ksrp spesifiserer monocytisk og granulocytisk differensiering ved å regulere mir-129 biogenese og RUNX1 expression

Monocytisk og granulocytisk differensiering av cellelinjer

den humane monocytiske cellelinjen THP-1, OG den promyelocytiske cellelinjen NB4 OG HL-60 var KJØPT FRA ATCC (manassas, usa) og vedlikeholdt i rpmi1640 supplert MED 10% foster Storfe serum (gibco, carlsbad, ca). Celler ble screenet AV PCR for autentisering og ved immunfluorescens tester for frihet fra mycoplasma forurensning. Monocytisk differensiering av thp-1-og HL-60-celler ble indusert ved behandling av cellene med 50 nM PMA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland) for 0, 24, 48 og 72 timer. Granulocytisk differensiering AV NB4-og HL-60-celler ble indusert ved behandling av cellene med 1 µ ATRA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Ingen cellelinjer brukt i denne studien ble funnet i databasen med ofte feilidentifiserte cellelinjer som opprettholdes av ICLAC Og NCBI Biosample. Cellelinjer ble testet for mycoplasma forurensning, men har ikke blitt re-godkjent.

Sortering AV CD34 + HPCs

Humant navlestrengsblod (Ucb) ble hentet fra normale fulltids leveranser På Peking Union Hospital, og benmarg (BM) fra normale givere ble hentet fra 307th Hospital Of Chinese People ‘ S Liberation Army. Det ble innhentet informert samtykke og godkjenning fra Forskningsetisk Utvalg. Mononukleære celle (MNC) fraksjoner ble isolert fra UCB og BM ved Hjelp Av En Perkoll tetthet gradient (d = 1,077; Amersham Biotech, Tyskland). CD34 + – celler ble beriket fra MNCs ved hjelp av positivt immunomagnetisk utvalg (CD34+ MultiSort Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Glad-bach, Tyskland).

Monocytisk differensiering Av Hpc

de berikede CD34+ hematopoietiske stamceller (Hpc) ble dyrket i IMDM med HØY glukose supplert med 30% føtalt bovint serum (Hyklon, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µ 2-ME, 2 ng/mL rekombinant HUMAN IL-3, 100 ng/mL rekombinant HUMAN SCF, 50 ng/mL rekombinant human M-csf, 100 ng/ml rekombinant Human Flt3, 1 Ng/Ml Rekombinant Human Il-6, 60 mg/ml penicillin og 100 mg/Ml streptomycin for å indusere monocyttdifferensiering. Cytokiner ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celler ble høstet hver 3-5 dager. For morfologiske analyser ble cellene smurt på glassglass, festet i metanol 10 min, farget Med May-Grü / Giemsa,og analysert ved 400x forstørrelse under et mikroskop (Nikon TE2000, Japan) utstyrt med et digitalkamera.

Granulocytisk differensiering Av Hpcer

de berikede CD34+ hematopoetiske stamceller (Hpcer) ble dyrket i HØY glukose IMDM supplert med 30% føtalt bovint serum (Hyklon, Logan, Utah), 1% BSA, 100 µ 2-ME, 2 ng/mL rekombinant HUMAN IL-3, 100 ng/mL rekombinant HUMAN SCF, 20 ng/mL rekombinant human SCF, 20 ng/mL rekombinant human G-csf, 10 ng/ml rekombinant Human Il-6, 60 Mg/Ml Penicillin Og 100 Mg / ml STREPTOMYCIN for å indusere granulocyttdifferensiering. Cytokiner ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Celler ble høstet hver 3-5 dager. Morfologiske analyser ble utført på samme måte som monocytisk differensiering.

