugangscode GSE87088 hinterlegt. Quelldaten für Abb. 1c-e sind als ergänzende Daten 1-4 angegeben. Quelldaten für Abb. 2b, c sind als ergänzende Daten 5, 6 vorgesehen. Alle weiteren Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.