KSRP określa różnicowanie monocytowe i granulocytowe poprzez regulację biogenezy miR-129 i ekspresji RUNX1

różnicowanie Monocytowe i granulocytowe linii komórkowych

ludzka monocytowa linia komórkowa THP-1 oraz promyelocytowa linia komórkowa NB4 i HL-60 zostały zakupione od ATCC (Manassas, USA) i utrzymywany w rpmi1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (gibco, Carlsbad, CA). Komórki przesiewano metodą PCR w celu uwierzytelnienia i testami immunofluorescencyjnymi w celu uwolnienia od skażenia mykoplazmą. Monocytowe różnicowanie komórek THP-1 i HL-60 indukowano przez traktowanie komórek 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy) dla 0, 24, 48 i 72 h. Granulocytowe różnicowanie komórek NB4 i HL-60 indukowano przez traktowanie komórek 1 µM ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy). W bazie danych powszechnie błędnie zidentyfikowanych linii komórkowych, utrzymywanej przez ICLAC i BioSample NCBI, nie znaleziono żadnych linii komórkowych wykorzystywanych w tym badaniu. Linie komórkowe zostały przetestowane pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą, ale nie zostały ponownie uwierzytelnione.

sortowanie CD34+ HPCs

ludzką krew pępowinową (UCB) uzyskano z normalnych porodów w szpitalu Peking Union Hospital, a szpik kostny (BM) od normalnych dawców uzyskano z 307.szpitala Chińskiej Armii Ludowo-Wyzwoleńczej. Uzyskano świadomą zgodę I zgodę komisji etyki badań. Frakcje komórek jednojądrzastych (MNC) wyizolowano z UCB i BM przy użyciu gradientu gęstości Perkollu (d = 1,077; Amersham Biotech, Niemcy). Komórki CD34 + wzbogacono z MNC stosując pozytywną selekcję immunomagnetyczną (CD34 + MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Niemcy).

monocytowe różnicowanie HPCs

wzbogacone komórki progenitorowe krwiotwórcze CD34+ (HPCs) hodowano w wysokiej zawartości glukozy imdm uzupełnionej 30% płodową surowicą bydlęcą (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng/mL rekombinowanej ludzkiej IL-3, 100 ng/mL rekombinowanej ludzkiej SCF, 50 ng/mL rekombinowanej ludzkiej m-CSF, 100 ng/mL rekombinowana ludzka FLT3, 1 ng/ml rekombinowana ludzka IL-6, 60 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w celu indukcji różnicowania monocytów. Cytokiny zostały zakupione od Peprotech (Rocky Hill, NJ). Komórki zbierano co 3-5 dni. Do analiz morfologicznych komórki rozmazywano na szkiełkach, utrwalano w metanolu 10 min, barwiono May-Grünwald/Giemsa i analizowano w powiększeniu 400x pod mikroskopem (Nikon TE2000, Japonia) wyposażonym w aparat cyfrowy.

różnicowanie Granulocytarne HPCs

wzbogacone komórki progenitorowe krwiotwórcze CD34+ (HPCs) hodowano w wysokiej zawartości glukozy imdm uzupełnionej 30% płodową surowicą bydlęcą (Hyclone, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µM 2-ME, 2 ng/mL rekombinowanej ludzkiej IL-3, 100 ng/mL rekombinowanej ludzkiej SCF, 20 ng/mL rekombinowanej ludzkiej G-CSF, 10 ng/ml rekombinowanej ludzkiej ml rekombinowanej ludzkiej il-6, 60 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w celu indukcji różnicowania granulocytów. Cytokiny zostały zakupione od Peprotech (Rocky Hill, NJ). Komórki zbierano co 3-5 dni. Analizy morfologiczne przeprowadzono w taki sam sposób, jak różnicowanie monocytowe.