Oligonukleotider og konstruksjoner

miR-129 etterligner (5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3′), miRNA-hemmere (anti-129) og negative kontrollmolekyler (NC) ble oppnådd Fra Dharmacon (Austin, TX) og celler ble transfisert med en endelig konsentrasjon av disse konstruksjonene på 100 nM ved Bruk Av DharmFECT1 (Dharmacon, Austin, TX). siRNAs (spesielt FOR KSRP OG RUNX1) og kontroll siRNAs (Si-Con) ble syntetisert Av Dharmacon og celler ble transfisert med 100 nM siRNAs ved Hjelp Av DharmFECT1.

for KSRP-overuttrykk ble den menneskelige ksrp (NM_003685.2) cDNA ORF klonen (pEGFP-KSRP) kjøpt fra Addgene (Addgene, MA). FOR ksrp knockdown ble KSRP sh-RNA klonet i psih-H1-vektoren nedstrøms For h1-promotoren (lenti-sh_KSRP) eller direkte kjøpt i form av lentivirale konstruksjoner (TL311984, Origene, Rockville, MD). For pri-129-1 overuttrykk ble en 700-bp villtype konstruksjon klonet inn i pCMV6-vektoren (129_wt) eller inn i pmirna1 plasmid (lenti-129). De mutante ksrp-bindingsstedene i pri-129-1 (129_mut1, 129_mut2, 129_mut3, 129_mut4 og 129_mutf) ble også opprettet i pCMV6 vektorer. For mir-129 knockdown ble miRZIP-129 og miRZIP-control kjøpt fra System Biosciences (Sbi, Palo Alto, CA). FOR RUNX1 overuttrykk BLE RUNX1 ORF klonet i pmirna1-vektoren (Lenti-RUNX1).

for reporter – genanalysen av miR-129-mål ble den omvendte komplementære sekvensen til miR-129 satt inn i pmir-reporteren nedstrøms for firefly luciferase-genet for å generere den positive reporterkonstruksjonen (129_positive). 3 ‘ – UTR av human RUNX1 mRNA ble forsterket og klonet i samme pMIR-reporter nedstrøms av firefly luciferase genet for å danne wild-type reporter (RUNX1_WT). Mutasjoner av mir-129 bindingssteder i 3 ‘ – UTR av menneskelige RUNX1 mRNA-sekvenser ble opprettet ved Hjelp Av QuickChange Site-directed Mutagenesis kit (RUNX1_Mut1, RUNX1_Mut2 og RUNX1_Mut3). Celler ble transfisert med Disse konstruksjonene ved hjelp Av Enten Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) FOR 293tn-celler eller Lipofectamine LTX&PLUSS FOR THP-1-celler og NB4-celler, i henhold til produsentens protokoller. Alle primere er oppført i Supplerende Data 7.

Lentivirus production

det aktuelle lentivirus-pakkesettet ble kjøpt Fra System Biosciences (Sbi, Palo Alto, CA) og brukt i henhold til produsentens retningslinjer. De høstede viruspartiklene (lenti-129, lenti-miRZIP-129, lenti-sh_KSRP, lenti-RUNX1, lenti-sh_RUNX1 og lenti-GFP) ble tilsatt TIL CD34+ HPCs, THP-1 eller NB4-celler, og cellene ble deretter vasket MED IMDM etter 24 timer og belagt for etterfølgende eksperimenter.

miRNA deep sequencing

THP-1-celler ble elektroporert med pEGFP-KSRP eller pEGFP ved Hjelp Av Neontransfeksjonssystemet og deretter sortert ETTER FACS for å samle DE GFP-positive cellene. Små Rna ble isolert fra det totale RNA med mirVana miRNA Isolasjonssettet (Ambion, Austin, TX), i henhold til produsentens instruksjoner. Små rna-biblioteker og miRNA-sekvensering ble utført Av Genergy Bio (Genergy Bio-technology Co., Ltd., Shanghai, Kina) ved Hjelp Av En Illumina HiSeq2000(Illumina, USA). Sekvenseringsdataene ble filtrert, uttrykksprofilene ble konstruert og adapterdimerlesene ble skilt fra miRNA-lesene som allerede var identifisert i miRbase 17.0. RNA-seq data ble analysert Ved Genergy Bio og en liste over mirna hvis uttrykk ble økt VED ksrp overuttrykk er vist I Supplerende Data 5, 6.

