’ + dokumentti.otsikko + ”

tulokset ja keskustelu

olemme monistaneet mitokondrioiden sytokromi b-geenien 307 bp: n fragmentin Euraasian saukoista Lutra lutra (Latvia), L. lutra (Kiina), L. lutra (Eurooppa) ja L. lutra (Asahikawa), aasialaisesta pikkukynsisaukosta Aonyx cinerea sekä näädistä Mustela sibirica ja Mustela itatsi, subklonoivat monistetut tuotteet vuonna puc18 ja määritti niiden sekvenssit. L. lutra (Eurooppa) ja L. lutra (Asahikawa) olivat täysin samaa mieltä l lutran (Kiina) ja L. lutran (Latvia) kanssa. Mustela itatsin kahden yksilön sekvenssit olivat identtiset, mutta kolmessa eri asennossa kuin äskettäin (Masuda ja Yoshida, 1994), sekvenssipaikoissa 1-224 (KS. 1).

toisaalta Lutra Nipponin sytokromi B-geenin DNA-fragmenttia yritettiin monistella erilaisilla 10-50 vuotta vanhoilla näytteillä, kuten formaliiniin säilötyistä maksasta, sydämestä ja ihosta, parkitusta nahasta ja täytetyn yksilön karvoista, mutta kaikki yritykset epäonnistuivat.

olemme onnistuneet vahvistamaan mitokondrioiden sytokromi b-geenin 224 bp: n fragmentin Lutra Nipponin 30-vuotiaasta muumion kaltaisesta näytteestä Ehimestä (Kuva. 1). Monistettujen tuotteiden suora sekvensointi viittasi siihen, että sekvenssejä on enemmän kuin kaksi. Siksi tuotteet aliklonoitiin pUC18: aan ja 30 kloonia sekvensoitiin. Niistä yhdeksän kloonia tunnistettiin epäselvästi Lutra Nipponin mitokondrio-B-sekvenssiksi, koska sekvenssi oli ilmeisesti samanlainen kuin muiden Lutra-lajien mitokondriosekvenssit, joista kahdeksalla kloonilla oli sama nukleotidisekvenssi (jota edusti sekvenssi L. nippon (Ehime) – C4 viikuna. 1) mutta loput (sekvenssi L. nippon (Ehime)-C5 Kuvassa. 1) oli erilainen kahdessa asennossa (21: C→T ja 92: T→A). Yhdellätoista kloonilla oli sytokromi b: n kaltaiset sekvenssit alla kuvatulla tavalla. Lopuilla 10 kloonilla oli yllättäen lähes identtinen sekvenssi sian sytokromi b-sekvenssin kanssa, mikä viittaa siihen, että muumion kaltaisen näytteen varastoinnissa tapahtui vakava DNA-kontaminaatio.

selvisi, että muumiomaisen Lutra Nipponin (Ehime) DNA sisältää sytokromi b: n kaltaisen sekvenssin. Yllättäen kaikki Kochin toisen Lutra Nipponin (ainakin 30-vuotias täytetty yksilö) monistetut tuotteet vastasivat sytokromi b: n kaltaisia sekvenssejä, eikä mitokondrioiden sytokromi b: n fragmenttia monistettu. Lisäksi 307 bp: n sytokromi-B: n kaltaiset fragmentit monistettiin 30-40% kloonien kokonaismäärästä Euraasialaisen Saukon L. lutran (Eurooppa ja Asahikawa) tuoreesta maksasta tai karvoista valmistetusta DNAs: stä, mutta ei l lutran (Latvia ja Kiina) DNAs: stä. Sytokromi b: n kaltaisen sekvenssin esiintyminen ei siis ole artefakti DNA: n pitkän säilytyksen aikana. Sytokromi b: n kaltaista sekvenssiä esiintyy myös jyrsijän ydin-DNA: ssa (Smith ym., 1992). Lutran sytokromi b: n kaltaisille sekvensseille on ominaista deleetio, joka aiheuttaa lukukehyksensiirron ja päättymiskodonit (Fig. 1), läsnäolo useita eri sekvenssien pieniä muunnelmia (Kuva. 1), ja ilmeisesti nopeamman evoluutionopeuden verrattuna mitokondrioiden sytokromi b-sekvenssiin (KS. 2). Näin sytokromi b: n kaltainen sekvenssi ei näytä toimivan ja esiintyy pseudomuotona. Emme ole tutkineet, onko Lutran sytokromi b: n kaltaista sekvenssiä mitokondrion DNA: ssa vai ydin-DNA: ssa.