Oligonukleotydy i konstrukty

mimiki miR-129 (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGUUGC-3′), inhibitory miRNA (anty-129) i cząsteczki kontroli ujemnej (NC) otrzymano z Dharmakonu (Austin, TX) i komórki transfekowano z końcowym stężeniem tych konstruktów 100 nM przy użyciu DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). sirna (specjalnie dla KSRP i RUNX1) i kontrolnego sirna (Si-Con) zostały zsyntetyzowane przez Dharmakon, a komórki transfekowano sirna o długości 100 nM przy użyciu DharmFECT1.

w przypadku nadekspresji KSRP, klon cDNA ORF (pEGFP-KSRP) został zakupiony od Addgene (Addgene, MA). Dla ksrp knockdown, KSRP SH-RNA klonowano do wektora pSIH-H1 poniżej promotora H1 (lenti-sh_KSRP) lub bezpośrednio kupowano w postaci konstrukcji lentiwirusowych (TL311984, Origene, Rockville, MD). Dla nadekspresji pri-129-1, konstrukcję typu dzikiego 700 bp klonowano do wektora pCMV6 (129_wt) lub do plazmidu pMIRNA1 (lenti-129). Zmutowane miejsca wiązania KSRP w pri-129-1 (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 i 129_mutf) zostały również utworzone w wektorach pCMV6. Dla mir-129 knockdown, miRZIP-129 i mirzip-control zostały zakupione od System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA). Dla nadekspresji RUNX1, RUNX1 ORF został sklonowany do wektora pMIRNA1 (Lenti-RUNX1).

dla testu genu reporterowego celów miR-129, odwrotną komplementarną sekwencję do mir-129 wstawiono do reportera pmir poniżej genu lucyferazy firefly w celu wytworzenia dodatniego konstruktu reporterowego (129_pozytywny). 3 ’ – UTR ludzkiego mRNA RUNX1 Amplifikowano i sklonowano do tego samego reportera PMIR poniżej genu lucyferazy firefly, tworząc reportera typu dzikiego (RUNX1_WT). Mutacje miejsc wiązania miR-129 w 3′-UTR ludzkich sekwencji mRNA RUNX1 stworzono przy użyciu zestawu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce QuickChange (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 i RUNX1_Mut3). Komórki transfekowano tymi konstruktami stosując albo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)dla komórek 293tn, albo LIPOFECTAMINE LTX&PLUS dla komórek THP-1 i komórek NB4, zgodnie z protokołami producenta. Wszystkie startery są wymienione w danych uzupełniających 7.

lentivirus production

odpowiedni zestaw do pakowania lentivirus został zakupiony od System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA) i stosowany zgodnie z wytycznymi producenta. Zebrane cząstki wirusa (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, LENTI-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 i lenti-GFP) dodawano do komórek CD34+ HPCs, THP-1 lub NB4, a następnie komórki przemywano IMDM po 24 godzinach i platerowano do kolejnych eksperymentów.

Głębokie sekwencjonowanie miRNA

komórki THP-1 poddano elektroporacji pEGFP-KSRP lub pEGFP za pomocą systemu transfekcji neonowej, a następnie posortowano według FACS w celu zebrania komórek GFP-dodatnich. Małe RNA izolowano z całkowitego RNA za pomocą zestawu do izolacji mirVana miRNA (Ambion, Austin, TX), zgodnie z instrukcjami producenta. Małe biblioteki RNA i sekwencjonowanie miRNA zostały przeprowadzone przez Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) przy użyciu Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA). Dane sekwencjonowania zostały filtrowane, profile ekspresji zostały skonstruowane i odczyty dimerów adaptera zostały oddzielone od odczytów miRNA, które zostały już zidentyfikowane w miRbase 17.0. Dane RNA-seq analizowano za pomocą Genergy Bio i listę Mirna, których ekspresja była zwiększona po nadekspresji KSRP, przedstawiono w dodatkowych danych 5, 6.