Poly (A)-beriket rna dyp sekvensering

Totalt RNA ble ekstrahert Ved Hjelp Av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), i henhold til produsentens instruksjoner, for å forberede poly(A)-beriket RNA-seq bibliotek. Poly (A)-beriket RNA biblioteker og dyp RNA-seq ble tilpasset Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) og ble utført Av Genergy Bio. En komplett liste over primære mirna hvis uttrykk redusert ved ksrp overuttrykk er oppført I Supplerende Data 5, 6.

LØPSANALYSE

for å identifisere full lengde av primær-129-1, 5′ og 3′ LØP, ble reaksjoner utført på totalt RNA AV THP-1 celler ved hjelp av 5 ‘- Full RACE Kit og 3 ‘ – Full RACE Kit (TaKaRa, Dalian, Kina) i henhold til produsentens håndbok. Primere som brukes FOR LØPET eksperimentet er oppført I Supplerende Data 7.

Luciferase reporter assay

for funksjonelle mekanistiske analyser av miR-129-1 spådde vi flere mir-129-1-mål ved hjelp av bioinformatikkprogramvaren Targetscan og Miranda og validerte kandidatene med luciferase reporter assay. 293TN-celler ble samtidig transfisert med 0,4 µ av reporterkonstruksjonen, 0,015@g av pRL-TK kontrollvektoren og 5 pmol av miR-129 mimic eller negativ kontrollmimic. Etter 48 timer ble cellene høstet og analysert Med Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI), i henhold til produsentens instruksjoner. Alle transfeksjonsanalyser ble utført i tre eksemplarer.

in vitro prosesseringsanalyse

prosesseringsanalysen ble utført ved bruk av En 10 mg/mL HeLa-celle NE. For uttømming AV KSRP ble ti mikroliter ksrp-antistoff tilsatt til 1 mg HeLa-celle NE og Et IgG-antistoff ble tilsatt som kontroll. Etter en 30-minutters inkubasjon ved 4 °C ble KSRP-protein-og antistoffkomplekset immunoprecipitert Med Protein a-perler (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Supernatanten er ksrp-utarmet atomekstrakt (Δ RP-NE). De 700-nt, isotopmerkede villtype pri-129-1 (129_wt) og pri-129-1 som inneholder alle FIRE ksrp-bindingsstedmutantene (129_mut) ble fremstilt ved standard in vitro transkripsjon med T7 RNA-polymerase i nærvær av-UTP ved BRUK AV 129_wt og 129_Mut konstruksjonene. 129_WT og 129_Mut ble inkubert Med HeLa celle NEs (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) i 30 min ved 37 °C i NÆRVÆR AV KSRP (0, 1 (1×), 2 (2×), og 4 pmol (4×)). Reaksjonsblandingene ble utsatt for fenol: kloroformekstraksjon, utfelling og denaturerende gelelektroforese, etterfulgt av autoradiografi.

redningsbehandlingsanalysen ble utført. Kort sagt ble 20 µ av Δ RP-NE inkubert med 1 pmol av-UTP-merket primær mir-129 og forskjellige mengder KSRP (0,5 µ) for forskjellige tidspunkter (15, 40 og 60 min) ved 37 °C. reaksjonsblandingene ble behandlet med proteinase K i 30 min ved 37 °C og deretter utsatt for fenol.:kloroform ekstraksjon, nedbør og denaturering gel elektroforese, etterfulgt av autoradiografi. Alle uncropped RNA geler kan bli funnet I Supplerende Fig. 12.

Northern blot

Totalt 40-µ RNA-prøver ble lastet og kjørt på denaturering (urea) 12% polyakrylamidgeler og deretter overført til Hybond membraner (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybridisering ble utført med digoxigenin (DIG)-merket pri-miR-129, γ-32P-merket pre – eller moden miR-129-5p-probe over natten ved 42 °C. U6 snRNA og rRNA ble servert som lastekontroller for henholdsvis pre-, moden eller primær miRNA. Uttrykksnivået ble målt ved normalisering til uttrykket For U6 snRNA eller rRNA. Oligonukleotid sonde sekvenser er oppført I Supplerende Data 7. Uttrykk for miRNA ble kvantifisert Av Bilde J software. Alle uncropped Northern blot kan bli funnet I Supplerende Fig. 12.