Lutra Nipponin mitokondrioiden sytokromi b: n ja sytokromi b: n kaltaisten geenien nukleotidisekvenssit ovat linjassa L. lutran (Latvia, Kiina, Eurooppa ja Asahikawa), Aonyx cinerean, Mustela sibirican ja Mustela itatsin, Fig: n kanssa. 1. Sekvensseistä 1-224 Lutra nippon (C4) poikkesi L lutran (Latvia) nukleotideista 9 ja L. lutran (Kiina) nukleotideista 7, jotka kaikki sijaitsivat kodonin kolmannessa asennossa ja tunnistettiin siirtymäeroiksi A↔G tai C↔T. Lutra lutran sisällä ero oli 4 nukleotidia. Nämä nukleotidisubstituutiot eivät korvaa aminohappoja. Toisaalta tällä alueella on 6 nukleotidieroa kahdesta kongeneerisesta näädästä Mustela sibiricasta ja Mustela itatsista. Täten Lutra Nipponin ja Lutra lutran (7-9 nukleotidia: keskimäärin 3,6%) sekvenssiero on suurempi kuin kahden Mustela-lajin (6 nukleotidia). Tämä on myös sopusoinnussa sen ajatuksen kanssa, että Mustelidae-heimon lajeilla sytokromi b-geenin sekvenssin yli 3,5 prosentin ero voi vastata eri lajien eroa (Masuda ja Yoshida, 1994). Nukleotidisekvenssien prosentuaalinen ero on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1.

prosentuaalinen ero Kuvassa esitettyjen nukleotidisekvenssien (224 bp) välillä. 1

kuvassa 2 on fylogeneettinen puu, joka on rakennettu tässä tutkimuksessa saaduista Sekvenssitiedoista Phylip-paketin versiossa 3.5 c (Felsenstein, 1993). Sama topologia rekonstruoitiin Fitchin ja Margoliashin menetelmällä (Felsenstein, 1993). Sekvenssit jaettiin kahteen pääryhmään, joista toinen on mitokondrioiden sytokromi b-geeneille ja toinen sytokromi b: n kaltaisille sekvensseille. Kuten edellä todettiin, sytokromi b: n kaltaiset sekvenssit monistettiin Lutra Nipponin (2 yksilöä, Kochi ja Ehime), L. lutran (Eurooppa) ja L. lutran (Asahikawa) DNAs: ista. Kahden Lutra-lajin sytokromi b: n kaltaisten jaksojen haarautuminen oli sama kuin mitokondrioiden sytokromi b-geeneissä, mutta sytokromi b: n kaltaisten jaksojen evoluutionopeus oli vähintään kaksi kertaa nopeampi, mikä oli sopusoinnussa pseudogeenien yleisten ominaisuuksien kanssa. Puu osoittaa myös selvästi, että Lutra Nipponin ja Lutra lutran välillä on suuri geneettinen ero, ja tämä tulos on yhdenmukainen viimeaikaisen morfologisen tutkimuksen kanssa, jonka mukaan japaninjokisaukko ei ole euraasialaisen Saukon alalaji Lutra lutra, vaan erillinen laji, Lutra nippon (Imaizumi and Yoshiyuki, 1989). Jotta näiden kahden lajin fylogeneettiselle yhteydelle saataisiin kuitenkin pitempi DNA-sekvenssi Lutra nippon on määritettävä. Näin tehtäisiin, kun saadaan tuore näyte Japaninjokisaukkosta.