Głębokie sekwencjonowanie RNA wzbogaconego Poli(a)

całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu odczynnika Trizolowego (Invitrogen, Carlsbad, CA), zgodnie z instrukcjami producenta, w celu przygotowania biblioteki seq wzbogaconego Poli(a) RNA. Biblioteki RNA wzbogacone Poli(a) i głębokie RNA-seq zostały zaadaptowane do Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) i zostały wykonane przez Genergy Bio. Pełna lista pierwotnych Mirna, których ekspresja zmniejszyła się po nadekspresji KSRP, znajduje się w danych uzupełniających 5, 6.

analiza rasy

aby zidentyfikować pełną długość rasy pierwotnej-129-1, 5′ I 3′, przeprowadzono reakcje na całkowitym RNA komórek THP-1 przy użyciu zestawu 5′-Full RACE Kit i 3′-Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Chiny) zgodnie z instrukcją producenta. Startery użyte do eksperymentu RACE są wymienione w danych uzupełniających 7.

test reporterowy Lucyferazy

w przypadku funkcjonalnych analiz mechanistycznych miR-129-1 przewidzieliśmy kilka celów mir-129-1 za pomocą oprogramowania bioinformatycznego Targetscan i Miranda i zwalidowaliśmy kandydatów za pomocą testu reporterowego lucyferazy. Komórki 293tn Ko transfekowano z 0,4 µg konstrukcji reporterowej, 0,015 µg wektora kontrolnego pRL-TK i 5 pmol mimicznej lub negatywnej mimiki kontrolnej mir-129. Po 48 godzinach komórki pobrano i oznaczono zestawem do oznaczania podwójnej Lucyferazy (Promega, Madison, WI), zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie testy transfekcji przeprowadzono w trzech egzemplarzach.

test przetwarzania in vitro

test przetwarzania przeprowadzono przy użyciu 10 mg/mL komórki HeLa NE. W celu zmniejszenia KSRP do 1 mg NE komórki HeLa dodano dziesięć mikrolitrów przeciwciała KSRP i jako kontrolną dodano przeciwciało IgG. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 4 °C kompleks białka i przeciwciał KSRP został immunoprecypitowany białkiem koralików a (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatantem jest ekstrakt jądrowy pozbawiony KSRP (ΔKSRP-NE). 700-nt, znakowane izotopem dzikiego typu pri-129-1 (129_wt) i pri-129-1 zawierające wszystkie cztery mutanty miejsc wiązania KSRP (129_MUT) otrzymano przez standardową transkrypcję in vitro polimerazą RNA T7 w obecności-UTP przy użyciu konstruktów 129_wt i 129_mut. 129_WT i 129_mut inkubowano z komórką HeLa NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) przez 30 min w temperaturze 37 °C w obecności KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), i 4 pmol (4×)). Mieszaniny reakcyjne poddano ekstrakcji fenolem: chloroformem, wytrącaniu i elektroforezie żelu denaturującego, a następnie autoradiografii.

Krótko, 20 µL ΔKSRP-NE inkubowano z 1 pmolem znakowanego UTP pierwotnego miR-129 i różnymi ilościami KSRP (0,5 µg) przez różne czasy (15, 40 i 60 minut) w 37 °C. mieszaniny reakcyjne traktowano proteinazą K przez 30 minut w 37 °C, a następnie poddano fenolowi.:ekstrakcja chloroformu, wytrącanie i denaturowanie elektroforezy żelowej, a następnie autoradiografia. Wszystkie niekropione żele RNA można znaleźć na fig. 12.

Northern blot

w sumie próbki 40-µg RNA załadowano i poddano denaturowaniu (mocznik) 12% żeli poliakrylamidowych, a następnie przeniesiono na błony Hybrydowe (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybrydyzację przeprowadzono za pomocą znakowanej digoksygeniną (DIG) PRI-miR-129, znakowanej γ-32P Pre-lub dojrzałej sondy miR-129 – 5p przez noc w temperaturze 42 °C. U6 snRNA i rRNA służyły jako kontrolki obciążenia odpowiednio dla miRNA pre -, dojrzałego lub pierwotnego. Poziom ekspresji mierzono poprzez normalizację do ekspresji U6 snRNA lub rRNA. Sekwencje sondy oligonukleotydowej są wymienione w danych uzupełniających 7. Ekspresja miRNA została określona ilościowo przez oprogramowanie Image J. Wszystkie nieskropkowane Northern blot można znaleźć na dodatkowej rys. 12.