rna immunopresipitasjonsanalyse

Like mengder thp-1-eller NB4-celler ble høstet i iskalde PBS. Deretter ble cellepellets resuspendert i 1 mL lysisbuffer B (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Igepal, 1 mM PMSF, 1 mM aprotinin, 1 mM leupeptin og 2 mM vanadyl ribonukleosidkomplekser (VRC)) og mild sonikering. Etter at lysatene ble sentrifugert ved 12 000 o / min i 15 min, ble supernatantene precleared med Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA) i lysebuffer B med 10 µ gjær tRNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Deretter ble de precleared lysatene brukt TIL RIP med enten et anti-KSRP-antistoff (Epitomics, Abcam, Cambridge, MA; 6994-1; 1:500) eller en kanin isotype IgG (12-370, Merck Millipore, Tyskland; 1:500) som kontroll for 4 timer ved 4 °C. Perlene ble vasket tre ganger med lysisbuffer B, med den siste vasken som inneholdt ytterligere 0,5% natriumdeoksykolat, etterfulgt av ekstraksjon med buffer C (100 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 12% β-merkaptoetanol og 20% glyserol) ved romtemperatur i 10 min. Det immunprecipiterte RNA ble ekstrahert Med Trizol og fenolkloroform. FOR RT-PCR ble hver rna-prøve behandlet Med DNase I (Ambion, DNA-free TM kit). Deretter ble like mengder omvendt transkribert med cDNA Revers Transkripsjon Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) Med høy Kapasitet. Folden anrikning Av Rna VED KSRP ble målt ved qPCR og agarose gel elektroforese. Primere som brukes FOR RIP-PCR eksperimenter er oppført I Supplerende Data 7.

Immunopresipitasjon av protein-RNA-kompleksene

Maltosebindende protein (MBP)-affinitetsrensing ble brukt til å identifisere proteiner assosiert med primære mirna. MS2-MBP expression plasmid var en gave fra Dr. Lingling Chen (Kinesisk Vitenskapsakademi) OG MS2-MBP ble uttrykt og renset Fra E. coli ved hjelp av en protokoll fra Steize lab (Yale University). Tre MS2-kappede proteinbindingsseter (5′-cgtacaccatcagggtacgagcccatggcgtacaccatcagggtacgactagtagatctcgtacgtacaccatcagggtacg-3′) ble satt nedstrøms for pri-129-1 gensekvens eller pri-129-1 KSRP-bindingssekvens mutantsekvenser. 293TN-celler ble transfisert MED MS2-holdige konstruksjoner for å oppnå proteiner assosiert med primære mirna, og 10 millioner celler ble brukt til hver immunoprecipitasjonstest. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon og utsatt FOR rna-nedtrekksanalyse. Kort sagt ble cellene skyllet to ganger med iskald PBS før høsting i 10 mL iskald PBS ved skraping. Deretter ble cellepellets resuspendert i 1 mL IP-buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Igepal, 1 mM PMSF, proteinaseinhibitor cocktail) og utsatt for 2 runder med mild sonikering og sentrifugert for å oppnå celleekstrakter. Supernatanten ble først inkubert MED MS2-MBP i 1 time og deretter amyloseharpiksperler (NEB) i ytterligere 1 time ved 4 C. perlene ble vasket fem ganger med IP-buffer med mild stein og en siste vask med IP-buffer levert med ytterligere 150 mM NaCl. Proteinkomponentene ble til slutt eluert fra perler MED IP-buffer supplert med 12 mM Maltose, OG BLE kontrollert AV WB med følgende primære antistoffer: kanin anti-Drosha (ab12286, Abcam; 1:1000), kanin ANTI-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:1000), kanin ANTI-KSRP (6994-1, Epitomics; 1:1000) og mus anti-GAPDH (60004-1-ig, proteintech; 1:1,000,000).

