‘ + dokument.title + ‘

RESULTATER og DISKUSJON

Vi har forsterket det 307 bp-fragmentet av mitokondrielle cytokrom b-gener fra De Eurasiske oterne Lutra lutra (Latvia), L. lutra (Kina), L lutra (Europa) Og L. lutra (Asahikawa), Den Asiatiske småklode oteren Aonyx cinerea og røyskatt Mustela sibirica Og Mustela itatsi, subklonert de forsterkede produktene i puc18 og bestemte sine sekvenser. Sekvensene Av L. lutra (Europa) og L. lutra (Asahikawa) var helt enige med Henholdsvis l lutra (Kina) og L lutra (Latvia). Sekvensene til To Individer Av Mustela itatsi var identiske, men forskjellige i tre stillinger fra det som nylig ble rapportert (Masuda og Yoshida, 1994), i sekvensposisjonene 1-224 (Se Fig. 1).

På den annen side ble det gjort mange forsøk på å forsterke DNA-fragmentet av cytokrom b-genet Av Lutra Nippon ved hjelp av forskjellige 10-50 år gamle prøver, som lever, hjerte og hud bevart i formalin, det solbrune læret og hårene på utstoppede prøven, men alle forsøk mislyktes.

vi har lyktes i å forsterke 224 bp fragment av mitokondrie cytokrom b-genet fra en 30 år gammel mumie-lignende prøve Av Lutra nippon Fra Ehime (Fig . 1). Direkte sekvensering av de forsterkede produktene foreslo tilstedeværelsen av mer enn to typer sekvens. Derfor ble produktene subklonert i pUC18 og 30 kloner ble sekvensert. Blant dem ble ni kloner tvetydig identifisert for å være den mitokondrielle cytokrom b-sekvensen Av Lutra nippon siden sekvensen tilsynelatende var lik mitokondrielle sekvenser fra andre Lutra-arter, hvorav åtte kloner hadde samme nukleotidsekvens (representert ved sekvensen Av L. Nippon (Ehime) – c4 I Fig. 1) men den gjenværende (sekvensen Av L. Nippon (Ehime) – C5 I Fig. 1) var forskjellig i to posisjoner(21: C→T og 92: T→A). De elleve klonene hadde cytokrom b – lignende sekvenser som beskrevet nedenfor. De resterende 10 kloner, uventet, hadde nesten identisk sekvens til gris cytokrom b-sekvens, noe som tyder på noen alvorlig DNA-forurensning skjedde under lagring av mumien-lignende prøven.

Vi fant AT DNA fra en mumielignende Lutra Nippon (Ehime) inneholder en cytokrom b – lignende sekvens. Overraskende nok korresponderte alle de forsterkede produktene fra en Annen Lutra nippon Fra Kochi (minst 30 år gammel utstoppet prøve) til cytokrom b-lignende sekvenser, og ingen mitokondriell cytokrom b-fragment ble forsterket. I tillegg ble cytokrom b-lignende fragmenter på 307 bp forsterket, med et utbytte på 30-40% av de totale klonene, Fra Dnaene fremstilt fra den friske leveren Eller hårene Til De Eurasiske oter L. lutra (Europa Og Asahikawa), men ikke Fra Dnaene Fra l lutra(Latvia og Kina). Dermed er tilstedeværelsen av cytokrom b-lignende sekvens ikke en artefakt under lang lagring AV DNA. Den cytokrom b – lignende sekvens er også funnet i den kjernefysiske DNA i en gnager (Smith et al., 1992). Cytokrom b – lignende sekvenser Av Lutra er preget av tilstedeværelsen av en sletting for å forårsake en leseramme skift og termineringskodoner (Fig. 1), ved tilstedeværelsen av flere typer sekvenser med mindre variasjoner (Fig. 1), og ved den tilsynelatende raskere evolusjonære hastigheten sammenlignet med mitokondriell cytokrom b-sekvens (Se Fig. 2). Dermed synes cytokrom b – lignende sekvens ikke å fungere og er tilstede som en pseudo-form. Vi har ikke undersøkt om cytokrom b – lignende sekvens Av Lutra er tilstede i mitokondrielt DNA eller i nukleært DNA.

nukleotidsekvensene av mitokondrielle cytokrom b og cytokrom b-lignende gener Av Lutra nippon er justert med L. lutra (Latvia, Kina, Europa Og Asahikawa), Aonyx cinerea, Mustela sibirica og Mustela itatsi, I Fig. 1. Av sekvensen 1 til 224 var Lutra nippon (C4) forskjellig fra l lutra (Latvia) og L. lutra (Kina) i henholdsvis 9 og 7 nukleotider, som alle var lokalisert i tredje posisjon av et kodon Og identifisert Som overgangsforskjeller En↔G Eller C↔T. forskjellen Innen Lutra lutra var 4 nukleotider. Disse nukleotidsubstitusjonene forårsaker ingen aminosyreutskifting. På den annen side er det 6 nukleotider forskjell i De to congeneric weasels Mustela sibirica Og Mustela itatsi i denne regionen. Dermed er sekvensforskjellen Mellom Lutra nippon Og Lutra lutra (7-9 nukleotider: 3,6% i gjennomsnitt) større enn det (6 nukleotider) mellom De To Mustela-artene. Dette er også i samsvar med ideen Om At I Mustelidae-arten kan mer enn 3,5% forskjell i sekvens av cytokrom b-gen tilsvare forskjellen mellom forskjellige arter (Masuda og Yoshida, 1994). Prosentdifferansen mellom nukleotidsekvensene er vist I Tabell 1.

Tabell 1.

Prosentforskjell mellom nukleotidsekvensene (224 bp) vist I Fig. 1

Figur 2 viser et fylogenetisk tre konstruert fra sekvensdataene oppnådd i denne studien Med Nabo-Sammenføyningsmetoden i PHYLIP-pakkeversjonen 3.5 c (Felsenstein, 1993). Den samme topologien ble rekonstruert Med Fitch og Margoliash-metoden (Felsenstein, 1993). Sekvensene ble delt inn i to hovedklynger, en er for mitokondrielle cytokrom b-gener og den andre for cytokrom b-lignende sekvenser. Som nevnt ovenfor ble cytokrom b-lignende sekvenser forsterket Fra Dnaene Til Lutra nippon (2 personer, Fra Kochi Og Ehime), L. lutra (Europa) Og L. lutra (Asahikawa). Forgreningsmønsteret til cytokrom b-lignende sekvenser av De To Lutra-artene var det samme som i mitokondrielle cytokrom b-gener, men evolusjonsraten for cytokrom b-lignende sekvenser var minst to ganger raskere, i samsvar med de generelle egenskapene til pseudo-gener. Treet viser også tydelig at Det er en stor genetisk forskjell Mellom Lutra nippon og Lutra lutra, og dette resultatet er i samsvar med den nylige morfologiske studien at Den Japanske elveotteren ikke er en underart av Den Eurasiske otteren Lutra lutra, men en distinkt art, Lutra nippon (Imaizumi og Yoshiyuki, 1989). For å få et avgjørende bevis for det fylogenetiske forholdet mellom de to artene, må imidlertid lengre DNA-sekvens Av Lutra nippon bestemmes. Dette ville bli gjort når den friske prøven Av Den Japanske elven otter ble oppnådd.