test immunoprecypitacji RNA

równe ilości komórek THP-1 lub NB4 zebrano w lodowatym PBS. Następnie granulki komórek zawieszono w 1 mL buforu do lizy B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mm PMSF, 1 mm aprotynina, 1 mM leupeptyna i 2 mm kompleksy rybonukleozydów wanadylowych (VRC)) i delikatna sonikacja. Po odwirowaniu lizatów z prędkością 12 000 obr / min przez 15 minut, supernatanty wykluczono za pomocą Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) w buforze lizy B z 10 µg drożdży tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy). Następnie wykluczone lizaty stosowano do ODP z przeciwciałem anty-KSRP (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) lub izotypem królika IgG (12-370, Merck Millipore, Niemcy; 1:500) jako kontrolą przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. Granulki przemyto trzykrotnie buforem do lizy B, przy czym ostatnie płukanie zawiera dodatkowe 0,5% deoksycholanu sodu, a następnie ekstrakcję buforem C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-merkaptoetanolu i 20% glicerolu) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Immunoprecypitowany RNA ekstrahowano Trizolem i fenolowo-chloroformem. W przypadku RT-PCR każdą próbkę RNA potraktowano Dnazą i (Ambion, zestaw TM wolny od DNA). Następnie równe ilości transkrybowano za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA O Dużej Pojemności (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fałdowe wzbogacanie RNA przez KSRP mierzono za pomocą qPCR i elektroforezy w żelu agarozowym. Startery używane do eksperymentów RIP-PCR są wymienione w danych uzupełniających 7.

Immunoprecypitacja kompleksów białkowo-RNA

Oczyszczanie powinowactwa z białkiem wiążącym maltozę (MBP) zastosowano do identyfikacji białek związanych z pierwotnymi Mirna. Plazmid ekspresyjny MS2 – MBP był prezentem od Dr Lingling Chen (Chińska Akademia Nauk), a MS2-MBP wyrażano i oczyszczano z E. coli za pomocą protokołu z laboratorium Steize (Uniwersytet Yale). Trzy miejsca wiązania białka z otoczką MS2 (5′-cgtacaccagggtacgagcccatggcgtacaccagggtacgaggtacgactagtagtagatctcgtacaccagggtaccagggtacg-3′) wstawiono poniżej sekwencji genu pri-129-1 lub sekwencji mutantów w miejscu wiązania KSRP pri-129-1. Komórki 293tn transfekowano konstruktami zawierającymi MS2 w celu uzyskania białek związanych z pierwotnymi Mirna, a do każdego testu immunoprecypitacji użyto 10 milionów komórek. Komórki pobrano 48 h po transfekcji i poddano analizie RNA pull-down. Krótko mówiąc, komórki przepłukano dwukrotnie lodowatym PBS przed zebraniem w 10 mL lodowatego PBS przez skrobanie. Następnie granulki komórek zawieszono w 1 mL buforu IP (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, koktajl inhibitora proteinazy) i poddano 2 rundom delikatnej sonikacji i odwirowano w celu uzyskania ekstraktów komórkowych. Supernatant inkubowano najpierw z MS2-MBP przez 1 godzinę, a następnie amylozowe kulki żywiczne (NEB) przez kolejne 1 godzinę w temperaturze 4 ° C. kulki przemyto pięć razy buforem IP z delikatną skałą, a ostatnie płukanie buforem IP dostarczonym z dodatkowym 150 mM NaCl. Składniki białkowe ostatecznie eluowano z koralików z buforem IP uzupełnionym maltozą 12 mM i sprawdzano WB następującymi pierwotnymi przeciwciałami: króliczy anty-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), króliczy anty-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), króliczy anty-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) i mysi anty-GAPDH (ab191875, Abcam; 1:1000).60004-1-IG, proteintech; 1: 1 000 000).