rnase h beskyttelsesanalyse

en standard rnase H beskyttelsesreaksjon ble utført i et totalvolum på 25 µ inneholdende 1 pmol KSRP-protein, 1 pmol AV UTP-merket RNA, 20 µ/mL DNA-oligonukleotider, 12 mM HEPES (pH 8,0), 60 mM mgcl2, 1 mM DTT, 20 e RNasin (40 e/µ, Promega, Madison, wi) og 1 e. coli rnase H. for kontrollen ble en reaksjon med tilsvarende mengde deproteinisert Utp-merket rna og de samme ioniske forholdene som ekstraktet fremstilt og inkubert ved 25 °C i 15 min. Reaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 75 µ av destillert H2O, 100@l av 2 × FARMAKOKINETISK buffer og 4 hryvnias proteinase K (10 mg / mL), OG RNA ble utarbeidet som beskrevet i ‘qPCR’ for å analysere RNA-fragmentene. RNA ble resuspendert i 25 µ av ureagellastende buffer (5 mM EDTA, 10% (v/v) glyserol, 0,05% (w/v) Xylencyanol FF, 0,05% (w/v) Bromfenolblått og 50% avionisert formamid) og separert på urea denaturerende geler, etterfulgt av autoradiografi.

qPCR

Total RNA ble ekstrahert fra celler og vev ved Hjelp Av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) etterfulgt Av DNase i fordøyelse, i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 260 nm og revers transkribert. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført ved Hjelp Av Bio-Rad IQ5 real-time PCR-systemet i henhold til produsentens instruksjoner. Primere brukt for revers transkripsjon og qPCR ble vist i Supplerende Data 7. Dataene ble normalisert ved bruk av endogene gapdh mRNA Og U6 snRNA. 2-ΔΔ-METODEN ble brukt til å analysere pcr-DATAENE.

Flowcytometri

cellene ble høstet på de angitte tidspunktene og vasket to ganger med PBS/0,5% BSA ved 4 °C for å blokkere Fc-reseptorene. De transduserte CD34 + Hpcene ble farget MED APC-konjugert anti-CD14 (klon: 61d3) eller anti-CD11b (KLON: ICRF44) antistoffer (eBioscience, San Diego, CA). Mus bm-celler ble farget MED ET PE-konjugert ANTI-CD33 antistoff( klon: HIM3 – 4 eBioscience, CA, USA). Flowcytometri ble utført På Et C6-Flowcytometer (Bd Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Dataene ble analysert ved Hjelp Av FlowJo programvare (Versjon 7.6, TreeStar, Ashland, ELLER).

Mus og transplantasjon analyser

alle dyreforsøk ble utført med godkjenning Av Forskningsetikk Komiteen Peking Union Medical College. Ti millioner CD34 + Hpc-er infisert med lenti-sh-KSRP, lenti-129 eller lenti-GFP-kontroll ble vasket og resuspendert I PBS og deretter injisert i den laterale halevenen av 4 uker til 6 uker gamle KVINNELIGE NOD / SCID-mottakermus bestrålt med røntgenstråler i en dose på 250 cGy. Fire uker etter transplantasjonen AV CD34 + Hpcene ble musene ofret, OG BM og milten ble samlet og behandlet til enkeltcellesuspensjoner for de etterfølgende forsøkene. Resultatene ble oppnådd fra 4 mus per gruppe.

Western blot

helcellelysater ble utsatt For Western blot analyse. Rabbit polyclonal anti-KSRP antistoff (6994-1; 1: 1000) og anti-RUNX1 antistoff (ab35962; 1: 1000) som Fra Epitomics (Abcam, Cambridge, MA), eller ET gapdh antistoff (60004-1-Ig, Proteintech, Rosemont, IL; 1:100 000) ble brukt som primære antistoffer og inkubert i 1× TBST inneholdende 5% BSA i 2 timer ved romtemperatur (RT) med kontinuerlig risting. Etter vask med 1× tbst i 15 min VED RT, ble membranene inkubert med EN HRP-konjugert geit anti-kanin sekundær Ab (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) i 1 time VED RT. Etter et siste vasketrinn med 1× TBST i 15 min VED RT, ble de immunoreaktive båndene visualisert ved forbedret kjemiluminescens (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ved angitt eksponeringstid («Eksponeringstid For Western blot»). Alle uncropped western blots kan bli funnet I Supplerende Fig. 11.