test ochrony RNazy H

przeprowadzono standardową reakcję ochrony RNazy h W całkowitej objętości 25 µL zawierającej 1 pmol białka KSRP, 1 pmol RNA znakowanego UTP, 20 µg/mL oligonukleotydów DNA, 12 mm HEPES (pH 8,0), 60 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 J.Rnasyny (40 j./µL, Promega, Madison, WI) i 1 u RNazy E. coli H. w celu kontroli przygotowano reakcję z odpowiednią ilością zdeproteinizowanego znakowanego UTP RNA i takimi samymi warunkami jonowymi jak ekstrakt i inkubowano w temperaturze 25 °C przez 15 minut. Reakcję zakończono przez dodanie 75 µL destylowanego H2O, 100 µL buforu 2 × PK i 4 µL proteinazy K (10 mg/mL), a RNA przygotowano zgodnie z opisem w „qPCR” w celu analizy fragmentów RNA. RNA zawieszono w 25 µL buforu obciążającego żelem mocznikowym (5 mM EDTA, 10% (obj./obj.) glicerolu, 0,05% (obj./obj.) Ksyleno-Cyanolu FF, 0,05% (obj./obj.) błękitu Bromofenolowego i 50% dejonizowanego formamidu) i oddzielono na żelach denaturujących mocznik, a następnie autoradiografią.

qPCR

całkowite RNA ekstrahowano z komórek i tkanek przy użyciu odczynnika Trizolowego (Invitrogen, Carlsbad, CA), a następnie trawienie Dnazą I, zgodnie z instrukcjami producenta. RNA oznaczano ilościowo przez pomiar absorbancji przy 260 nm i odwrotną transkrypcję. Quantitative real-time PCR (qPCR) przeprowadzono przy użyciu systemu Bio-Rad iQ5 real-time PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Startery używane do odwrotnej transkrypcji i qPCR pokazano w danych uzupełniających 7. Dane zostały znormalizowane przy użyciu endogennego mRNA GAPDH i U6 snRNA. Do analizy danych PCR użyto metody 2-ΔΔCT.

cytometria przepływowa

komórki zebrano we wskazanych punktach czasowych i przemyto dwukrotnie PBS/0,5% BSA w temperaturze 4 °c w celu zablokowania receptorów Fc. Transdukowane HPC CD34 + zostały zabarwione przeciwciałami anty-CD14 (klon: 61d3) lub anty-CD11b (klon: ICRF44) sprzężonymi z APC (eBioscience, San Diego, CA). Komórki BM myszy barwiono przeciwciałem anty-CD33 sprzężonym z PE (klon: HIM3-4 eBioscience, CA, USA). Cytometrię przepływową wykonano na Cytometrze przepływowym C6 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Dane analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo (Wersja 7.6, TreeStar, Ashland, OR).

Testy Na Myszy i transplantacje

wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono za zgodą komitetu etyki badawczej Pekińskiego Uniwersytetu Medycznego. Dziesięć milionów CD34 + HPC zakażonych Lenti-SH-KSRP, Lenti-129 lub Lenti-GFP zostało przemytych i ponownie zawieszonych w PBS, a następnie wstrzyknięto do bocznej żyły ogonowej 4-tygodniowych do 6-tygodniowych samic myszy otrzymujących NOD / SCID napromieniowanych promieniami rentgenowskimi w dawce 250 cGy. Cztery tygodnie po przeszczepieniu HPC CD34+ myszy poświęcono, a BM i śledziony zebrano i przetworzono w jednokomórkowe zawiesiny do kolejnych eksperymentów. Wyniki uzyskano od 4 myszy na Grupę.

Western blot

lizaty pełnokomórkowe poddano analizie Western blot. Królicze poliklonalne przeciwciało anty-KSRP (6994-1; 1:1000) i przeciwciało anty-RUNX1 (ab35962; 1:1000) pochodzące z Epitomics (Abcam, Cambridge, MA) lub przeciwciało GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100 000) stosowano jako pierwotne przeciwciała i inkubowano w 1× tbst zawierającym 5% BSA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) z ciągłym wytrząsaniem. Po płukaniu 1× TBST przez 15 minut w RT, membrany inkubowano z sprzężonym z HRP kozim wtórnym Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) przez 1 godzinę w RT. po końcowym etapie płukania 1× tbst przez 15 minut w RT, pasma immunoreaktywne wizualizowano przez enhanced chemiluminescence (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) w wskazanym czasie ekspozycji („czas ekspozycji dla Western blot”). Wszystkie nieskropkowane Zachodnie plamy można znaleźć na rysunku uzupełniającym. 11.