in vivo prosessering analyse i sebrafisk

Embryoer ble samlet inn fra et laboratorium avl koloni Av Tuebingen sebrafisk plassert på 28 °C på en 14: 10 h lys / mørk syklus og oppvokst under standardbetingelser (Kina Sebrafisk Resource Center). Ksrp mRNA og GFP-Pri-129 WT eller ksrp-binding site mutant mrna ble syntetisert in vitro fra tilsvarende lineariserte plasmider ved hjelp av mMESSAGE mMACHINE Kit (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). KSRP mRNA og GFP-Pri-129_wt mRNA (ELLER GFP-Pri-129_mut mRNA) ble injisert samtidig i sebrafiskembryoer med en celle. Embryoene ble iscenesatt ved 28 °C i henhold til h.p. f.og morfologiske kriterier52. Bilder av embryoer iscenesatt ved 4 h.p. f. og 24 h.p. f. ble kjøpt ved Hjelp Av En Zeiss SteReo Lumar V12 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland).

in vivo prosesseringsanalyse i 293tn-celler

293tn-celler ble dyrket i 6-brønnplater i 24 timer til de nådde ≈70-80% sammenløp. Cellene ble samtidig transfisert MED EGFP fusion Pri-129_wt eller mutant Pri-129 plasmider, pcDNA4-RFP og pCMV-KSRP plasmid Ved Bruk Av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tjuefire timer senere ble cellene analysert under Et Zeiss Fluorescensmikroskop ved 400× forstørrelse (Carl Zeiss Microscopy GmbH). RNA ble også ekstrahert for en qPCR-analyse av prosesseringseffektivitet ved å oppdage den primære miR-129 vs. den modne miR-129. Fluorescensintensiteten ble kvantifisert ved Hjelp Av Image-Pro Plus 6.0-programvare (Media Cybernetics, Rockville, MD).

in situ nærhet ligation assay

in situ PLAs ble gjort etter produksjon protokoll (Sigma-Aldrich). Kaninanti-Drosha (ab12286, Abcam; 1 : 50) og kaninanti-DGCR8 (ab191875, Abcam; 1:50) ble paret med anti-KSRP (MBS246006, Mybiosource, Vancouver, Canada; 1: 50), eller vanlig kanin IgG polyclonal antistoff (12-370, Merck Millipore, Tyskland; 1:50) for de primære antistoffene. Anti-KSRP Og normal kanin IgG polyclonal antistoff som en negativ kontroll. Før blokkering ble 293t-eller HeLa-celler dyrket på kammerede lysbilder (Sigma), festet i 10% formaldehyd, permeabilisert med 0,25% Triton X-100-PBS. Cellene ble analysert Av Zeiss LSM780 confocal immunofluorescence mikroskopi (Zeiss, Tyskland) etterfulgt av deconvolution Med Huygens Essential version 16.05(Scientific Volume Imaging, Nederland, http://svi.nl). PLA punkter per celle ble kvantifisert Med BlobFinder V3. 2 bildeanalyseprogramvare (Uppsala Universitet, Stockholm, Sverige) og gjennomsnittlig ANTALL PLA punkter per celle ble beregnet ved å analysere minst 100 celler.

Bioinformatikk analyse

Alle sammenkoblede-end leser ble trimmet for adaptersekvens Ved Hjelp Av Trim Galore (Versjon 0.3.7) med parametere «-q 25 –stringens 5 –lengde 50 –paired –phred33» og filtrert for lav kvalitet sekvens. Hg38 reference genome (GRCh38) og gene annotation file (GTF format) ble lastet ned FRA GENCODE Release 24 (http://www.gencodegenes.org/) 53. TopHat54, 55 (Versjon 2.1.0) ble brukt til å justere de filtrerte lesingene til hg38-genomreferansegenomet med standardinnstillinger, og FPKMs (Fragmenter Per Kilobase transkriptom per million leser) ble oppnådd ved Bruk Av Cufflinks54 (Versjon 2.2.1) med standardparametere. Ekspresjonsnivåer ble estimert ved hjelp av funksjonstall56 (Versjon 1.5.0) med parametere «-T 7-primær», gennivå raw-teller ble avledet fra summen av de tilsvarende verdiene for alle isoformer av et gen.