test przetwarzania In vivo na danio pręgowanym

zarodki Pobrano z laboratoryjnej Kolonii hodowlanej danio pręgowanego Tuebingen w temperaturze 28 °C w cyklu jasno-ciemnym 14:10 h i hodowano w standardowych warunkach (China Danio pręgowany Resource Center). MRNA KSRP i GFP-Pri-129 WT lub zmutowane mRNA w miejscu wiązania KSRP zsyntetyzowano in vitro z odpowiednich linearyzowanych plazmidów przy użyciu zestawu mMESSAGE Mmachine Kit (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). MRNA KSRP i mRNA GFP-Pri-129_wt (lub mRNA GFP-Pri-129_mut) wstrzyknięto do zarodków danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym. Zarodki wystawiono w temperaturze 28 °C zgodnie z kryteriami HPF i morfologicznymi 52. Obrazy embrionów w temperaturze 4 HPF i 24 HPF pozyskano przy użyciu stereoskopowego urządzenia Zeiss Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy).

test przetwarzania In vivo w komórkach 293tn

komórki 293tn hodowano w 6-studzienkowych płytkach przez 24 godziny, aż osiągnęły ≈70-80% zbiegu. Komórki współwystępowano z fuzją EGFP Pri – 129_wt lub zmutowanymi plazmidami Pri-129, pcDNA4-RFP i plazmidem pCMV-KSRP przy użyciu Lipofectaminy 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Dwadzieścia cztery godziny później komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym Zeissa w powiększeniu 400× (Carl Zeiss Microscopy GmbH). RNA ekstrahowano również do analizy qPCR wydajności przetwarzania przez wykrycie pierwotnego miR-129 vs dojrzałego mir-129. Intensywność fluorescencji została określona ilościowo za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ proximity ligation assay

in situ PLAs wykonano zgodnie z protokołem produkcji (Sigma-Aldrich). Królicze przeciwciała przeciw Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) i królicze przeciw DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) połączono z przeciwciałami pierwotnymi przeciw KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Kanada; 1:50) lub normalnym przeciwciałem poliklonalnym IgG królika (12-370, Merck Millipore, Niemcy; 1:50). Przeciwciało poliklonalne anty-KSRP i prawidłowe królicze IgG jako kontrola negatywna. Przed blokowaniem komórki 293t lub HeLa hodowano na szkiełkach komorowych (Sigma), utrwalonych w 10% Formaldehydu, przenikanych 0,25% Tritonem X-100-PBS. Komórki analizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej Zeiss LSM780 (Zeiss, Niemcy), a następnie dekonwolucji za pomocą Huygens Essential version 16.05 (Scientific Volume Imaging, Holandia, http://svi.nl). Punkty PLA na komórkę oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu BlobFinder V3.2 (Uniwersytet w Uppsali, Sztokholm, Szwecja), A średnią liczbę punktów PLA na komórkę obliczono analizując co najmniej 100 komórek.

Analiza Bioinformatyczna

wszystkie sparowane odczyty końców zostały przycięte dla sekwencji adaptera przy użyciu Trim Galore (Wersja 0.3.7) z parametrami „-q 25 –stringency 5 –length 50 –paired –phred33” i filtrowane dla sekwencji niskiej jakości. Hg38 reference genome (GRCh38) and gene annotation file (GTF format) was downloaded from GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/)53. TopHat54, 55 (Wersja 2.1.0) został użyty do wyrównania przefiltrowanych odczytów do genomu referencyjnego genomu hg38 z domyślnymi ustawieniami, a Fpkms (fragmenty na Transkryptom Kilobazy na milion odczytów) uzyskano za pomocą Cufflinks54 (Wersja 2.2.1) z domyślnymi parametrami. Poziomy ekspresji oszacowano za pomocą funkcji counts56 (Wersja 1.5.0) z parametrami „-t 7 –primary”, surowe liczby na poziomie genu pochodzą z sumy odpowiednich wartości dla wszystkich izoform genu.

EBSeq-HMM18 wykorzystano do analizy różnic ekspresji genów pomiędzy trzema etapami różnicowania monocytów i granulocytów. Istnieją dwa główne kroki dla EBSeq-HMM, aby uzyskać geny o różnej ekspresji (DE):

1. 1)

   wykrywanie genów DE, które wykazały znaczącą zmianę między dowolnymi dwoma etapami pod docelową fałszywą szybkością wykrywania (FDR) 0,05.