EBSeq-HMM18 ble brukt til å analysere forskjellene i genuttrykk mellom henholdsvis tre stadier av monocytt-og granulocyttdifferensiering. Det er to hovedtrinn For EBSeq-HMM å få differensielt uttrykte (de) gener:

1. 1)

   Påvisning av de-gener som viste signifikant endring mellom to stadier under en mål falsk oppdagelsesrate (FDR) på 0,05.

2. 2)

   Gruppering av gener i uttrykksbaner med maksimal bakre sannsynlighet (PP) større enn 0,5.

Ved Å bruke EBSeq-HMM oppnådde vi DE gener og tilhørende uttrykksveier (dvs. «Opp-Ned») ved dag 5, 10 og 15 av monocytt (eller granulocytt) differensiering (Supplerende Data 1). Uttrykket banen» Opp-Ned » representerer at et gen var opp-regulert på dag 10 sammenlignet med dag 5 mens nedregulert på dag 15 sammenlignet med dag 10. Monotont økte («Up-Up») eller reduserte («Down-Down») gener, under monocyt (eller granulocyt) differensiering ble valgt for videre analyse.

genuttrykksnivåene ble estimert ved BRUK AV FPKM, og alle genene MED FPKM ≥ 1 som de uttrykte genene ble brukt til videre analyse. Informasjon OM RBP ble lastet ned fra rbpdb19 og ATtRACT20 databaser. Vi utviklet Et r-skript (Supplerende Data 8) til klassifiserte de gener med» Up-Up «eller» Down-Down » uttrykksbaner (Supplerende Data 2, 3) i forskjellige uttrykksmønstre.

varmekartene ble tegnet ved å bruke funksjonen ‘pheatmap’ av r-pakker ‘pheatmap’ og Venndiagrammet ble tegnet ved å bruke funksjonen ‘draw.parvis.venn ‘av r-pakken ‘VennDiagram’. K-betyr clustering ble utført med utgangen av funksjonen ‘pheatmap’ og klynger ble oppnådd med funksjonen ‘cutree’ ved hjelp Av R.

Plasmid electrotransfections

vi brukte Neon Transfection System i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, CA) for å forbedre plasmidtransfeksjon effektivitet I THP-1 celler FOR rna-seq analyse. Cellene ble elektrotransfisert med plasmider (pEGFP, psih-H1-sh-luc, pEGFP-KSRP eller pSIH-H1-SH-KSRP). Elektroporasjonsparametrene for 1 × 107 THP-1-eller NB4-celler var en 1350-v-puls, 10-ms-pulsbredde og 4-pulser ved bruk av en 10-µ. Førtiåtte timer senere ble elektrotransfeksjonseffektiviteten detektert Ved Western blotting eller qPCR.

Rescue assays

for å validere AT KSRP fremmer pri-miR-129-behandling for å regulere myeloid linjedifferensiering, ble thp-1-celler transfisert med pEGFP-KSRP ved Bruk Av Lipofektamin 2000, og 24 timer senere ble cellene transfisert med en mir-129-hemmer. NB4-celler ble transfisert med si-KSRP ved en endelig konsentrasjon på 100 nM Ved Bruk Av DharmFECT1, og 24 h senere ble cellene transfisert med en miR-129 mimic. FOR å validere AT MIR-129 mål RUNX1 for å regulere myeloid avstamning differensiering, thp-1 og NB4 celler ble transfisert med si-RUNX1 og en mir-129 hemmer eller deres kontroller Av Neon transfeksjon system. Cellene ble deretter stimulert MED PMA eller ATRA i ytterligere 48 timer før de ble høstet for senere analyser. CD14-uttrykk I THP – 1-celler som gjennomgår monocytisk differensiering og CD11b-uttrykk i NB4-celler som gjennomgår granulocytisk differensiering, ble analysert ved flowcytometri.

Eksponeringstid For Western blot

Det Meste Av Western blot ble utviklet Av Tanon 5200 automatic digital gel image analysis system (Tanon, Shanghai, Kina), og eksponeringstiden FOR GAPDH er 150-350 ms. I Fig. 2a, eksponeringstid for prøver langs monocytisk differensiering er 20 s FOR KSRP; eksponeringstid for prøver langs granulocytisk differensiering er 200 ms FOR KSRP. I Fig. 2b, eksponeringstid er 20 s FOR KSRP. I Fig. 4f-h, eksponeringstid er 60 s FOR KSRP. I Fig. 5b, eksponeringstid er 60 s For Drosha, DGCR8 OG KSRP. I Fig. 6j, k, eksponeringstid er 90 s FOR RUNX1. I Fig. 7g, eksponeringstid er 90 s FOR RUNX1 OG KSRP. I Fig. 7h, eksponeringstid er 30 s FOR RUNX1 OG KSRP. I Tillegg Fig. 2a, eksponeringstid for prøver langs monocytisk differensiering er 3 s FOR KSRP; eksponeringstid for prøver langs granulocytisk differensiering er 300 ms FOR KSRP. I Tillegg Fig. 4a, e, f, eksponeringstid er 60 s FOR KSRP. I Tillegg Fig. 7m, eksponeringstid er 10 s og 90 s FOR RUNX1 I THP-1 OG NB4, respevtively. I Tillegg Fig. 8a, eksponeringstid er 60 s FOR RUNX1.

for andre bilder som viser resultatet av manuell eksponering (Fig . 2d, I; Supplerende Fig. 7n), eksponeringstid FOR GAPDH er for estimert 1 s.I Fig. 2d, eksponeringstid er 30 s FOR KSRP i pma-induserte prøver og 10 s FOR KSRP i ATRA-induserte prøver. I Fig. 2i, eksponeringstid er 60 s FOR KSRP. I Tillegg Fig. 7n, eksponeringstid er 90 s FOR RUNX1.

Isolering av monocytter og nøytrofiler fra perifert blod

Informert samtykke ble innhentet i samsvar Med Institutional Review Board Of The Chinese Academy Of Medical Science. Humane monocytter og nøytrofiler ble isolert fra perifert blod av friske givere i 3% dekstran og ble isolert ved perkollgradientsentrifugering etterfulgt av rensing av CD14 Mikroperler (130-050-201, Miltenyl Biotec, Bergisch-Glad-bach, Tyskland) eller EasySep Human Neutrofile Enrichment Kit (#19257, Stemcell Technologies, Canada). Etter sortert ETTER CD14 mikroperler ble DE oppnådde CD14-positive cellene belagt i t-25-kolber og dyrket i 4-6 timer ved 37 °C til de adherente monocyttene ble samlet ved skraping.

Statistisk analyse

for alle studier er n per gruppe som angitt i figurlegenden. Alle data ble analysert ved Hjelp Av GraphPad Prism 5.0 programvare (GraphPad Software, Inc., USA) og presentert som betyr ± SD. Forskjeller mellom eksperimentelle grupper og kontrollgrupper ble analysert ved hjelp Av to-tailed Studentens t-test. Statistisk signifikans ble akseptert ved p < 0,05. Ingen statistiske metoder ble brukt for å forhåndsbestemme utvalgsstørrelse. Alle eksperimenter ble utført med minst tre biologiske replikater. Vi valgte de riktige testene i henhold til datafordelingene. Forsøkene ble ikke randomisert, og vi utelukket ikke noen prøver. Forskerne var ikke blinde for allokering under eksperimenter og utfallsvurdering.

Datatilgjengelighet

miRNA-og pri-miR-rna-sekvenseringsdata er deponert i geo-databasen under tiltredelseskode GSE87318. Dataene for mrna-sekvensering er også deponert I GEO-databasen under tiltredelseskode GSE87088. Kildedata For Fig. 1c-e er gitt Som Supplerende Data 1-4. Kildedata For Fig. 2b, c er gitt Som Supplerende Data 5, 6. Alle andre data som støtter funnene i denne studien er tilgjengelige fra den tilsvarende forfatteren på forespørsel.