2. 2)

   grupowanie genów DE w ścieżki ekspresji z maksymalnym prawdopodobieństwem tylnym (PP) większym niż 0,5.

stosując EBSeq-HMM, otrzymaliśmy geny DE i odpowiadające im ścieżki ekspresji (tj.” góra-dół”) w dniu 5, 10 i 15 różnicowania monocytów (lub granulocytów) (dane uzupełniające 1). Ścieżka ekspresji „góra-dół” oznacza, że gen był regulowany w górę w dniu 10 w porównaniu z dniem 5, podczas gdy w dół regulowany w dniu 15 w porównaniu z dniem 10. Do dalszej analizy wybrano geny monotonicznie podwyższone („Up-Up”) lub obniżone („Down-Down”) podczas różnicowania monocytów (lub granulocytów).

poziomy ekspresji genów oszacowano za pomocą FPKM, a wszystkie geny z fpkm ≥ 1 jako ekspresji genów wykorzystano do dalszej analizy. Informacje o RBP zostały pobrane z baz danych Rbpdb19 i ATtRACT20. Opracowaliśmy skrypt R (dane uzupełniające 8), aby sklasyfikować geny DE ze ścieżkami ekspresji „Up-Up” lub „Down-Down” (dane uzupełniające 2, 3) w różne wzorce ekspresji.

mapy cieplne zostały narysowane za pomocą funkcji „pheatmap” pakietów R „pheatmap”, a VennDiagram został narysowany za pomocą funkcji ” draw.parami.venn „z pakietu r „VennDiagram”. K-oznacza klastrowanie przeprowadzono za pomocą funkcji „pheatmap” i klastry uzyskano za pomocą funkcji „cutree” za pomocą R.

elektrotransfekcje Plazmidowe

zastosowaliśmy System transfekcji Neon zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu poprawy wydajności transfekcji plazmidowej w komórkach THP-1 do analizy RNA-seq. Komórki poddano elektrotransfekcji plazmidami (pEGFP, pSIH-H1-SH-luc, pEGFP-KSRP lub pSIH-H1-SH-KSRP). Parametry elektroporacji dla komórek 1 × 107 THP-1 lub NB4 wynosiły impuls 1350 V, szerokość impulsu 10 ms i 4 impulsy z końcówką 10 µL. Czterdzieści osiem godzin później skuteczność elektrotransfekcji została wykryta przez Western blotting lub qPCR.

testy ratunkowe

w celu potwierdzenia, że KSRP Promuje przetwarzanie pri-miR-129 w celu regulacji różnicowania linii mieloidalnej, komórki THP-1 transfekowano pEGFP-KSRP przy użyciu Lipofektaminy 2000, a 24 godziny później, komórki transfekowano inhibitorem mir-129. Komórki NB4 transfekowano si-KSRP w końcowym stężeniu 100 nM przy użyciu DharmFECT1, a 24 godziny później komórki transfekowano mimikiem miR-129. Aby potwierdzić, że docelowy mir-129 RUNX1 reguluje różnicowanie linii mieloidalnej, komórki THP-1 i NB4 transfekowano si-RUNX1 i inhibitorem miR-129 lub ich kontrolą przez system transfekcji neonowej. Następnie komórki stymulowano PMA lub ATRA przez dodatkowe 48 godzin przed pobraniem do dalszych analiz. Ekspresję CD14 w komórkach THP-1 poddanych różnicowaniu monocytowemu oraz ekspresję CD11b w komórkach NB4 poddanych różnicowaniu granulocytowemu analizowano metodą cytometrii przepływowej.

czas ekspozycji dla Western blot

Większość Western blot została opracowana przez Tanon 5200 automatic digital Gel image analysis system (Tanon, Szanghaj, Chiny), a czas ekspozycji GAPDH wynosi 150-350 ms. na Fig. 2a, czas ekspozycji próbek wzdłuż różnicowania monocytowego wynosi 20 s dla KSRP; czas ekspozycji próbek wzdłuż różnicowania granulocytowego wynosi 200 ms dla KSRP. Na Rys. 2B, czas ekspozycji wynosi 20 s dla KSRP. Na Rys. 4f-h, Czas ekspozycji wynosi 60 s dla KSRP. Na Rys. 5b, czas ekspozycji wynosi 60 s dla Drosha, DGCR8 i KSRP. Na Rys. 6J, k, czas ekspozycji wynosi 90 s dla RUNX1. Na Rys. 7G, czas ekspozycji wynosi 90 s dla RUNX1 i KSRP. Na Rys. 7H, czas ekspozycji wynosi 30 s dla RUNX1 i KSRP. Na Rysunku Uzupełniającym. 2a, czas ekspozycji próbek wzdłuż różnicowania monocytowego wynosi 3 s dla KSRP; czas ekspozycji próbek wzdłuż różnicowania granulocytowego wynosi 300 ms dla KSRP. Na Rysunku Uzupełniającym. 4A, e, f, czas ekspozycji wynosi 60 s dla KSRP. Na Rysunku Uzupełniającym. 7m, czas ekspozycji wynosi 10 s I 90 s dla RUNX1 w THP-1 i NB4, odpowiednio. Na Rysunku Uzupełniającym. 8A, czas ekspozycji wynosi 60 s dla RUNX1.

dla innych zdjęć pokazujących wynik ręcznej ekspozycji (rys. 2D, i; dodatkowe rys. 7n), czas ekspozycji na GAPDH wynosi około 1 s.na Fig. 2d, czas ekspozycji wynosi 30 s dla KSRP w próbkach indukowanych PMA i 10 s dla KSRP w próbkach indukowanych ATRA. Na Rys. 2i, czas ekspozycji wynosi 60 s dla KSRP. Na Rysunku Uzupełniającym. 7n, czas ekspozycji wynosi 90 s dla RUNX1.

Izolacja monocytów i neutrofili z krwi obwodowej

poinformowana zgoda została uzyskana zgodnie z instytucjonalną Komisją Rewizyjną Chińskiej Akademii Nauk Medycznych. Ludzkie monocyty i neutrofile wyizolowano z krwi obwodowej zdrowych dawców w 3% dekstranie i wyizolowano przez odwirowanie gradientem percollu, a następnie oczyszczanie za pomocą mikrogranulek CD14 (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Niemcy) lub Easysep Human neutrofil Enrichment Kit (#19257, Stemcell Technologies, Kanada). Po posortowaniu za pomocą mikrogranulek CD14, otrzymane komórki CD14 dodatnie wsadzono do kolb T-25 i hodowano przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C, aż do momentu zebrania przylegających monocytów przez skrobanie.

analiza statystyczna

dla wszystkich badań n na Grupę jest jak wskazano na rysunku legenda. Wszystkie dane zostały przeanalizowane przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., USA) i przedstawiana jako średnia ± SD. Różnice między grupami eksperymentalnymi i grupami kontrolnymi analizowano za pomocą dwuogonowego testu t Studenta. Istotność statystyczna została zaakceptowana przy P < 0, 05. Nie zastosowano metod statystycznych do wstępnego określenia wielkości próby. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z użyciem co najmniej trzech replik biologicznych. Dobraliśmy odpowiednie testy zgodnie z rozkładami danych. Eksperymenty nie były randomizowane i nie wykluczyliśmy żadnych próbek. Badacze nie byli zaślepieni przy przydzielaniu podczas eksperymentów i oceny wyników.

dostępność danych

dane dotyczące sekwencjonowania miRNA i pri-miR-RNA zostały zdeponowane w bazie danych GEO pod kodem gse87318. Dane do sekwencjonowania mRNA zostały również zdeponowane w bazie danych GEO pod kodem akcesyjnym GSE87088. Dane źródłowe dla rys. 1c-e zostały dostarczone jako dane uzupełniające 1-4. Dane źródłowe dla rys. 2b, c zostały dostarczone jako dane uzupełniające 5, 6. Wszystkie inne dane potwierdzające wyniki tego badania są dostępne u odpowiedniego autora na żądanie.